PLoS ONE: DNA Methylering i Exon en region og Kompleks forordning af Twist1 Expression i Gastric Cancer Cells

Abstrakte

Twist1 overekspression ofte observeres i forskellige kræftformer, herunder gastrisk cancer (GC). Selvom DNA methylering af

Twist1

gen er blevet rapporteret i kræftceller, mekanismerne bag transkriptionel aktivering fortsat usikre. I denne undersøgelse, vi først undersøgt epigenetiske ændringer af

Twist1

bruge

Twist1

transskription-positive og ekskluderet cellelinjer, der er afledt af vores etablerede diffus type GC musemodel. Behandling med en DNA-demethylering agent 5-aza-dC re-aktiveret Twist1 udtryk i Twist1 udtryk-negative GC celler. Ifølge methyleringsspecifik PCR og bisulfit sekventeringsanalyse, methylering ved CpG-rige region i

Twist1

kodende exon 1, snarere end dens promotorregion, blev tæt forbundet med transkriptionel inaktivering af

Twist1

ekspression i muse GC-celler. Kromatin immunopræcipitationsanalyser afslørede, at aktiv histon-mærket H3K4me3 blev beriget i Twist1 ekspression-positive celler, og inaktive histon-mærket H3K9me3 blev beriget i Twist1 ekspression-negative celler. Ekspressionsniveauerne af

Suv39h1

og

Suv39h2

, histon metyltransferaser for H3K9me3, blev omvendt korreleret med

Twist1

udtryk, og knockdown af

Suv39h1

eller

Suv39h2

induceret

Twist1

udtryk. Desuden Sp1 transkriptionsfaktor bundet til exon 1 CpG-rig region i Twist1 ekspressions-positive cellelinier, og

Twist1

ekspression blev formindsket med mithramycin, som der forstyrrer Sp1-binding til CpG-rige regulatoriske sekvenser. Vores undersøgelser tydede på, at

Twist1

transskription i GC celler kan reguleres gennem potentielt samarbejde af DNA methylering, histon modifikation i kompleks med SP1 binding til CpG-rige regioner i exon 1 region.

Henvisning: Sakamoto A, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA-methylering i Exon en region og Kompleks forordning af Twist1 Expression i Gastric Cancer Cells. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10,1371 /journal.pone.0145630

Redaktør: Tae-Young Roh, Pohang Universitet for Videnskab og Teknologi (POSTECH), Republikken Korea

Modtaget: 21 september, 2015; Accepteret: December 6, 2015; Udgivet: 22 December, 2015

Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) (24.590.444) og (A) (25.253.081), og A3 Foresight Program (AA005) fra Japan Society for fremme af Science (JSP’er), og den praktiske Forskning for Innovative Cancer Kontrol (15Ack0106017h0002) fra Japan Agentur for medicinsk forskning og udvikling, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser:. BS, bisulfit sekventering; CGI, CpG ø; Chip, kromatin immunpræcipitation; DCKO, dobbelt betinget knockout mus; DGC, diffus type mavekræft; GAPDH, glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase; GC, gastrisk cancer; H3K4me3, histon H3 lysin 4 tri-methylering; H3K9me3, histon H3 lysin 9 tri-methylering; H3K27me3, histon H3 lysin 27 tri-methylering; MSP, methyleringsspecifik polymerasekædereaktion; RT-PCR, revers transkription-polymerasekædereaktion; QRT-PCR, kvantitativ RT-PCR; GTS, tumorsuppressorgener; TSS, afskrift startstedet; 5-aza-dC, 5-aza-2′-deoxycitidine

Introduktion

Twist1, som en grundlæggende helix-loop-helix transskription faktor, binder direkte til E-box elementer (NCANNTGN ) på specifikke målgener [1]. Twist1 er almindeligt kendt for at være essentiel for mesoderm dannelse i den tidlige fosterudvikling af drosophila og mus [2, 3]. I humane cancere, er ektopisk Twist1 ekspression rapporteret at være associeret med malign progression, invasion, epithelial-til-mechencymal overgang, metastase og stemness, hvilket indikerer potentielle onkogene funktioner Twist1 [4-6]. Således er det meget vigtigt at klarlægge de transkriptionelle regulatoriske mekanismer for Twist1 i kræftceller.

Epigenetisk ændringer, såsom DNA-methylering og histon modifikation, er tæt knyttet til gen-silencing [7-9]. Selvom epigenetiske ændringer på CGI (CpG island) promotorregionen af ​​tumorsuppressorgener (GTS) er velkendte for at være forbundet med deres geninaktivering [10], er mekanismerne for epigenetisk regulering af onkogener dårligt forstået. Flere grupper har vist, at

Twist1

blev re-aktiveret ved behandling med en de-methylering lægemiddel, 5-aza-2′-deoxycitidine (5-aza-dC), i cancerceller [11, 12]. Afvigende DNA methylering på CGI promotor i menneskelig

Twist1

er ofte fundet i primære kræftformer, herunder af mavekræft (GC) [11-14]. Alligevel er der masser af fund at DNA methylering på

Twist1

promoter region er ikke korreleret med ekspression af genet i forskellige kræftformer [12, 14]. Mens

kan Twist1

methylering være et nyttigt biomarkør til at forudsige de kliniske resultater, at tilbagefald og overlevelse hos patienter med kræft [12, 13, 15], er det fortsat kontroversielt, om

Twist1

methylering ved promotorområdet fører til inaktivering af genet.

Transkriptionel regulering af gener er korreleret med lysin (K) mønstre for methylering i histon hale, der består af tre forskellige lysin methylering (mono-, di- og tri-). Tri-methylering af H3K4 (H3K4me3) er relateret til genaktivering, og af H3K9me3 og H3K27me3 til gen undertrykkelse [7-9]. Selv om disse tre histon H3-methyaltion mønstre er knyttet til CGI methylering så godt, de transkriptionelle regulatoriske mekanismer for

Twist1

underliggende histon modifikation er dårligt forstået i kræftceller.

GC er den næsthyppigste dødsårsag af kræft i verden [16]. GC er klassificeret i to store histologiske typer; diffus og tarm, der er to forskellige kræftfremkaldende pathways [17]. Diffuse-typen gastrisk cancer (DGC) er kendt for at vise hyppige invasion og metastase, hvilket resulterer i en dårlig prognose [18]. Tab af E-cadherin og p53 er blevet rapporteret i diffust-typen gastrisk carcinogenese [19-21]. Adskillige rapporter demonstrerede hyppig overekspression af Twist1 i menneskelige DGCs [22, 23].

Vi har tidligere udviklet en dobbelt betinget knockout (DCKO) mus linje som til E-cadherin og p53, som specifikt inaktiveret i maven [ ,,,0],19]. Alle DCKO mus udviklede fatale DGCs inden for et år, de fænotyper være af høj invasionsevne og hyppig metastaser til lymfeknuder. Det er bemærkelsesværdigt, at genekspressionsmønstre af DGCs i DCKO mus fundet på microarray analyse var meget lig dem af humane andre end intestinale dem primære DGCs. Vores DCKO muse-modellen er således et stærkt værktøj til at undersøge betydningen af ​​genfunktion i DGC carcinogenese og til udvikling af en terapeutisk strategi. I denne undersøgelse, vi etablerede Twist1 udtryk-positive og -negative DGC cellelinjer, der er afledt fra DCKO mus. Som en konsekvens af analyse af de epigenetiske ændringer, blev den fælles mekanisme for

Twist1

belyst, og evalueret i både murine og humane DGCs i denne undersøgelse.

Materialer og Metoder

Etik Statement

Alle

in vivo

procedurer blev godkendt af Animal Care udvalg for Tokyo Medicinsk og Dental University (Tilladelse nr 0160073A). Som for normale humane gastriske slimhinder prøver blev skriftligt informeret samtykke indhentet fra alle fag, og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Tokyo Medicinsk og Dental University (No.1115).

Cell kulturer og vævsprøver

Vi har tidligere etableret en E-cadherin /p53 DCKO (

Atp4b-Cre

+

;

CDH1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

) musemodel [19]. Fra sin de ondartede væv, vi etableret fem mus DGC cellelinjer og navngivet dem MDGCs (Shimada S, upubliceret observation). MDGC-1 og MDGC-3-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende høj glucose suppleret med 10% føtalt bovint serum, og MDGC-7, MDGC-8 og MDGC-9 blev dyrket i Hams F12 suppleret med 5% hesteserum. DNA-analyse blev udført for at påvise afkortet

CDH1

Trp53

alleler (S1 Fig). Otte humane GC cellelinier (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 og HSC60) blev også anvendt i denne undersøgelse. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY og KATO-III blev købt fra Riken celle bank (Tsukuba, Japan). NUGC4 og AGS celler blev opnået fra Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) og ATCC (American Type Cell Collection). HSC60 celler blev opnået fra Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokyo, Japan) [24]. KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS og HSC60 celler blev dyrket i RPMI 1640, og GCIY blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium, som begge blev suppleret med 10% føtalt bovint serum. For de-methylering undersøgelser, murine og humane GC-celler blev behandlet dagligt med 500 nM 5-aza-deoxycytidin (5-aza-dC, Sigma; # A3656) i 72 timer. Vi behandlede disse GC celler med 100 nM Trichostatin A (TSA, Wako; # 200 til 11.993) i 24 timer eller 100 nM mithramycin A (Wako; # 132 til 17.101) i 24 timer

Atten primære GC væv og tilsvarende. ikke-kræft gastriske slimhinder blev opnået fra 15 DCKO mus. Som for humane mave væv, brugte vi tre ikke-kræft gastrisk slimhinder fra GC patienter. Vi opnåede også fem normal gastrisk slimhinder fra

Atp4b-Cre

–

;

CDH1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

mus, der blev brugt som negative kontroller i vores tidligere undersøgelse [19]. I denne undersøgelse, vi kaldte “normal gastrisk slimhinder”, hvis prøver blev opnået fra kontrol mus, og “ikke-kræft gastrisk slimhinder”, hvis prøver blev indhentet fra DCKO mus og humane GC patienter i denne undersøgelse.

Reverse transskription (RT) -PCR og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev isoleret med en RNeasy Mini kit (Qiagen; # 74.134) og cDNA blev fremstillet fra RNA under anvendelse af en SuperScript III kit (Invitrogen; # 18080044) ifølge fabrikantens protokoller. Endepunkt RT-PCR udført med flere cyklus numre, 28-35 cyklusser. Som en intern kontrol, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (

GAPDH

) blev forstærket med 21 cyklusser for at sikre cDNA kvalitet og mængde for hver RT-PCR. De forstærkede produkter blev lastet til 2% agarosegeler eller kvantificeres ved kvantitativ RT-PCR med LightCycler DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics; # 04707516001). Amplifikationsprodukterne programmer for PCR blev gentaget i 40 cykler for GAPDH og 45cycles for andre gener med undtagelse af GAPDH. PCR-produkter blev klonet ind i pMD20 T-vektor ved anvendelse af en Mighty TA-kloning (Takara BIO INC; # 6028), og derefter sekventeret direkte. Primersekvenserne og PCR-produktet størrelser er vist i S1 tabel.

methyleringsanalyse

Vi ekstraheret genomisk DNA fra murine og humane GC cellelinier ved phenol-chloroform-metoden, og derefter udført bisulfit modifikation og MSP procedure. Bisulfit behandling af DNA blev udført med EZ DNA-methylering-Gold (Zymo forskning; # D5006), og derefter methylering-specifik PCR (MSP) blev udført. Kort beskrevet blev PCR reaktionen udført i 35 cykler i en 25 pi blanding omfattende bisulfit-modificeret DNA, 2.5μl på 10x PCR buffer, 1,25 pi 25 mM dNTP’er, 25 pmol /l af hver primer og 1 U Jumpstart RedTaq polymerase (Sigma ; # D0563). Betingelserne for PCR var som følger: 95 ° C i 5 minutter; 35 cykler ved 95 ° C i 1 minut, 53 ° C i 2 minutter og 72 ° C for 1,5 minutter; og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 minutter. Som for muse GC væv blev DNA ekstraheret fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) væv. Bisulfit-DNA blev amplificeret med flankerende PCR-primere og derefter indlejret MSP blev udført [25, 26]. De primer sekvenser og PCR produkt størrelser er vist i S2 Tabel

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

Chippen udførtes ved hjælp af en chip-IT Express kit (Aktiv Motiv; # 53.008). ifølge fabrikantens protokol. Immunpræcipiteret DNA berigelse blev normaliseret med hensyn til input. Antistofferne anvendt i denne undersøgelse var anti-histon H3K4me3 (Active Motif; # 39.915), anti-H3K9me3 (Active Motif; # 39.765), anti-H3K27me3 (Active Motif; # 39155), anti-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) , anti-Sp1 (Abcam; # ab13370), og anti-histon H3 (Active Motif; # 39.163) antistoffer. Normalt kanin IgG (Cell Signaling Technology, # 2729s) blev anvendt som en negativ kontrol for chippen. De primer sekvenser og PCR produkt størrelser er vist i S2 tabel.

Knockdown analyse ved hjælp af små interfererende RNA

siRNA-baserede knockdown af

Suv39h1

og

Suv39h2

blev udført under anvendelse af en elektroporation (Neon transfektionssystem, Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. MDGC celler blev transficeret med 50 nM siRNA af Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), eller negativ kontrol siRNA (Mission siRNA Universal Negative Control, Sigma). Efter 48 timer dyrkning blev celler høstet til RT-PCR, Western blot-analyser, migration, invasion og proliferation assay.

Western blot-analyse

GC-celler blev lyseret med Pierce RIPA puffer (Thermo Videnskabelig; # 89900). Proteiner blev separeret på SDS-polyacrylamidgeler og derefter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner, efterfulgt af inkubation med antistoffer opløst i Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 2% skummetmælk og 10% Tween 20. De primære antistoffer anvendt i denne undersøgelsen var monoklonalt muse-anti-Twist1 (1: 100, Santa Cruz Bio-teknologi; # sc-81.417), kanin polyklonalt anti-Sp1 (1: 200, aktive motiv; # 39058), og muse monoklonale anti-α-tubulin ( 1: 200, Santa Cruz; # sc-8035) antistoffer. De sekundære antistoffer var alkalisk phosphatase-konjugeret anti-kanin IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories; # 1.706.518) og anti-muse-IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories, # 1.706.520). Blots blev udviklet med ImmunoStar AP Substrat (Bio-Rad Laboratories; # 1.705.018)

Immunhistokemi

FFPE sektioner (4 uM) blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret i graduerede ethanol-løsninger og derefter Antigen hentning. blev udført i 10 mM citronsyre-buffer ved mikrobølgeopvarmning. Immunhistokemi blev udført ved anvendelse af anti-Twist1 antistoffer (Santa Cruz, 1:20) som tidligere beskrevet [19]. Ekspression af Twist1 blev defineret som positiv nuklear farvning i mere end 10% af cellerne, og intensiteten blev scoret som- (negativ), + (svag) og ++ (moderat til stærk) med tre undersøgere uafhængigt.

Resultater

Twist1 udtryk i murine og humane GC cellelinjer

fra DGC væv af DCKO mus,

Twist1

transskription-positive cellelinier (MDGC-7, MDGC- 8 og MDGC-9) og negative cellelinier (MDGC-1 og MDGC-3) blev etableret (fig 1A og S2A fig), og ekspressionen af ​​Twist1 protein blev bekræftet i hver cellelinje (figur 1B). Twist1 ekspression blev forstærket ved mRNA og protein niveauer i Twist1 ekspressions-negative MDGC celler efter behandling med DNA-demethylering agent 5-aza-dC (Fig 1C og 1D), mens dets ekspression ikke blev ændret efter behandling med histondeacetylaseinhibitoren TSA (S2B fig). I de otte humane GC cellelinjer undersøgt,

Twist1

udtryk blev nedreguleret på fire cellelinjer (Fig 1E, venstre), tre (KATO-III, GCIY og AGS), hvoraf viste re-aktivering af

Twist1

ekspression efter behandling med 5-aza-dC ved RT-PCR (fx fig 1E, højre). Som for

Twist1

udtryk-positive GC cellelinjer, efter 5-aza-dC behandling, 2.1- og 3.2 gange opregulering af

Twist1

blev påvist i MKN45 og MKN7 henholdsvis ved QRT-PCR, mens Twist1 udtryk ikke blev ændret i MDGC-9 celler (fig 1F).

(A) RT-PCR-analyse af

Twist1

mRNA-ekspression i fem mus GC cellelinjer MDGC-1, MDGC-3, MDGC-7, MDGC-8 og MDGC-9) fra DCKO mus. Mus

GAPDH

blev anvendt som en intern kontrol. (B) Ekspression af Twist1 protein i MDGC celler ved Western blot. α-tubulin blev anvendt som en intern kontrol. (C og D) Virkninger af en DNA-demethylering middel i MDGC celler. Efter behandling med 5-aza-dC,

Twist1

ekspression blev opreguleret på mRNA (C) og proteinniveauer (D) i Twist1 ekspressions-negative MDGC-1 og MDGC-3-celler, men ikke i Twist1 ekspressions-positive MDGC-9-celler. M, mock; A, 5-aza-dC. (E) RT-PCR-analyse af

Twist1

mRNA-ekspression i humane GC cellelinjer (KATO-III, GCIY, AGS, MKN74, MKN7, MKN45, NUGC4 og HSC60) (til venstre).

Twist1

udtryk blev opreguleret på mRNA niveau i KATO-III og GCIY celler efter 5-aza-dC behandling (til højre). Menneskelig

GAPDH

blev anvendt som en intern kontrol. (F) QRT-PCR-analyse af

Twist1

mRNA-ekspression i MDGC-9, MKN7 og MKN45 celler med og uden 5-aza-dC behandling (** P 0,01).

CGI methylering og udtryk for

Twist1

i GC cellelinjer

Twist1

har en tæt CGI region fra promotoren til hele exon 1, denne region bliver stærkt konserveret blandt hvirveldyr, herunder mus og menneske (S3 fig). For at tydeliggøre CGI i mus og menneske

Twist1

, vi udførte beregningsmæssige analyse ved hjælp UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/index.html) og MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /), som er meget anvendt som identifikation af CGI og MSP primere [27]. Vi analyserede ca. 1,4 kb region, herunder promotoren og hele exon 1. UCSC Genome Browser på muse og human analyse udviste en CGI i regionen undersøgte (data ikke vist). formodede to CGI steder blev imidlertid påvist, i regionen i både mus og menneske, når vi anvendte kriterierne i CGI med GC-indhold på 50% og observeres /forventet CpG-forhold på 0,8 ved MethPrimer (Fig 2A og 2C). Disse to formodede CGI-områder blev placeret i promotoren og exon 1. Eftersom methylering ved promotorområdet er blevet rapporteret i forskellige humane cancere [12, 14], vi oprindeligt undersøgt status for methylering ved området i murine og humane GC cellelinier af MSP. Men status methylering ved promotor-regionen i

Twist1

ikke svarede til sit udtryk i enhver GC cellelinjer undersøgt (område P1, Fig 2A). For at bestemme de kritisk methylerede regioner forbundet med Twist1 udtryk i MDGC celler, vi yderligere udført MSP på CGI-regionen i exon 1 (E1-1, E1-2 og E1-3), og den forudsagte CpG shore websted ligger cirka 1,6 kb fra TSS (afskrift startstedet, S1) (fig 2A). Som et resultat, CGI methylering ved området (E1-1 og E1-2) omkring TSS

Twist1

exon 1 viste sig at svare til ekspression af genet i MDGC celler, men der var ingen sammenhæng mellem dem på den forudsagte shore region (S1) og enden af ​​exon 1 region (E1-3) (fig 2B, venstre) i MDGC celler. Ingen methylering blev påvist ved eventuelle CpG regioner i tre normal gastrisk slimhinder uden Twist1 udtryk fra

Atp4b-Cre

–

;

CDH1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

mus (Fig 2B). I human gastrisk slimhinder, ingen

Twist1

methylering blev også fundet i tre ikke-kræft gastrisk slimhinder fra GC patienter (Fig 2D), hvoraf den ene viste meget svag

Twist1

udtryk (data ikke vist ). Vi undersøgte også yderligere fire ikke-kræft gastrisk slimhinder fra GC patienter, mens ingen methylering blev påvist ved E1-2 region i sager (data ikke vist). Bisulfit sekventering (BS) viste, at CGI region i exon 1 viste tætte methylering i Twist1 ekspressions-negative MDGC-3-celler, men ikke i Twist1-positive MDGC-9 celler (BS-c, fig 2A og 2B, højre), mens der var ingen forskel i methylering mønstre mellem dem på CpG kysten og promotorområder (BS-a og BS-b, S4A fig). Blandt de menneskelige GC cellelinjer, KATO-III og GCIY uden

Twist1

udtryk viste tætte CGI methylering på området af exon 1 (E1-2), som er i overensstemmelse med dem af mus

Twist1

(fig 2C og 2D, venstre). Både methylering og unmethylation i E1-2-regionen blev detekteret i MKN7 og MKN45 celler ved MSP og bisulfit sekventering (fig 2D), som er basalt udtrykt Twist1 men deres ekspressionsniveauer blev forøget efter 5-aza-dC behandling (Fig 1F). Således indikerer vore data, at methylering i exon 1 region

Twist1

påvist i denne undersøgelse er korreleret til dets ekspression.

(A) Skematisk repræsentation af den genomiske struktur og den forudsagte CGI med MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/) af musen

Twist1

gen. To CGI’er (tynde blå regioner, venstre, -358 til -149, højre, -96 til 759), blev observeret i regionen fra initiativtageren til hele exon 1 (Obs /Exp = 0,8,% GC 50%). Det bøjede pil angiver transkriptionsstartstedet (TSS). Individuelle CpG steder er angivet som orange lodrette linjer. Kasserne angiver exon. De sorte dobbelt-ledes pile angiver regionerne (S1, P1, E1-1, E1-2 og E1-3) undersøgt af methylering specifik PCR (MSP). De blå dobbelt-ledes pile angiver de undersøgte af Chip assay regioner. De røde søjler angiver de undersøgte ved bisulfit sekventering (BS) regioner. (B) MSP analyse af MDGC cellelinjer og tre normal gastrisk slimhinder fra

Atp4b-Cre

–

;

CDH1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

mus i de fem regioner (til venstre). U: methylerede alleler; M: methylerede alleler. BS i regionen 322-670 (BS-c) i MDGC-3 og MDGC-9 (højre). BS-a og BS-b er vist i S3 Fig. Den MSP-regionen i E1-2 og BS-c svarer til

Twist1

udtryk. Sorte cirkler repræsenterer methylerede CpG stedet; hvide cirkler repræsenterer ikke-methylerede CpG-steder. (C) Skematisk afbildning af den genomiske struktur og den forudsagte CGI med MethPrimer af den humane

Twist1

gen. To CGI’er (venstre, -369 til -138, højre, 91-742) blev observeret (Obs /Exp = 0,8,% GC 50%). (D) MSP og BS analyser af humane GC cellelinjer og tre ikke-kræft gastrisk slimhinder fra GC patienter. Vi vurderede fire regioner (venstre, P1, E1-1, E1-2 og E1-3) og exon 1 (højre, 315 til 651, BS-c) i den menneskelige

Twist 1

gen, som er placeret analogt med muse MSP og BS regioner. Tætte methylering blev påvist i KATO-III celler mangler

Twist1

udtryk, mens MKN45 celler, der udtrykker

Twist1

udstillet både methylerede og umethylerede alleler.

Twist1

methylering og udtryk i DCKO mus GC vævsprøver

Vi undersøgte status methylering af

Twist1

hjælp 18 primære GC væv fra 15 DCKO mus. Fordi GC regioner var meget små og deres DNA fra FFPE prøver viste lave koncentrationer, udførte vi nested MSP [25, 26].

Twist1

var signifikant methylerede (9/18, 50%) i primære GCS sammenlignet med tilsvarende ikke-kræft væv (1/10, 10%), at være statistisk signifikant forskel (P 0,05, tabel 1). Repræsentative data fra MSP er vist i fig 3A. Blandt dem, 4 af 10 (40%) tilfælde var intramucosal og fem af 8 (62,5%) var invasive GC’er (tabel 1). I denne undersøgelse

Twist1

methylering positive tilfælde demonstrerede methylerede MSP bands samt, som følge af tilstedeværelsen af ​​normale stromale /fibroblast og inflammatoriske celler i kræft vævssnit, selvom vi ikke kunne benægte muligheden for delvis methylering ligesom MKN45 og MKN7 og tumor heterogenitet.

(a) Repræsentative resultater af indlejret MSP analyse af

Twist1

i DGCs fra DCKO mus og en tilsvarende ikke-kræft maveslimhinden (bane N). Regionerne (E1-2) analyserede er vist i fig 2A. U: umethyleret allel; M: methylerede allel. (B) repræsentant immunhistokemisk farvning af Twist1 protein i DGC væv fra DCKO mus. (I) Kraftig nuklear farvning af Twist1 protein i en GC uden methylering. (Ii) Negativ Twist1 proteinekspression i en gaskromatograf med methylering. Original forstørrelse, x400. (C) Oversigt over

Twist1

methylering og udtryk i primære DGCs.

Twist1

blev methyleret i 9 ud af 18 GCS, som angivet ved M. Intensiteten af ​​Twist1 farvning blev scoret som- (negativ), + (svag) og ++ (moderat til stærk). Mus GCS blev inddelt i to grupper, intramucosal og invasive GCS i henhold til kriterierne for menneskelig GC fastlagt af den japanske Gastric Cancer Association [53].

Twist1 proteinekspression blev påvist i 7 af 18 (38,9%) GCS sammenlignet med tilsvarende ikke-kræft gastrisk slimhinde ved immunhistokemi. Repræsentative billeder er vist i fig 3B. Vi analyseret yderligere forholdet mellem

Twist1

udtryk og methylering niveauer i disse tilfælde. Blandt de 18 primære GC undersøgt, viste ni tilfælde korrelation mellem

Twist1

methylering og udtryk (figur 3C). Tre af fire tilfælde med Twist1 svag udtryk udstillet sin methylering, muligvis at lave udtryk for Twist1 kan være forårsaget af dets methylering. Men resterende fem sager udviste ingen methylering og udtryk (tabel 1).

histon methylering er relateret til reguleringen af ​​

Twist1

udtryk

Vi næste undersøgt, hvorvidt lysin methylering niveau af histon H3 bidrager til

Twist1

ekspression. Chromatin immunopræcipitationsanalyser (chip) assays blev udført på den forudsagte CpG shore (CP1.3k), promotoren (CP1), og exonerne 1 (CE1-1 og CE1-2) og 2 (CE2) områder (fig 2A). På CP1 og CE1-2 regioner, blev aktiv histon-mærket H3K4me3 beriget i Twist1 ekspression-positive celler (MDGC-7 og MDGC-9), men inaktive histon mark H3K9me3 blev beriget i Twist1 ekspression-negative celler (MDGC-1 og MDGC -3) (fig 4A og 4B). Chip assays udstillet både H3K4me3 og H3K9me3 signaler i MDGC-1 og MDGC-3 celler med 5-aza-dC behandling, med angivelse af de forhøjede H3K4me3 niveauer i disse celler (Fig 4C). Tværtimod blev H3K27me3 og H3K36me2 niveauer ikke korreleret med Twist1 udtryk i nogen MDGC celler undersøgt i denne undersøgelse. Som for humane GC cellelinjer, en lignende region, som ligger fra promotor til exon 1 viste H3K4me3 berigelse i

Twist1

udtryk-positive MKN45 celler, og H3K9me3 i

Twist1

udtryk-negative KATO-III celler (fig 2C og 4D).

(A) Histon status for methylering i Twist1 ekspressions-positive celler (MDGC-7 og MDGC-9) og -negative celler (MDGC-1 og MDGC-3). Chip-analysen blev udført ved hjælp af H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 og H3K36me2 antistoffer. De fem CHIP regioner (CP1.3k, CP1, CE1-1, CE1-2 og CE2) analyserede er vist i fig 2A. Input DNA-prøver blev anvendt som intern kontrol. (B) Semi-kvantitativ chip analyser af histon H3K4me3 og H3K9me3 berigelse. Chip intensiteter blev analyseret ved hjælp af billede J 1.47v software, og derefter chip /Input blev beregnet. Aktiv histon mark H3K4me3 blev beriget i Twist1 ekspression-positive celler, men inaktive histon mark H3K9me3 blev beriget i Twist1 ekspression-negative celler. (C) Forholdet mellem histon og CGI methylering i MDGC celler. MDGC-1 og MDGC-3 celler blev behandlet med 5-aza-dC, og status histon methylering af deres H3K4me3 og H3K9me3 blev undersøgt af Chip assay. De H3K4me3 niveauer blev forøget i disse 5-aza-dC-behandlede celler sammenlignet i ubehandlede kontroller (Fig 4A), som vist ved trekanter. (D) Semi-kvantitativ chip analyse af H3K4me og H3K9me3 i humane GC celler. Regionerne (CP1, CE1-2) analyserede er vist i fig 2C. Svarende til dataene for mus

Twist1

(Fig 4B), de H3K4me3 og H3K9me3 niveauer blev beriget i MKN45 og KATO-III celler. Den gennemsnitlige (kolonne) ± SD (bar) for tre uafhængige agarosegel Elektroforesér i forskellige eksperimenter er angivet (** P 0,01).

Suv39h1

og

Suv39h2

, en histon methyltransferase, regulerer H3K9me3

Der er en masse af histon methyltransferaser forbundet med H3K4, H3K9 og H3K27 [28]. Derfor, for at afgøre, hvilken histon modifikation enzymer er ansvarlige for H3K4me3 eller H3K9me3 berigelse på

Twist1

exon 1-region i GC celler, undersøgte vi ti H3K4me3 (

Mll1

,

Mll2

,

Mll3

,

Mll4

,

Setd1a

,

Setd1b

,

Ash1

,

Ash1l

,

Smyd3

Meisetz

), syv H3K9me3 (

Suv39h1

,

Suv39h2

,

G9A

,

Setdb1

,

Clld8

,

GlP

RIZ1

), og én H3K27me3 (

EZH2

) relateret gener. Repræsentative data er vist i fig 5A. Blandt dem, ekspressionsniveauerne af

Suv39h1

og

Suv39h2

blev omvendt korreleret med

Twist1

udtryk. Imidlertid blev ekspressionsniveauerne af resterende 16 histon methylatasferase gener undersøgte ikke forbundet med

Twist1

udtryk i MDGC celler. Vi udførte siRNA-baserede knockdown af

Suv39h1

eller

Suv39h2

i de respektive udtryk-positive MDGC-1 og MDGC-3 celler ved elektroporation (figur 5B). Knockdown af

Suv39h1

eller

Suv39h2

i disse cellelinjer ført til en stigning på

Twist1

udtryk observerbare på RT-PCR (Fig 5B) og QRT-PCR (MDGC- 1, fig 5C).

(A) Ekspression af histon methyltransferaser for H3K4 (

Mll1

,

Mll2

,

Mll3

,

Mll4

,

Setd1a og Ash1l

), H3K9 (

Suv39h1

,

Suv39h2

,

G9A og Setdb1

), og H3K27 (

EZH2

) blev bestemt ved RT-PCR. Ekspressionsniveauerne af

Suv39H1

og

Suv39H2

blev omvendt korreleret med

Twist1

udtryk.

GAPDH

blev anvendt som en intern kontrol. (B og C) Effekt af

Suv39h1

eller

Suv39h2

knockdown på

Twist1

udtryk i MDGC celler. RT-PCR blev udført på MDGC-1 og MDGC-3 celler med

Twist1

udtryk efter transfektion af si

Suv39h1

(sih1), si

Suv39h2

(sih2) eller negativ kontrol (sinc) siRNA. (C)

Twist1

,

Suv39h1

og

Suv39h2

mRNA-niveauer i MDGC-1 celler blev yderligere bekræftet ved QRT-PCR. Søjlerne og søjler angiver gennemsnit og S.D. hhv. ** P. 0,01

Foreningen af ​​Sp1 med den transkriptionelle regulering af

Twist1

konsensus 5 ‘- (G /T) GGGCGG (G /a) (G /a) (C /T) -3 ‘sekvens er kendt som den bindende motiv af Sp1 transkriptionsfaktor, og et forhold mellem CGI methylering og Sp1-binding i promotoren er blevet beskrevet [29, 30]. Flere Sp1 bindingssteder blev forudsagt i CpG-rige region i

Twist1

exon 1 med TFBIND (https://tfbind.hgc.jp) og Jaspar (https://jaspar.binf.ku.dk) .