PLoS ONE: gennemsnit af Differential Expression for opdagelsen af ​​biomarkører i blodet hos patienter med prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

Identifikationen af ​​en blod-baserede diagnostisk markør er et mål i mange medicinske områder, herunder tidlig diagnosticering af prostatacancer. Vi beskriver anvendelsen af ​​gennemsnit differential display som en effektiv mekanisme til biomarkør opdagelse i fuldblod RNA. Processen med gennemsnit reducerer problemet med klinisk heterogenitet samtidig minimerer prøvehåndtering.

Metodologi /vigtigste resultater

RNA blev isoleret fra blodet af patienter med prostatacancer og raske kontrolpersoner. Prøver blev samlet og underkastet den midlede differential display proces. Udskrifter til stede på forskellige niveauer mellem patienter og kontrolpersoner blev renset og sekventeret til identifikation. Transkriptniveauer i blodet af prostatacancer-patienter og kontroller blev verificeret ved kvantitativ RT-PCR. Midler blev sammenlignet ved anvendelse af en t-test og en modtager-koerselskurve blev genereret. Ringfingeren protein 19A (RNF19A) transskript blev identificeret som havende højere niveauer i prostatacancerpatienter sammenlignet med raske mænd gennem den midlede differential display proces. Kvantitativ RT-PCR-analyse bekræftede en mere end 2 gange højere niveau af RNF19A mRNA-niveauer i blodet hos patienter med prostatacancer end hos raske kontroller (p = 0,0066). Nøjagtigheden af ​​skelne kræftpatienter fra raske mænd bruger RNF19A mRNA-niveauer i blodet som bestemt af arealet under den modtagende operatør kurven var 0,727.

Konklusioner /Betydning

gennemsnit af forskellen display giver en forenklet tilgang for omfattende screening af kropsvæsker, såsom blod, til at identificere biomarkører i patienter med prostatacancer. Desuden er denne proof-of-concept studie berettiger yderligere analyse af RNF19A som et klinisk relevant biomarkør til detektering af prostatacancer

Henvisning:. Bai VU, Hwang O, guddommelige GW, Barrack ER, Menon M, Reddy GP- V, et al. (2012) i gennemsnit Differential Expression for opdagelsen af ​​biomarkører i blodet hos patienter med prostatakræft. PLoS ONE 7 (4): e34875. doi: 10,1371 /journal.pone.0034875

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: 12 oktober, 2011; Accepteret: 10 marts 2012; Udgivet: April 6, 2012 |

Copyright: © 2012 Bai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Vattikuti Urologi Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mens metastatisk prostatacancer er fortsat en uhelbredelig sygdom [1], intervention, når sygdommen stadig er lokaliseret, og som regel asymptomatisk, er ofte helbredende [2], [3], [4]. Da tidlig indgriben er kendt for at reducere dødeligheden hos mænd med prostatakræft [5], tidlig påvisning giver løfte om at reducere prostatakræft-specifikke dødelighed, men dens effektivitet er endnu ikke fastlagt. Prostata-specifikt antigen (PSA) er den eneste biomarkør der almindeligvis anvendes til dette formål, men har begrænsninger med ufuldkommen specificitet og følsomhed. En normal PSA udelukker ikke tilstedeværelsen af ​​potentielt dødelige prostatakræft [6], mens benign prostata sygdom kan forårsage stigninger i PSA, der kan kræve prostata biopsi til diagnosticering. Begrænsningerne af PSA-screening i at reducere dødeligheden prostata-cancer blev set tydeligt, når to store randomiserede kontrollerede forsøg offentliggjort modstridende resultater [7], [8]. Selv hvis fortolket i et gunstigt lys, resultaterne antydede, at overlevelse gavn af PSA-screening var lille, med 50 mænd skulle gennemgå prostatektomi for at redde et liv [7]. Dette resultat understreger også problemet med prostatakræft overdiagnostik, når mange mænd er diagnosticeret med en indolent prostatacancer, der ikke vil påvirke deres dødelighed, selv hvis venstre ubehandlet. Den omstændighed, at prostatakræft er stadig den anden førende årsag til kræft dødsfald hos mænd [9] er en påmindelse om, hvor vigtigt det afsløre potentielt dødbringende prostatakræft, når det stadig er helbredes. , Identifikation af yderligere biomarkører for at forbedre på udførelsen af ​​PSA forbliver således et vigtigt mål i prostatakræft tidlig påvisning, især i påvisning af aggressiv sygdom.

Vi beskriver her nytten af ​​et gennemsnit differential udtryk (ADE ) tilgang til at identificere biomarkører i blodprøver fra mænd med prostatakræft. Differential display metode kræver ikke forudgående kendskab til RNA-transkripter. Differential display giver således en “åben” system, hvor både kendte og ukendte RNA-transkripter, der er forbundet med en sygdomstilstand, kan identificeres, en omstændighed, der adskiller den fra microarray teknologi [10], [11]. Differential display kræver små mængder af udgangsmateriale RNA (så lidt som 20 ng total RNA), og tilbyder en enestående potentiale for hurtig identifikation af RNA-transkripter er til stede på forskellige niveauer i test versus referenceprøver; det er især effektivt til at identificere lav hyppighed transkripter [11], som ikke kan detekteres ved hybridisering-baserede microarray screening teknologier. Differential display tilbyder også en glimrende mulighed for at afhøre hele transkriptom. Baseret på teoretiske beregninger, er 240 par af vilkårlige og anker primere forventes at forstærke ~96% af udtrykte RNA-transkripter [12]. Næste generations transkriptom sekventering (fx RNA-seq) deler nogle af disse styrker (hele transkriptom analyse forudgående kendskab til udskrift sekvens ikke påkrævet, små mængder start RNA kræves), og samtidig giver mulighed for at skelne allele og splice varianter, ikke let evalueres med differential display [13]. Dog vil RNA-seq sekventering data skævt mod høje overflod udskrifter og teknologien forbliver op til 100 gange dyrere end differential display [13].

ADE bevarer fordelene ved differential display teknik samtidig lette analysen af heterogene prøver. Den samling af heterogene prøver effektivt identificerer udskrifter, der er forskelligt udtrykt i en høj andel af prøverne, der omfatter to grupper [10]. Vi søgte at forbedre ADE metode ved at fremskynde prostatakræft biomarkør opdagelse i klinisk relevante prøver. Selv guldstandarden af ​​prostatakræft diagnose er en prostata biopsi, denne procedure er smertefuldt, invasive og med forbehold af eventuelle komplikationer på blødning og infektion. Derfor biomarkører, der kan identificeres i prøver såsom blod er ønskelige. Da ikke alle tumorassocierede biomarkører vil kunne spores i blodet, der starter opdagelsen processen i tumorvæv vil senere kræve yderligere udgifter af tid og ressourcer til validering i blodprøver. Desuden ville blodbaserede biomarkører, der repræsenterer en vært reaktion på tumor ikke identificeres, hvis biomarkører initieres i tumorprøver. Særlig blodtapning medier muliggør effektiv inddrivelse af ikke-nedbrudt RNA fra fuldblod, selv efter længere tids inkubation ved stuetemperatur, hvilket gør dette til et praktisk valg for klinisk anvendelse. Vi besluttede derfor at starte biomarkører under anvendelse fuldblodsprøver.

Selvom ADE typisk er blevet anvendt til at evaluere transkripter der udtrykkes differentielt i væv (dermed, terminologien “gennemsnit differentiel ekspression”), vi tilpasset dette teknik til at identificere RNA-transkripter, der er til stede på forskellige niveauer i fuldblod RNA fra to patientgrupper. Disse transkripter ikke nødvendigvis udtrykkes forskelligt i celler, der er til stede i blodet, eller endda i tumor i forhold til normalt væv, men deres tilstedeværelse i blodet kan anvendes til at skelne mellem disse to grupper. I denne undersøgelse beskrives anvendelse af ADE at identificere en RNA transcript, RNF19A (Gene ID: 25.897), som er til stede ved højere niveauer i blodet af patienter med prostatacancer end hos raske kontroller. Disse resultater fastslår proof-of-principle for gennemsnitligt differentiel ekspression (ADE) metode kan anvendes til opdagelsen af ​​RNA-markører i legemsvæsker fra mænd med prostatakræft og støtte studiet af RNF19A som en potentiel prostatacancer biomarkør.

Metoder

Etik Statement

Alle forskning med mennesket deltagere blev godkendt af Henry Ford Health System (HFHS) Institutional Review Board. Skriftligt informeret samtykke blev opnået for alle deltagere og alle kliniske undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.

Patienter og Blood Collection

Prostatakræft patienter blev identificeret gennem Department of Urologi på Henry Ford Health System (HFHS). Sunde kontroller blev rekrutteret fra den almindelige befolkning og HFHS Intern medicin klinikker. Fuldblod (2,5 ml) blev opsamlet i PAXgene Blood RNA rør (Qiagen, Valencia, CA), der giver mulighed for transport ved stuetemperatur uden RNA-nedbrydning. Prøverne blev nedfrosset ved -80 ° C indtil ekstraktion af RNA blev udført.

RNA Isolation

Blod i PAXgene Blood RNA-rør blev centrifugeret. Pelleten blev vasket med RNase-frit vand og resuspenderet i Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA blev ekstraheret ifølge fabrikantens protokoller. Det isolerede RNA blev behandlet med RNase-fri DNase (Invitrogen, Carlsbad, CA) og koncentrationen af ​​total RNA blev bestemt ved anvendelse af en qubit Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Middelværdi differentiel ekspression (ADE)

Totalt RNA fra blodet fra 10 patienter og 10 raske mænd blev samlet separat, revers transkriberet og underkastet ADE som beskrevet af Bai et al [10]. Anker og vilkårlige primere til PCR var H-T11A og H-AP17 (GenHunter Corporation, Nashville, TN). PCR-reaktioner blev udført in duplo. PCR-produkter blev elektroforeret, og bånd detekteret ved autoradiografi. Bands, der afveg i intensitet mellem prostatacancerpatienter og raske mænd blev skåret fra gelen, re-amplificeret under anvendelse af samme anker og vilkårlige primere H-T11A og H-AP17, og gælder sekventeret.

QRT-PCR

RNA blev revers transkriberet under anvendelse af vilkårlige hexamerprimere og Transcriptor revers transkriptase (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) ifølge producentens protokol. Efter revers transkription blev RNA udsat for qPCR på en Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved hjælp af sekvensspecifikke primere til RNF19A (Assay Id: Hs00968447_m1) og 18S RNA (Assay Id: Hs03928985_g1 ). Denne cyklus nummer ved hvilken reaktionen krydset en tærskel fluorescens (C

T) blev bestemt for hver transkript, og niveauet af hver test-gen i forhold til 18S RNA (anmodning afskrift) blev bestemt ved anvendelse af ligningen 2

-ΔC

T hvor ΔC

T = C

T, test – C

T, ref [14]

statistiske metoder

midler blev sammenlignet ved hjælp af en t. -prøve. Den lighed af gruppens varianser blev testet, og Satterthwaite p-værdi blev rapporteret for fordelinger med ulige varianser. The Pearson korrelationskoefficienten blev anvendt til at evaluere lineær korrelation. En modtager operatør kurve (ROC) blev genereret ved at afbilde følsomheden over for falske positiver (1 – specificitet) som diskrimination af testen blev varieret. Areal under kurven (AUC) blev beregnet. Alle statistiske beregninger blev udført i SAS.

Resultater og Diskussion

Blodprøver blev opnået fra raske mandlige kontrol og mænd med lokaliseret prostatacancer inden definitiv behandling. Efter RNA-ekstraktion, 20 ng samlet RNA fra hver af patienterne 10 prostatacancer eller fra hver af de 10 raske mænd blev kombineret til dannelse af to separate puljer af RNA (prostatacancer vs. sunde), der blev derefter analyseret ved ADE som beskrevet af Bai et al [10]. PCR-amplifikation under anvendelse af et anker og vilkårlig primer sæt blev udført dobbelt, og reaktionsprodukterne blev underkastet gelelektroforese (fig. 1).

Som vist i fig. 1, ADE analyse identificeret to RNA-transkripter forstærket på betydeligt højere niveauer i blodprøver fra patienter med prostatacancer (Ca) end i dem fra raske mænd (H). Nucleotidsekvens-analyse (fig. S1, supplerende data) afslørede, at disse to transkripter delte en fælles sekvens, og at denne sekvens havde 100% homologi med nukleotidsekvensen i ringfingeren protein 19A (RNF19A) mRNA-transkript. RNF19A, også kaldet Dorfin, er en E3 ubiquitin ligase kendt for at blive udtrykt i de patologiske inklusioner fundet i Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, og Lewy body demens [15]. RNF19A ubiquitinerer synphilin-1 og muteret superoxiddismutase 1 (SOD1), der er impliceret i patogenesen af ​​disse neurodegenerative lidelser [16], [17]. RNF19A har ikke tidligere været forbundet med cancer, hvilket understreger nytten af ​​differential display identificere hidtil ukendte sammenslutninger. Imidlertid har både RNF19A og dens mål (SOD1 og synphilin-1) været impliceret i celle overlevelse og celledød veje [18], [19], [20]. SOD1 er specifikt associeret med prostatacancer [21], [22] og kan være involveret i cellulære respons på DNA beskadigelse gennem dens rolle i den oxidative stress pathway. Andre E3-ubiquitin ligaser, såsom RNF6, er rapporteret at regulere androgen receptor aktivitet i prostata kræftceller [23].

ADE analyse identificeret to RNA-transkripter med niveauet betydeligt højere i fuldblod RNA fra patienter med prostatacancer ( ca) end hos raske mænd (H). Nukleotidsekvensanalyse afslørede, at disse to transkripter delte en fælles sekvens. Denne sekvens havde 100% homologi med nukleotidsekvensen i E3-ubiquitin-ligase ringfinger Protein 19a (RNF19A) transskript og er beliggende i den 3′-utranslaterede region (UTR).

Efter identificering af den RNF19A transkriptet som en potentiel biomarkør adskille blodet af patienter med prostatacancer fra blod fra raske kontroller blev QRT-PCR anvendes til at måle niveauet af dette transkript, i forhold til den for 18S RNA, i helblod RNA-prøver fra individuelle patienter. Relative RNF19A niveauer blev målt i 33 prostatacancerpatienter og 19 raske mandlige kontroller. Disse kohorter var uafhængige af patientgrupper, der anvendes til ADE søgeprocessen. Kontrolprøverne (median alder 40 år, spændvidde 31-50 år) blev taget fra den almindelige befolkning, og som sådan, ikke var alderskategori til prostatakræft tilfælde. Baseline kliniske data for prostatacancer kohorten er vist i tabel 1. Alle prostatakræft tilfælde havde konventionel adenocarcinom på patologisk gennemgang og ingen blev dokumenteret at have nodal eller fjernt metastatisk sygdom. Relative RNF19A niveauer, som målt ved QRT-PCR er vist i fig. 2 (til sammenligning af rå C

T-data, se supplerende data, tabel S1). Den gennemsnitlige relative RNF19A var 4,79 ± 0,91 (SE) i prostata cancer patienter sammenlignet med 1,96 ± 0,39 (SE) i raske kontrolpersoner. Denne forskel mellem de to grupper var statistisk signifikant (p = 0,0066). En tilsvarende statistisk signifikant forskel i RNF19A niveauer mellem prostatacancerpatienter og raske kontroller blev opnået, når niveauer blev vurderet ved anvendelse semikvantitativ RT-PCR (fig. S2, supplerende data).

Kvantitativ RT-PCR blev udført på fuldblod RNA-prøver fra patienter med lokaliseret prostatacancer (n = 33) og i raske mandlige kontroller (n = 19). Niveauer af RNF19A udskrift blev normaliseret til 18S RNA (henvisning gen). Normaliserede resultater er præsenteret i rubrik plot format, med bokse, der repræsenterer de 25

th, 50

th, og 75

th percentiler og whiskers repræsenterer 10

th og 90

th percentiler af data. Outliers vises også. Forskellen mellem de midler var statistisk signifikant (p = 0,0066).

En modtager-drift kurve for RNF19A blev genereret som et samlet skøn over følsomheden og specificiteten af ​​dette blod biomarkør til at skelne prostatakræft sager fra kontroller (fig. 3). AUC for modellen var 0,7273, hvor en AUC på 1 svarer til en diagnostisk test med perfekt (100%) specificitet og følsomhed. Som et referencepunkt har AUC for PSA blevet anslået til 0,640-0,678, mens AUC for en populær nomogram, der tager hensyn til andre prostatakræft risikofaktorer ud over den PSA-niveau er anslået til 0,691 [24], [ ,,,0],25], [26].

en modtager-drift kurve (ROC) blev genereret som et foreløbigt skøn over nøjagtigheden af ​​relative RNF19A klassificere patienter med kræft eller raske kontrolpersoner i vores kohorte af patienter. Den sande positive rate (følsomhed) blev plottet mod falske positive (1-specificitet). Arealet under kurven blev beregnet som 0,7273.

Selvom dette fund er opmuntrende, skal det bemærkes, at ved hjælp af PSA til at differentiere patienter med prostatakræft fra kontrol i vores kohorter kan også have resulteret i en forbedret AUC betragtning af den forholdsvis yngre alder af vores sunde kohorte. Med en gennemsnitsalder på 40, ville den forventede PSA i vores sunde kohorte være mindre end 1,0 ng /mL, væsentligt lavere end medianen PSA-værdi på 6,4 ng /mL ses i vores prostatakræft kohorte. Desværre fik RNF19A niveauer ikke korrelerer med alderen (Pearson koefficient på 0,09), hvilket gør det usandsynligt, at vores resultater er simpelthen på grund af en aldersrelateret effekt. Det er klart, skal udføres i populationer, der ligger tættere indstillingen virkelige verden af ​​patienter, der er nævnt for prostata biopsi yderligere validering. Desuden er det fortsat skal afgøres, om RNF19A eller andre sådanne biomarkører vil tilføre yderligere værdi til klinisk etablerede metoder til at etablere prostatakræft risiko såsom PSA, alder, race og familiens historie. Denne undersøgelse blev ikke designet til at løse den kritiske spørgsmål om øget registrering af potentielt dødelig kræft og samtidig undgå overdiagnostik af indolent kræft. Yderligere indsats på biomarkør opdagelse for at identificere disse dødelige undertyper er en væsentlig målsætning for fremtiden.

Som konklusion, vi beskriver her brugen af ​​gennemsnit differentieret udtryk for at identificere RNF19A som en RNA-transskript, der er til stede på betydeligt højere niveauer i blodet af patienter med prostatacancer sammenlignet med raske kontroller. I vores stikprøve af patienter, denne afskrift var i stand til at skelne prostatakræft patienter fra kontrol med et AUC på modtageren-drift kurve af 0,7273. Resultaterne diskuteres her etablere proof-of-princip, at ADE metode kan anvendes til opdagelsen af ​​RNA markører i blodet hos mænd med prostatakræft og garanterer yderligere analyse af RNF19A som et klinisk relevant biomarkør for prostatakræft tidlig påvisning.

Støtte Information

Figur S1. Salg kromatogrammer af ADE-identificerede udskrifter. Prøver fra raske kontroller og patienter med prostatacancer blev underkastet gennemsnit differentiel ekspression analyse. Udskrifter (A og B), der er til stede på forskellige niveauer i raske kontrolpersoner sammenlignet med patienter med prostatacancer, blev fremlagt for sekventering. Kromatogrammer fra sekventeringsreaktionerne for både transkript A og B er vist, hvilket indikerer en identisk fælles sekvens. Givet opløsningen af ​​differential display gel, forskellen i længde mellem de to bånd (A og B) er ikke mere end nogle nukleotider. En anden udglødning sted for enten den tilfældige primer eller polyA primer kan forklare dette resultat

doi:. 10,1371 /journal.pone.0034875.s001

(PPT)

Figur S2.

RT-PCR-analyse af RNF19A i blod fra patienter med prostatacancer og raske mænd. Niveauer af RNF19 blev vurderet ved anvendelse semikvantitativ RT-PCR. RNA blev revers transkriberet under anvendelse af vilkårlige hexamerer eller oligo (dT) primer og Transcriptor revers transkriptase (Roche Applied Science) ifølge producentens protokol. Amplifikation af cDNA blev udført under anvendelse af sekvensspecifikke primere RNF19A og GAPDH-generne. PCR-produkter blev kørt på en 2% agarosegel. Kvantificering af cDNA bånd på gelen blev udført af digital analyse af band intensitet ved hjælp af en Eagle Eye II stadig videosystem med software leveret af Stratagene (La Jolla, CA). RNF19A udskrift niveauer signifikant højere i prostata cancer patienter sammenlignet med kontroller

doi:. 10,1371 /journal.pone.0034875.s002

(PPT)

tabel S1.

Raw C

T-data præsenteres for validering kohorter af patienter med prostatacancer (PRCA PTS) og raske kontrolpersoner. Mean C

T-værdier var lavere i PRCA pts i forhold til kontrolgruppen (28,25 vs. 29,50, p = 0,02). Mean C

T værdier for 18S henvisning genet var ikke statistisk forskellige mellem patienter og kontrolpersoner (16.62 vs 16,67, p = 0,89). Midler blev sammenlignet ved hjælp af en t-test

doi:. 10,1371 /journal.pone.0034875.s003

(DOC)

Tak

Forfatterne takker patienterne og deres familier, der gjorde dette arbejde muligt.