PLoS ONE: makrofag Infiltration inducerer Gastric Cancer invasiv ved Aktivering af β-Catenin Pathway

Abstrakt

Baggrund

På trods af beviser for, at aktiverede makrofager handle i en inflammatorisk mikromiljø at fremme gastrisk tumorgenese via β-catenin signalering, virkningerne af β-catenin signalering på mavekræft celle metastaser og forholdet mellem disse celler med omgivende tumorassocierede makrofager er ikke blevet direkte undersøgt.

Metoder

immunhistokemisk farvning blev anvendt til at analysere 103 patienter. En invasion assay blev anvendt til at vurdere forholdet mellem makrofager og gastriske cancerceller. p-catenin gain-of-funktion og tab af funktion tilgange blev udført. For at vurdere β-catenin reguleringsmekanisme i gastriske kræftceller, Western blotting og reverse-transskription polymerasekædereaktion blev anvendt.

Resultater

Øget tæthed af makrofager var forbundet med fremskreden og dårlig overlevelse . Gastrisk cancer cellelinjer co-dyrket med makrofager konditioneret medium viste øget nuklear akkumulering af β-catenin og øget invaderende evne. AKT men ikke ERK regulerede β-catenin translokation. MMP7 og CD44, både β-catenin nedstrøms gener, var involveret i makrofag-aktiverede mavekræft celleinvasion.

Konklusion (er)

Kollektivt, tyder de kliniske data, makrofag infiltration er korreleret med øget kvalitet og dårlig prognose for mavekræft patienter, som gennemgik radikal resektion. Makrofager kan fremkalde invasiv ved at aktivere β-catenin vej

Henvisning:. Wu MH, Lee WJ, Hua KT, Kuo ML, Lin MT (2015) makrofaginfiltration inducerer Gastric Cancer invasiv ved Aktivering af β-Catenin Pathway . PLoS ONE 10 (7): e0134122. doi: 10,1371 /journal.pone.0134122

Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, ITALIEN

Modtaget: September 16, 2014 Accepteret: 6 jul 2015; Udgivet: 30 Juli 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Rådet, Taiwan (NSC 98-2314-B-002-055-MY2)

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er blandt de mest almindelige kræftformer i hele verden og næsten to tredjedele af disse patienter vil dø af. deres sygdom. [1] GC er tæt forbundet med

Helicobacter pylori

infektion, hvilket fører til kronisk inflammation. [2] Denne inflammatoriske mikromiljø er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​værten leukocytter med hovedsagelig makrofager i begge den understøttende stroma og tumorvæv. [3] Undersøgelser viser, at tumor-associerede inflammatoriske reaktioner, både lokale og systemiske, er vigtige uafhængige faktorer i tumorprogression og metastase. [4, 5] Men forbindelserne mellem disse molekylære mediatorer og kronisk inflammation er ikke fuldt forstået .

Aktivering af Wnt-vejen er et vigtigt skridt i carcinogenese. Mutationer langs Wnt-β-catenin pathway forekommer hos ca. 90% af tyktarms- og hepatocellulære carcinomer og i omkring 30% af GCS. [6, 7] Desuden tumornekrosefaktor-α (TNF-α) afledt fra aktiverede makrofager fremmer β-catenin-aktivitet i GC-celler. [8, 9] trods for bevis på, at aktiverede makrofager handling i en inflammatorisk mikromiljø at fremme gastrisk tumorgenese via β-catenin signalering, virkningerne af aktiveret β-catenin signalering på GC celle metastase og forholdet af disse celler med omgivende tumorassocierede makrofager (TAM’er) er ikke direkte undersøgt.

Baseret på ovenstående resultater, vi hypotese, at β-catenin pathway også kan være involveret i regulering makrofag-induceret GC metastase. I denne undersøgelse har vi undersøgte først densiteten af ​​infiltrerede makrofager og ekspressionen af ​​β-catenin i gastriske carcinoma væv ved hjælp af immunhistokemi (IHC). De klinisk-patologiske karakteristika gastrisk karcinom og prognose blev påvist. Endvidere fandt vi, at makrofager inducerer nuklear translokation af β-catenin og forbedre invasionen evne GC celler. Vores resultater viser og yderligere at understøtte et vigtigt bindeled mellem TAM og dens downstream signalering mægler, β-catenin, i reguleringen GC metastaser.

Materiale og metoder

Patienter og Prøver

undersøgelsen blev godkendt af bestyrelsen og menneskelige etiske komité for National Taiwan University Hospital Institutional Review. Skriftligt samtykke til at bruge prøverne til forskningsformål blev opnået fra alle patienter før operation. Patientinformation blev anonymiseret og anonymiseres før analyse.

Undersøgelsen efterfølgende indskrevet 205 patienter diagnosticeret med GC, der modtog radikal kirurgisk resektion ved Institut for Almen Kirurgi, National Taiwan University fra januar 1998 til januar 2002. Af heraf blev 102 patienter, der manglede opfølgende data, eller som døde af perioperative komplikationer udelukket, og de resterende 103 patienter blev inkluderet i analyserne. Klinisk-patologisk variabler blev klassificeret i henhold til TNM klassifikation (5. udgave, 1997) og de egenskaber er opsummeret i tabel 1. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som intervallet mellem kirurgi og død eller mellem kirurgi og den sidste opfølgning for overlevende patienter.

monoklonale antistoffer og IHC

De resektion eksemplarer af GC blev fikseret i formalin og indstøbt i paraffin. Snit blev undersøgt for TAM infiltration og β-catenin anvendelse af monoklonalt anti-CD68-antistof (klon KP1, DakoCytomation, Glostrup, Danmark) og monoklonalt β-catenin antistof (klon 15B8, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), hhv.

Evaluering af Immunfarvning

for at vurdere tætheden af ​​væv-infiltrerende CD68 + makrofager blev vævssnit screenet af en bestyrelse certificeret patolog (CI jan) ved lav effekt (100 ×), og de fem mest repræsentative felter blev valgt ved 400 ganges forstørrelse. Resultaterne blev talt manuelt, og blev udtrykt som summen af ​​antallet af celler i fem 400 × mikroskopiske felter for hvert område af hver prøve.

Cell Kultur

GC celler AGS, N87 (købt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA)), MKN45 (købt fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan)) og TSGH (købt fra Bioresource Indsamling og Research center (Hsinchu, Taiwan)) og human monocytiske celle line THP-1 (indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA)) celler blev dyrket i RPMI-1640 medium (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) med 10% føtalt bovint serum (FBS, Life Technologies, Inc. ) og 2 mM L-glutamin (Life Technologies, Inc.).

THP-1-celler blev podet i dyrkningsskåle og induceret til at differentiere til makrofager ved inkubering med 100 ng /ml 12-O-tetradecanoylphorbol-13 -acetat (TPA, Sigma-Aldrich) i 24 timer. Makrofagerne blev vasket tre gange med RPMI-medium indeholdende 10% FBS, inkuberet i dette medium i yderligere 24 timer for at eliminere virkningen af ​​TPA og inkuberet i serumfrit medie i yderligere 24 timer. De høstede og poolede kultursupernatanter blev anvendt som makrofag-konditioneret medium (CM) som tidligere beskrevet. [5, 10]

Proliferation /Levedygtighed Assay

GC-celler blev podet i plader med 96 brønde og co-dyrket med eller uden makrofag CM. Proliferationen /levedygtighed blev bestemt ved en kolorimetrisk assay under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma-Aldrich).

In vitro invasion assay

invasion assay blev udført under anvendelse transwell cellekultur kamre (Millipore Corp., Billerica, MA). De invaderende celler blev talt ved 400 × forstørrelse i 10 forskellige felter for hver indsats. Eksperimentet blev gentaget tre gange.

RNA-ekstraktion og RT-PCR

Efter stimulering med eller uden makrofag CM i 6 timer, GC celler blev opsamlet og total RNA ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens kit ( Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR) under anvendelse af primere til MMP7 (fremadrettet: 5′- AGTCAATCCTGCCTTCTTAGCC, revers: 5′- GCTCCCACCTTCCCTCTTGG), CD44 (fremad: 5′- TGCCGCTTTGCAGGTGTAT, revers: 5′- TCCCATGTGAGTGTCTGGTAGC), cyclin D1 ( frem: 5’CCCAGCCATGGAACACCA, omvendt: 5’GGAGGGCGGATTGGAAATGA), c-myc (frem: 5’AAAGAAGGTGTTGGGGTCGG, omvendt: 5’TGGCTCCCCCTGTTATTTGG) og GAPDH (fremad: 5’GGGTGATGCAGGTGCTACTT, omvendt: 5’GGCAGGTTTCTCAAGACGGA) .

Nuclear og cytoplasmiske Fraktionering

efter stimulering med eller uden makrofag CM i 6 timer, blev GC-celler lyseret i 300 pi lysepuffer på is og centrifuger ved 5.400 rpm. Supernatanten blev opsamlet som et cytosol fraktion. Nukleare fraktioner blev opsamlet, derefter køre i natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) for Western blot-analyse.

Western blotting-analyse

Efter stimulering med makrofag CM, cellerne blev vasket med PBS , skrabet over i RIPA-buffer og centrifugeret. Cellelysaterne blev underkastet 10% SDS-PAGE og overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Millipore Corp.) Membranen blev probet med primære antistoffer til β-catenin, AKT, ERK, JNK (SC1496, SC8312, SC154, SC474, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, Californien, USA), MMP7 (MAB3322, CHEMICON, Temecula, Californien, USA), CD44 (ab51037, Abcam, Cambridge, MA, USA), c-myc (GTX103436, GeneTex, Hsinchu By , TAIWAN), cyclin D1 (SC246, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), β-actin (ab8226, Abcam), HDAC1, p-AKT, p-ERK, p-JNK (SC7872, SC7985-R, SC7383, SC6254, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA) og sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology).

Immuncytokemi

Anti-total β-catenin antistof blev anvendt som det primære antistof, og anti- muse-immunglobulin G (IgG) Alexa 594 blev anvendt som det sekundære antistof. Dækglas blev derefter monteres ved hjælp af montering medium, der indeholder DAPI for nuklear farvning.

Lentiviral produktion og infektion

Kort hårnål RNA (shRNAs) blev købt fra National RNAi core Facility på Academic Sinica (Taipei, Taiwan). Målsekvensen af ​​β-catenin shRNA 1 var 5’CCGGTCTAACCTCACTTGCAATAATCTCGAGATTATTGCAAGTGAGGTTAGATTTTTG-3 ‘; den af ​​β-catenin shRNA 2 var 5’-CCGGTTGTTATCAGAGGACT-AAATACTCGAGTATTTAGTCCTCTGATAACAATTTTTG-3 ‘. Lentivirusvektoren og emballagen vektorer blev transficeret ind 293T emballage celler ved calciumphosphat-transfektion. Kort fortalt blev 293T-celler opdele (10

6) i 10 cm

2 retter 1 dag før transfektion. Derefter blev celler transficeret med 10 ug shRNA vektorer og 10 ug pCMVΔR8.91 (emballagen vektor) og 1 ug pMD.G (konvolutten vektor). Efter 5 timers inkubation blev transfektion mediet erstattet med frisk dyrkningsmedium. Otteogfyrre timer senere blev lentivirus-holdigt medium opsamlet fra transfektion og centrifugeret ved 1500 rpm i 5 min for at pelletere celledebris blev supernatanten filtreret gennem et 0,45 um filter, og målceller blev inficeret med frisk lentivirus-holdige medium (suppleret med 8 ug /m polybren) i 24 timer.

Statistisk analyse

Statistisk analyse af de kliniske træk blev udført ved hjælp af χ

2 test og graden af ​​infiltration mellem de to grupper blev sammenlignet under anvendelse af t-test. Overlevelseskurver blev konstrueret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og statistisk signifikans blev analyseret ved anvendelse af log-rank test. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Korrelation af Immunohistokemiske variabler med Clinicopathologic funktioner i GC Patienter

immunhistokemisk analyse viste en cytoplasmatisk CD68 farvningsmønster for makrofager. CD68 + makrofager blev fordelt overalt peritumorale og intratumorale væv men kun sparsomt spredt i den normale slimhinde (Fig 1A-1C). Tætheden af ​​CD68 + makrofager var især høj i patologisk tumor stadie 4 (pT4) tumor læsioner sammenlignet med pT1 læsioner (Fig 1D). For at bestemme associationen mellem kliniske karakteristika og CD68 + makrofag densitet blev tællinger af CD68 + makrofager opdelt i dem, over og under medianværdier. fandtes antallet af CD68 + makrofager at være forbundet med tumor dybde og trin (p = 0,001 og p = 0,043, henholdsvis) (tabel 1). Denne observation antyder, at CD68 + makrofager kan være vigtige for at fremme tumor invasion. For yderligere analyse blev Kaplan-Meier overlevelseskurver plottet til at bestemme sammenslutning af makrofager med overlevelse (fig 2). Densiteten af ​​CD68 + makrofager i tumoren væv negativt forbundet med samlet overlevelse (p = 0,0073). Patienter med høje antal af tumorale CD68 + makrofager havde kortere samlet overlevelse end dem med et lavt antal CD68 + makrofager.

Immunfarvning mod CD68 blev udført på væv slides fra gastrisk kræftpatienter. CD68 + makrofag-farvning var sparse i den normale gastriske mucosa (A). CD68 + celler blev påvist i både stroma og tumor reden (B 0,05), som ikke er forbundet med deres proliferation evne (Fig 4B-4D ).

(A) Migration aktivitet af THP-1 monocyt co-dyrket med forskellige gastriske cancercellelinier (AGS, N87, MKN-45 og TSGH). THP-1 monocyt vil blive rekrutteret af forskellige gastrisk cancer cellelinjer og rekruttering evne er afhængig af graden af ​​malignitet. (B) Invasion evne GC-celler behandlet med makrofag CM. Fire forskellige typer af GC celler (AGS, MKN45, N87 og TSGH) blev podet i et Boyden kammer og co-dyrket med eller uden makrofagceller eller makrofag CM i 24 timer. Invasion evner af hver cellelinje blev målt

in vitro Salg i 24 timer. Alle data repræsenterer aritmetiske gennemsnit ± SEM. * P 0,05, ** p 0,01. (C) Effekt af makrofag CM co-dyrket med celler. N87 og AGS-celler blev co-dyrket med makrofag CM henholdsvis i 24 timer og cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assayet.

cellekernetranslokering af β-catenin i GC celler ved aktiverede makrofager

Vi har udført et eksperiment in vitro for at forstå, om β-catenin signalering var involveret i makrofag-aktiverede GC celleinvasion. Som vist i fig 5A, blev β-catenin immunoreaktivitet findes i den nukleare fraktion af N87 celler så tidligt som 15 minutter efter makrofag CM behandling, og mængden af ​​nukleare β-catenin-protein forøget i en tidsafhængig måde. I overensstemmelse med disse resultater viste immunofluorescens ophobning og nuklear lokalisering af β-catenin i GC celler co-dyrket med makrofag CM sammenlignet med kontroller samdyrket i N87 (Fig 5B). Disse resultater antyder kraftigt, at de opløselige faktorer afledt af makrofager bidrag til mægling ophobning og nuklear translokation af β-catenin i GC-celler. Vi forbigående slået ned β-catenin af shRNA og fundet reduceret β-catenin-proteinekspression inden 24 timer. Genetisk ablation af β-catenin i N87-celler mislykkes at øge deres invasive evne efter makrofag CM behandling. Derimod ikke-transficeret og kontrol shRNA havde ingen ændring i den invasive kapacitet i N87 celler under makrofag CM behandling (Fig 5C). Mængden af ​​nukleare β-catenin protein blev også øget i den årlige vækstundersøgelse og MKN45 celler efter makrofag CM behandling (S1 Fig).

(A) β-catenin akkumuleres i kernen efter behandling med makrofag CM i 30 minutter i N87 celler. (B) Immunofiuorescent billeder blev observeret med et konfokalt mikroskop. β-catenin-positive celler blev analyseret ved anvendelse af et anti-β-catenin antistof, som genkendes af sekundære kanin antistof konjugeret med FITC, afbildet ved grøn fluorescens; Nuklear farvning blev detekteret ved kontrafarvning celler med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), repræsenteret blå fluorescens. Co-dyrkning med makrofag CM viste immunofiuorescence farvning β-catenin-FITC komplekser translokeres ind nucleus. (C) Invasion evne GC celler behandlet af makrofag CM.

Effekter af makrofag på ekspression af β-catenin og Downstream Gener i N87 Celler

Vi evaluerede den traditionelle Wnt /β-catenin nedstrøms gener MMP7, CD44, c-myc og cyclin D1 til determinate hvis de aktiveres af makrofager. De mRNA og protein niveauer af MMP7, CD44 og c-myc gener blev forøget alle betydeligt i N87 celler inkuberet med makrofag CM og niveauet af cyclin D1 steget en smule (Fig 6A). Efter at spørge faldt invasion aktivitet fra vælte β-catenin, MMP7 viste CD44 og cyklin D1 men ikke c-myc protein nedregulering (Fig 6B). For at bekræfte forholdet mellem invasion evne og MMP7 og CD44, testede vi evnen af ​​et neutraliserende antistof til at blokere MMP7 og CD44 aktivitet. Invasion evne var signifikant kompromitteret ved forbehandling med 2,5 ug /ml anti-MMP7 og med 10 ug /ml anti-CD44 (Fig 6C) henholdsvis, hvilket antyder inddragelsen af ​​begge gener i makrofag-aktiverede GC celleinvasion. Vi fandt protein niveauer af CD44 og cyclin D1 generne blev forøget i de andre GC cellelinier (AGS og MKN45) inkuberet med makrofag CM men MMP7 og c-myc blev ikke signifikant ændret (S2 Fig).

( A) Virkning af makrofag CM på mRNA og protein ekspression af β-catenin down-stream-gener. N87-celler blev dyrket i nærvær eller fravær af makrofag CM. For RNA og proteinniveau blev celler opsamlet efter 6 timer og 24 timers behandling hhv. (B) N87-celler med eller uden knock-down af β-catenin anvendelse shRNA-2 blev co-behandlet i nærvær eller fravær af makrofag CM. N87 celler blev opsamlet efter 24 timers behandling og analyseret med Western blot. (C) Effekt af MMP7 neutraliserede antistof på invasion GC celler. N87-celler i nærvær af makrofag CM i 24 timer blev forbehandlet med forskellige doser MMP7 neutraliseret antistof (0, 0,625, 1,25 og 2,5 ug /ml) i 1 time Isotype IgG blev anvendt som en blokerende kontrol. (D) Effekt af CD44 neutraliserede antistof på GC celleinvasion. N87-celler i nærvær af makrofag CM i 24 timer blev forbehandlet med forskellige doser CD44 neutraliseret antistof (0, 1,25, 2,5, 5 og 10 ug /ml) i 1 time. Isotype IgG blev anvendt som en blokerende kontrol. Alle data repræsenterer aritmetiske gennemsnit ± SEM. *

s

0,05.

Andre har rapporteret en mulig skæringspunktet mellem MAPK-vejen med Wnt /β-catenin signalering pathway. [12, 13] Vi udførte derfor et tidsforløb undersøgelse og fandt, at kun phospho-AKT og phospho-ERK-ekspression blev opreguleret ved behandling med makrofag CM (S3A fig). For at bekræfte interaktionen mellem AKT /ERK-vejen og β-catenin, vi forbehandlede celler med enten ERK inhibitor (U0126) eller AKT-inhibitor (LY294002). Formindskelse af β-catenin translokation ind i kernen blev kun fundet i celler behandlet med AKT-inhibitor, men ikke ERK inhibitor, hvilket indikerer makrofag-avtivated Wnt /β-catenin-signalvejen kunne reguleres ved AKT (S3B Fig). I GC celler synes AKT effekten for at være dominerende i makrofag aktiverede Wnt /β-catenin signalvejen. Tidligere undersøgelser også foreslået at TNF-α produceres af makrofager er en vigtig mediator for inflammation og kan fremme β-catenin-aktivitet i tumorceller. Vi fandt, at anvendelse af neutraliserende antistof mod TNF-α i N87 undertrykke β-catenin-aktivering under udsættelse for makrofag CM (S4 Fig).

Discussion

mikromiljø af en tumor er af afgørende betydning i bestemmelse leukocyt funktion og fænotype. Modstridende data har vist antitumorigenic eller protumorigenic funktioner på makrofager i særdeleshed, men vores data indikerer makrofager spille en protumorigenic rolle i GC patienter. I de fleste tumorer, TAM’er producere et utal af faktorer, der fremmer tumorvækst og angiogenese. [14, 15] Graden af ​​makrofag infiltration i cancercellen reden er også en væsentlig prædiktor for overlevelse i GC patienter. [16-18] IHC resultaterne i denne undersøgelse viser klart, at tætheden af ​​makrofager i GC væv er korreleret med graden af ​​klinisk fase (især i tumoren [T] etape) og overlevelse hos patienter. De nuværende undersøgelser også betyde, at makrofager kan spille skadelige roller i avanceret GC. Dette fund er i harmoni med undersøgelser, der tyder på, at immunforsvaret mikromiljø kan være protumoral stedet antitumor, trods nogle modstridende data. [19, 20]

Nuklear ophobning af β-catenin er blevet rapporteret i cirka en tredjedel af gastriske adenokarcinomer, både tarm- og diffuse typer. [18] β-catenin er en 92 kDa-protein, der fungerer direkte i celle-til-celle adhæsion. [21] Mutationer af β-catenin og afvigende ekspression af sine proteiner er blevet impliceret i tumorinvasion og metastase. [22, 23] i vores IHC fund, β-catenin var placeret i kernen ved den invasive forsiden af ​​tumorceller, men ikke i den mest centrale område af de primære tumorer, hvor det er lokaliseret til plasmamembranen . Sådanne observationer kan også findes i kolorektale tumor prøver. [24] Wnt /β-catenin aktivering i kræftceller placeret på den invasive fronten er postuleret som et vigtigt skridt i tumorvækst og progression. [25]

Interessant, vi fandt også β-catenin beliggende i kernen af ​​tumorceller med makrofager placeret ved siden af ​​hinanden, hvilket antyder en mulig forbindelse mellem makrofager og den nukleare translokation af β-catenin i tumorceller. β-catenin ved invasive foran GC’ers kan delvis forklares med interaktioner inden tumor mikromiljø. Vi bekræftede

in vitro

at makrofager øge invasionen evne GC celler. Brug immunfluorescens konfokal mikroskopi, vi bestemt lokalisering og akkumulering af β-catenin i kernen i behandlede makrofager. Således har vi mistanke om, at cytokiner udskilles af makrofager inducerer β-catenin nukleare translokation i GC celler, og dermed øge deres invasion evne. Den invasive foran epiteliale tumorer repræsenterer et mikromiljø, hvor makrofager interagerer med parenkymceller ved at producere ekstracellulær matrix og ved at udskille cytokiner og vækstfaktorer, der lokalt fremmer celleproliferation og invasion. [26, 27] Men i vores undersøgelse øgede β-catenin ekspression

in vitro

ændrede ikke proliferation, hvilket viser, at i sig selv ikke er tilstrækkelig til at forstærke tumor malignitet. Dette fund er også vist tidligere, at β-catenin kun fremmer vedhæftning sites til at danne fokalt og stimulerer retningsbestemt migration og invasion af tyktarmskræft celler, men ikke er involveret i udbredelsen af ​​gastriske og prostata kræftceller. [28-30] Ikke desto mindre det stromale celle parakrin modulering af Wnt-signalering i epitelceller er sandsynligvis koordineres af et mere komplekst netværk af fremme og inhibering secerneringsfaktorer. De efterfølgende virkninger af forskellige niveauer af Wnt /β-catenin signalering (og især dem, der påvirker celleproliferation, EMT og lokal invasion), er som i endnu dårligt forstået. β-catenin translokerer til kernen, hvor det binder til transkriptionsfaktorer af T-celle faktor /lymfocyt enhancer faktor (TCF /LEF) familie og initierer transskription af målgener, såsom

cyclin D1

,

c- myc

MMP-7

[31, 32] er involveret i proliferation, tumor invasion og metastase. [33, 34] Vores resultater tyder på, at de signalveje, hvorigennem makrofager fremkalde β-catenin også inducere ekspression af målgener. I overensstemmelse med vores tidligere arbejde, [5] MMP-7 og CD44 var to PCR arrays identificeret efter cokultur med makrofager som differentielt udtrykte gener associeret med metastase af GC-celler. Nedbrydning af den ekstracellulære matrix medieres af matrixmetalloproteinaser (MMP’er) er en afgørende mekanisme under tumorinvasion og metastase. En sådan nedbrydning er nødvendig for at skabe en mikromiljø, som understøtter væksten af ​​primære tumorer og metastaser. Den β-catenin /TCF-kompleks efterfølgende aktiverer en lang række af onkogener, herunder VEGF, c-myc, c-jun, FRA-1 og gastrin, der også kan være involveret i makrofag aktiveret β-catenin downstream events. [35]

En række veje sandsynligvis modulere Wnt /β-catenin pathway og regulering af β-catenin signalering kan tilsvarende kompliceret. Nylige undersøgelser konstateret, at makrofag CM udløser ERK-vejen og Wnt aktiverer ERK i endotelceller. [36, 37] Her fandt vi, at makrofager inducerer phosphorylering af både ERK og AKT i GC-celler. Vi viste, at behandling med AKT-inhibitor, men ikke ERK-inhibitor reducerer β-catenin translokation. Disse resultater indikerer, at Akt spiller roller i makrofag aktiveret β-catenin signalering i gastriske celletyper.

Konklusioner Salg

Kollektivt, de kliniske data antyder, at makrofaginfiltration er korreleret med øget kvalitet og dårligere prognose for GC patienter, som gennemgik radikal resektion. Makrofager kan inducere GC invasionsevne ved at aktivere β-catenin pathway. Derfor undertrykkelsen af ​​makrofag infiltration og undertrykkelse af aktivering af β-catenin vej repræsentere potentielle strategier for behandling af GC.

Støtte Information

S1 Fig. . Effekt af makrofag CM på β-catenin vej

β-catenin akkumuleres i kernen efter behandling med makrofag CM i 30 minutter i AGS og MKN45 celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134122.s001

(TIFF)

S2 fig. Effekt af makrofag CM på protein udtryk for β-catenin down-stream gener af AGS og MKN45 celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134122.s002

(TIFF)

S3 Fig. (A) makrofag CM induceret AKT og ERK-aktivering i N87-celler. (B) N87-celler blev forbehandlet med 10 uM af β-catenin hæmmere:. LY294002 eller U0126 i 1 time og derefter dyrket i nærvær af makrofag CM i 1 yderligere time

AKT, ERK og β-catenin-proteinekspression blev bestemt ved Western blot

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134122.s003

(TIFF)

S4 fig. . Neutraliserende antistof mod TNF-α

N87 celler i nærvær af makrofag CM i 24 timer blev forbehandlet med eller uden TNF-α inhibitor i 1 time

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134122.s004 Hotel (TIFF)