PLoS ONE: Modulerende strukturen af ​​EGFR med UV-lys: Nye muligheder i Cancer Therapy

Abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er et medlem af ErbB-familien af ​​receptortyrosinkinaser. EGFR aktiveres ved binding til fx epidermal vækstfaktor (EGF), hvilket fører til celle overlevelse, proliferation og migration. EGFR overaktivering er associeret med tumorudvikling. Vi har tidligere vist, at lav dosis UVB belysning af cancerceller, der overudtrykker EGFR før tilsætning EGF standset EGFR-signalvejen. Vi viser her, at UVB belysning af det ekstracellulære domæne af EGFR (sEGFR) inducerer protein konformationelle ændringer, disulfidbro brud og dannelse af tryptophan og tyrosin fotoprodukter såsom dityrosin, N-formylkynurenine og kynurenin. Fluorescensspektroskopi, cirkulær dikroisme og termiske undersøgelser bekræfter forekomsten af ​​konformationsændringer. En immunoassay har bekræftet, at UVB-lys fremkalder strukturelle ændringer i EGF bindingssted. Et monoklonalt antistof, som konkurrerer med EGF om binding sEGFR blev anvendt. Vi rapporterer klare beviser for, UVB-lys inducerer strukturelle ændringer i EGFR som svækker den korrekte binding af en EGFR-specifikt antistof der konkurrerer med EGF om binding EGFR, hvilket bekræfter, at 3D-strukturen af ​​EGFR bindingsdomænet lidt konformationelle ændringer efter UV-belysning. Den irradians anvendes, er i samme størrelsesorden som den integrerede intensitet i solar UVB området. Den nye fotoniske teknologi deaktiverer en vigtig receptor og er mest sandsynligt gælder for behandling af forskellige former for kræft, alene eller i kombination med andre behandlinger

Henvisning:. Correia M, Thiagarajan V, Coutinho I, Gajula GP, Petersen SB, Neves-Petersen MT (2014) Modulerende strukturen af ​​EGFR med UV-lys: Nye muligheder i Cancer Therapy. PLoS ONE 9 (11): e111617. doi: 10,1371 /journal.pone.0111617

Redaktør: Federico Quaini, University-Hospital Parma, Italien

Modtaget: 18. maj 2014; Accepteret: 6 okt 2014; Udgivet: 11. november 2014

Copyright: © 2014 Correia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. MC anerkender støtte fra “Fundaço para a Ciência e Tecnologia” (FCT) for ph.d.-stipendium (SFRH /BD /61012/2009) støttet af “Programa Operacional potencial Humano “(POPH) inden for rammerne af” Quadro de referencia Estratégica Nacional “(QREN) og medfinansieres af den Europæiske Socialfond (” Fundo Social Europeu “, FSE). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ErbB-familien af ​​receptortyrosinkinaser (RTK’er) en central rolle i reguleringen af ​​normale cellulære processer, såsom celleoverlevelse, proliferation og migration [1], [2] og har en kritisk rolle i udviklingen og progressionen af cancere [3]. Den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR; ErbB1) er et medlem af denne familie [4]. EGFR binding til ligander, såsom epidermal vækstfaktor (EGF) eller transformerende vækstfaktor alpha (TGF-α) fører til receptordimerisering og aktivering af det intracellulære tyrosinkinasedomæne [1], [2]. Det ekstracellulære domæne af EGFR (sEGFR, opløselig ekstracellulær region af EGFR) omfatter 4 sub-domæner: 2 store homologe bindingsdomæner (I og III), og 2 homologe furin-lignende cysteinrige domæner (II og IV). Domæner I, II og III har vist sig at være direkte involveret i ligandbinding og dimer formation, der forud for mekanismen for signaltransduktion ved RTK’er [1], [5], [6]. Cancer progression er blevet korreleret med stigningen i antallet af EGFR-molekyler på celleoverfladen [7]. Høj udtryk for EGFR er generelt forbundet med invasion, metastase, sene sygdom, kemoterapi modstand, hormonbehandling modstand og generel dårlig terapeutisk resultat. EGFR overekspression har vist sig at være et stærkt prognostisk indikator i hoved og hals, ovarie-, cervical, blære og øsofageal kræft, en beskeden prognostisk indikator i bryst-, tyktarms-, mave- og endometriecancer og en svag prognostisk indikator i ikke-småcellet cancer [7]. EGFR er målet for mange kemoterapeutiske tilgange, fordi EGFR aktivering resulterer i celle signalering kaskader, der fremmer tumorvækst. Inhibering af EGFR funktion er derfor en rationel behandling tilgang. Typiske kemoterapeutiske midler er EGFR tyrosinkinaseinhibitorer, som konkurrerer med ATP ved det intracellulære tyrosinkinasedomæne, og monoklonale antistoffer (mAb’er), som forhindrer ligandbindende eller receptordimerisering. Blokere bindingen af ​​EGF til EGFR kan ophæve cancerproliferation, invasion, metastase, angiogenese og inhibering af apoptose [8].

Vi har tidligere rapporteret, at UVB belysning (280 nm, 0,35 W /m

2 i 30 min) af kræftceller overekspression EGFR førte til anholdelsen af ​​den EGFR signalvejen [9]. Proof-of-concept er blevet dokumenteret på celle linjer A431 (human epidermoide carcinomceller) og Cal39 (afledt af humane vulva pladecellekræft celler). Den bestråling anvendte var lavere end den samlede UVB solens indstråling [10]. UVB forhindrede EGF induceret aktivering af EGFR, afskaffelse phosphorylering af EGFR intracellulære domæne og andre centrale nedstrøms signalering proteiner, såsom AKT (Protein Kinase B) og mitogenaktiveret proteinkinaser (ERK1 og 2). AKT spiller en central rolle i f.eks glucosemetabolisme, apoptose, celleproliferation, transkription og cellemigration. AKT er involveret i cellulære overlevelse veje ved at inhibere apoptotiske processer [11] – [16]. De ERK-kinaser handle på en signaleringskaskade, der regulerer cellulære processer såsom proliferation, differentiering, og cellecyklus progression [17].

En af de mulige årsager til den observerede UV-lys-induceret anholdelsen af ​​EGFR signalvejen er UVB-induceret fotokemi, hvilket fører til konformationelle ændringer i EGFR hvilket sandsynligvis forhindrer korrekt binding til EGF. Vores tidligere arbejde med UVB-induceret fotokemi i proteiner (bølgelængder anvendes 275-295 nm) [18] – [22] understøtter denne hypotese. UVB excitation af aromatiske rester i proteiner fører til afbrydelse af disulfidbroer og til dannelsen af ​​fotoprodukter, såsom N-formylkynurenine (NFK), kynurenin (Kyn) [23], [24] og dityrosin (DT) [25] – [27] (se figur 1). Sådanne reaktioner vil sandsynligvis fremkalde strukturelle ændringer i proteiner, som kan forringe deres aktivitet [22]. Proteiner, der er rig på aromatiske rester og disulfidbroer sandsynligvis har deres struktur betydeligt forringet på langvarig UVB excitation. sEGFR er meget rig på disulfidbroer sammenlignet med den naturlige gennemsnitlige overflod af disulfidbroer i proteinstrukturer størrelse sEGFR, som det vil blive vist i resultatafsnittet. Den% af disulfidbroer i sEGFR er cirka 13 gange højere end forventet for et protein af sin størrelse. De forventede gennemsnitlige resultater er tidligere blevet rapporteret af vores gruppe efter et omfattende analyser af de elementer i disulfidbroer til stede i 131 ikke-homologe enkelt kæde proteinstrukturer [28]. Endvidere det ekstracellulære domæne af sEGFR har 40 aromatiske rester og 25 disulfidbroer pr monomer og mange af de aromatiske rester er i tæt nærhed af disulfidbroer (se figur 2). Det er derfor sandsynligt, at UV-belysning af dette protein vil føre til disulfidbro brud og fotoprodukter. Denne hypotese vil blive testet i vores nuværende papir.

(A) Crystal struktur af EGFR ekstracellulære domæne (1ivo.pdb, kæde A) [1]. De disulfidbroer og aromatiske rester atomer vises som CPK: SS broer i gul, Trp i grøn, Tyr i violet (Prøv 246 og Tyr 251 vises i lyserød) og Phe i cyan. Kun 18 ud af 25 SS broer, 5 ud af 6 Trp rester, 13 ud af 16 Tyr rester og 17 ud af 18 Phe rester vises da nogle rester der mangler i det foreløbige budgetforslag fil. (B) krystalstrukturen af ​​en 1:01 kompleks mellem human EGF og den dimere form af EGFR ekstracellulære domæne (1ivo.pdb, kæde A og B og 2 EGF-molekyler [1]). EGF vises i rødt. (C) Zoom ind grænsefladeregion stede i den dimere af EGFR (ekstracellulære domæner). Afstande blandt nogle af de aromatiske rester og de nærliggende disulfidbroer vises også. (D) krystalstrukturen af ​​en 1:01 kompleks mellem human EGF og den dimere form af EGFR ekstracellulære domæne. (1ivo.pdb, kæde A og B og 2 EGF molekyler [1]) er EGF vist i rødt. I det højre panel alle atomer vises som CPK. EGF docking til sEGFR indebærer omfattende ikke-kovalente kontakter.

de farerne ved overeksponering for sollys er blevet godt offentliggøres, mindre opmærksomhed er blevet givet til de sundhedsmæssige fordele ved UV eksponering. Virkningerne af UV lys på biomolekyler, celler og væv vil afhænge af afgivne energi per arealenhed. UVB (280-315 nm) stråling er den primære bidragsyder til vitamin D produktion, som har en beskyttende virkning i colon, prostata og brystcancer [29], [30]. Udsættelse for sollys i lave doser har også været forbundet med forbedrede kræft overlevelsesrater [31], [32]. UV-lys har været anvendt med succes behandle rakitis, psoriasis, lupus vulgaris, vitiligo, atopisk dermatitis og lokaliseret sklerodermi og gulsot (World Health Organization De kendte sundhedsmæssige virkninger af UV

Ultrav Radiat INTERSUN Program -….. FAQ

på https://www.who.int/uv/faq/uvhealtfac/en/index1.html). Der er ingen direkte og afgørende beviser, der tyder på en øget risiko for hudkræft fra UVB behandlinger for psoriasis, hvis stråledosis respekteres. UV-lys er ved at blive brugt til at behandle kutant T-celle lymfom (American Cancer Society, 2011 på https://www.cancer.org). Denne terapi er blevet forbedret af Food and Drug Administration (FDA, USA). De beskyttende virkninger af regelmæssig weekend soleksponering er blevet rapporteret, især i tilfælde af lemmer tumorer [33]. Melanom er hyppigere blandt mennesker med indendørs erhverv end blandt folk, der har udendørs aktiviteter (uden solskoldning) såsom landmænd, fiskere og børn, der spiller udendørs [34], [35]. Hudkræft er stadig stigende, men dette er et resultat af udsættelse for UV-lys både ved akut overdosering (forårsager solskoldning) og livslang kumulativ eksponering [36]. Det er hovedsageligt UVB del af solstrålingen som giver erythem, melanogenese (melanin produktionen, der fungerer som en solcreme beskytter mod DNA lysbeskadigelse og erytem), vitamin D syntese, og ikke-melanom hudcancer, mens melanom er sandsynligt at være forårsaget af UVA [37]. Jones et al (1987) fandt, at blandt de UVA bølgelængder, 365 nm havde den højeste mutagene virkning [38]. UVA fluency satser er flere gange højere for solsenge end i tilfælde af direkte solstråling [39]. Ovenstående eksempler dokumenterer, at de sundhedsmæssige virkninger af UV eksponering er dosis og bølgelængde afhængig.

Målet med det foreliggende arbejde er at undersøge, om en lav dosis af UVB-lys kan fremkalde strukturelle ændringer i EGF bindende site af EGFR der kan forringe den korrekte binding af molekyler, såsom et specifikt antistof, som er kendt for at konkurrere med EGF i EGFR binding. Hvis observeret, vil dette give os indsigt i, hvorfor UVB belysning (280 nm) af kræftceller overekspression EGFR førte til anholdelsen af ​​den EGFR signalvejen [9]. Den UVB bestråling anvendes, er i samme størrelsesorden som den samlede bestråling af sol UVB. Fluorescensspektroskopi og cirkulær dikroisme blev udført for at detektere UVB inducerede konformationelle ændringer. Termiske udfoldningskurve undersøgelser er blevet udført for at bestemme smeltepunktet af proteinet før og efter belysning. Lys induceret brud på disulfidbroer er blevet kvantificeret, og er blevet opdaget dannelsen af ​​Trp /Tyr fotoprodukter. En bindende immunoassay blev udført for at udlede virkningerne af UVB belysning af strukturen af ​​EGF-bindingssted. Vores undersøgelse bekræfter, at lav dosis UVB (280 nm) belysning af sEGFR inducerede strukturelle ændringer i EGFR bindende domæne, som svækkede bindingen af ​​et specifikt antistof kendt for at konkurrere med EGF i EGFR binding til det pågældende domæne. Vi adresserer de gavnlige virkninger af UV-lys, dets nuværende anvendelse til behandling af sygdomme og potentialet i vores formodede nye fotoniske terapi til behandling af lokaliserede tumorer associeret med overekspression af UV følsomme cellulære receptorer.

Resultater

Tre-dimensionelle struktur af monomer og dimer sEGFR

i figur 2A vises 3D-strukturen af ​​monomer sEGFR (1ivo.pdb, kæde A) bundet til epidermal vækstfaktor (EGF, med rødt) . sEGFR indeholder 25 SS broer, 6 Trp rester, 16 Tyr-rester, og 18 Phe-rester, der vises som CPK: SS broer i gult, Trp i grøn, Tyr i violet (Tyr246 og Tyr251 i pink) og Phe i cyan. Kun 18 ud af 25 SS broer, 5 ud af 6 Trp rester, 13 ud af 16 Tyr rester og 17 ud af 18 Phe rester vises da nogle rester der mangler i det foreløbige budgetforslag fil. Adskillige aromatiske rester er placeret i umiddelbar rumlig nærhed af SS obligationer.

I figur 2B vises 3D-strukturen af ​​EGFR dimer (1ivo.pdb, kæder A og B) er dannet ved binding EGF (med rødt). Dimergrænsefladen er rig på disulfidbroer og aromatiske rester (fig. 2B). Rester Tyr246 og Tyr251 (figur 2B, i pink) fra en kæde, der er flettet sammen med de samme rester fra den anden kæde. En zoom ind i en af ​​kæderne er vist i figur 2C og afstande mellem aromatiske rester og disulfidbroer er vist. EGF docking til EGFR er vist i figur 2D (EGFR monomer). Samspillet mellem EGFR og EGF synes at være stærkt afhængig af Van der Waals-interaktioner. Nogle af disse interaktioner er π-Tr interaktioner, såsom interaktionen mellem Phe357 (i cyan) af sEGFR og Tyr13 (i violet) af EGF (5 Å).

Protein Bioinformatik

Figur 3 vises den del af disulfidbroer til stede i sEGFR og afhængigheden af ​​gennemsnitlig del af disulfidbroer på proteinet kædelængde [28]. Den forventede gennemsnitlige brøkdel af disulfidbroer til proteiner med sekvenslængde 600-650 rester er ~0.3%, mens i sEGFR (622 aa) er det -4%, hvilket bekræfter, at dette protein er overordentlig rig på disulfidbroer. De forventede gennemsnitlige resultater er tidligere blevet rapporteret af vores gruppe efter at gøre en omfattende analyse af de elementer i disulfidbroer til stede i 131 ikke-homologe enkelt kæde proteinstrukturer [28].

brøkdel af disulfidbroer blev beregnet som antallet af disulfidbroer, der findes i et protein divideret med proteinsekvensen længde (antal aminosyrer) x 100. fraktionen af ​​disulfidbroer til stede i den monomere ekstracellulære domæne af EGFR vises.

steady State fluorescens

fluorescensemissionen intensitet sEGFR ved 350 nm falder efter kontinuerlig 280 nm excitation (figur 4A). Den kinetiske spor er bedst monteret af en bi-eksponentiel model (figur 4A og metoder). Den geometriske middelværdi fejl R

2 var 0,99774. Værdierne inddrives fra fitting til C1 og C2 var 367240,44 ± 1182,23 og 208449,95 ± 1054,90 hhv. Hastighedskonstanterne for fluorescensemission intensitet fald K1 og K2 monteret værdier var 117,63 ± 0,71 min-1 og 12,20 ± 0,10 min-1, henholdsvis.

(A) fluorescensemission intensitet kinetik ved 350 nm af human ekstracellulær EGFR (sEGFR) prøve i løbet af 75 min UV-belysning ved 280 nm. (B) Fluorescens-emission spektre af sEGFR prøver opnået ved 295 nm excitation efter 280 nm belysning til 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min. (C) Fluorescence excitation spektre af sEGFR prøver optaget med emission fastsat til 334 nm excitation efter 280 nm belysning til 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min.

Emission Spectra (excitation 280 nm og 295 nm).

Emission spektre af sEGFR blev registreret ved 280 nm excitation før og efter kontinuerlig 280 nm belysning (15 min, 30 min, 45 min og 75 min ved 2,5 W /m

2) (ikke vist). Et fald i intensiteten af ​​fluorescensemissionen ved ~337 nm, hvor Trp og Tyr udsender, observeres på grund af kontinuerlig belysning. Intensiteten emission ved 337 nm falder med 43% og 74% efter 15 min og 75 min af kontinuerlig 280 nm belysning, hhv. Bølgelængden af ​​den mest intense top centreret ved 337 nm forbliver konstant.

emissionsspektre af sEGFR registreres ved 295 nm excitation før og efter kontinuerlig 280 nm belysning (15 min, 30 min, 45 min og 75 min ) er vist i figur 4B. Et fald i intensiteten af ​​fluorescensemissionen ved ~337 nm, hvor Trp udsender, observeres. Emissionen intensitet sEGFR ved 337 nm falder med 42% og 77% efter 15 min og 75 min med kontinuerlig 280 nm belysning hhv. Bølgelængden af ​​den mest intense top centreret ved 337 nm, til rød-skift til 343 nm efter 75 min af belysning.

excitationsspektre (emission 334 nm).

I figur 4C er vises excitationsspektre af sEGFR med fluorescensemission fastsat til 334 nm, før og efter kontinuerlig 280 nm belysning af proteinet i forskellige tidsperioder: 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min. Trp og Tyr absorption bidrager til dette spektrum. Kontinuerlig 280 nm belysning fører til et progressivt fald i fluorescens excitation intensitet. Efter 15 min og 75 min af belysning, excitation intensitet ved 282 nm falder med 40% og 71%, hhv. Korrespondenten normaliserede excitation spektre (ikke vist) viser ingen skift i bølgelængden med maksimal excitation intensitet (~282 nm).

Fluorescens baseret protein termiske udfoldning studier.

fluorescensemission intensitet ved 330 nm (exc. ​​295 nm) af en frisk sEGFR prøve (ikke-Illum.) og belyst sEGFR prøve (75 min ved 280 nm) blev overvåget fra 4 ° C til 90 ° C og fra 90 ° C til 4 ° C (se fig. 5). For begge prøver reducerer fluorescensemissionen intensitet ved opvarmning. En overgang mellem 65-75 ° C observeres for den ikke-oplyste sEGFR. Data er monteret ved anvendelse af en modificeret Boltzmann funktion (se metoder). Den geometriske middelværdi fejl for montering R

2 var 0,99774. Værdierne inddrives fra fitting til

A

1,

B

1,

A

2,

B

2 og

dx

var 1,06202 ± 0,0014, 0,45482 ± 0,02255, -,00426 ± 5.41E-04, -,00296 ± 2.72E-04 og 1,74 ± 0,17 hhv. Den genvundne parameter

x

0 (69,7 ° ± 0,24 ° C C) svarer til midtpunktet af overgangen, dvs. til smeltepunktet af proteinet. Denne værdi er i overensstemmelse med vendepunktet værdier fra den anden afledede af de monterede data (ikke vist). Den anden afledte er nul (vendepunkt) inden for intervallet 68,3-69,2 ° C. Sådan overgang er ikke observeret for den belyste prøve. Desuden er ingen overgang observeret for begge prøver, når køling af protein fra 90 ° C til 4 ° C.

Ikke belyst (ikke Illum.) Og UV belyst (Illum. For 75 min) human ekstracellulær EGFR (sEGFR ) prøverne blev opvarmet fra 4 ° C til 90 ° C. Monteret værdier (ubelyste prøve) blev opnået ved anvendelse af en modificeret Boltzmann funktion (se afsnittet Resultater). Overgangen midtpunktet udvundet fra montering var på 69,72 ± 0,24 ° C.

Tid Løst fluorescens.

henfald gange (τ

i) og præ-eksponentielle faktorer (

f

i) udvindes fra tidsopløst intensitet henfalder til kontrol sEGFR prøve (75 minutter i mørke, negativ kontrol, NC) og den belyste sEGFR prøve (Illum. i 75 minutter ved 280 nm) ved pH 7,5 er givet i tabel 1. Figur 6 viser de eksperimentelle data, pasform og rester under forudsætning af tre levetid henfalder til sEGFR kontrolprøve (NC). Værdien af ​​χ

2 faldt betydeligt, når skrider fra en en levetid komponent passer til to og tre komponenter. Fluorescensen betyde levetid sEGFR er vist i tabel 1. Ikke-belyst sEGFR viser tre levetider: 1,04 ns, 2,74 ns og 6,23 ns med intensitet fraktioner af 25,6%, 53,1% og 21,1%, henholdsvis. Ved belysning, bidrag af den korteste levede 1,04 ns arter steg fra 25,6% til 30,6%, blev bidraget fra de 2,74 ns arter holdes konstant, og bidraget fra de længere levede arter faldt fra 21,1% til 16,4%. Desuden levetid længere levede komponent steget fra 6,2 ns til 7,0 ns mens levetiden for de to andre komponenter forblev konstant.

Time-løst intensitet henfald data, montering kurve og residualer opnået ved hjælp af ISS rutine for kontrol sEGFR prøve (holdt i mørke i 75 min, negativ kontrol, NC).

Excitation Spectra (emission 400 nm).

i figur 7A vises excitations-spektre (emission ved 400 nm) opnået før og efter kontinuerlig 280 nm belysning (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 62 min og 75 min). Spektre blev optaget med henblik på at kontrollere tilstedeværelsen af ​​NFK, dityrosin og Kyn (fig. 1). I tabel 2 vises deres absorbansværdier og fluorescensemission egenskaber. Ved 0 min, er en excitation peak observeret centreret ved ~281 nm. Dens intensitet henfalder ved UV-belysning af sEGFR, faldende 52% efter 75 min. Men belysning af sEGFR fører til en stigning af fluorescens excitation over 305 nm. Efter 75 min, fluorescerende excitation intensitet steg 115% ved 315 nm, hvor dityrosin maksimalt absorberer (Abs

max ved 316 nm, [40], se tabel 2), 149% ved 322 nm, hvor NFK maksimalt absorberer (Abs

max ved 321 nm, [23], se tabel 2) og 173% ved 360 nm, hvor Kyn maksimalt absorberer (Abs

max ved 360 nm, [23], se tabel 2).

(A) fluorescensemissionsspektrer af human ekstracellulær EGFR (sEGFR) samples ved 320 nm excitation efter 280 nm belysning til 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min. (B) Fluorescens-emission spektre af sEGFR registreres ved 360 nm excitation efter 280 nm belysning til 0 min, 15 min, 30 min, 45 min og 75 min. (C) Fluorescence excitationsspektre af sEGFR opnået med fluorescensemission fastsat til 400 nm efter 280 nm belysning til 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min.

emission Spectra (excitation 320 nm).

for at kontrollere dannelsen af ​​dityrosin (DT) og NFK, blev emission spektre fås ved 320 nm excitation før og efter 280 nm belysning (fig. 7B). observeres en stigning i fluorescensemission intensitet ved 400-405 nm (exc. ​​320 nm). maksimum Den fluorescens emission er centreret ~400 nm, svarende til maksimalt udledningen af ​​DT (Em

max ved 400-409 nm, [25], [40], se tabel 2) og en spektral region, hvor NFK kan også udsender (for NFK, Em

max ved 400-440 nm [23], tabel 2). Efter 75 min, fluorescensemission intensitet ved 400 nm stiger med 129%. En lille top emission ved ~368 nm observeres i spektrene opnået ved 0 min og 15 min af belysning på grund af Raman bidrag vand. Raman spektrale korrektioner ikke helt fjerne dette højdepunkt.

Emission Spectra (excitation 360 nm).

For at kontrollere tilstedeværelsen af ​​kynurenin (Kyn) (Abs

max ved 360 nm , [23], tabel 2) i sEGFR, emissionsspektre blev opnået ved 360 nm excitation før og efter 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min på 280 nm belysning (fig. 7C). Kyn absorberer maksimalt ved 360-365 nm og fluorescerer maksimalt ved ~434-480 nm ([23], tabel 2). Kontinuerlig UVB belysning af sEGFR fører til en stigning af fluorescens centreret ved ~430-435 nm. Fluorescensintensiteten ved 430 nm steg 53% og 172 efter 15 min og 75 min belysning hhv.

Thiol gruppens kvantificering

For at bekræfte, at UV-belysning af sEGFR har ført til SS forstyrrelser er koncentrationen af ​​opløsningsmiddeltilgængelige thiolgrupper er blevet bestemt med Ellmans assay for en kontrol sEGFR prøve holdt i mørke i 75 min (negativ kontrol, NC) og for en prøve tidligere belyst ved 280 nm i 75 min. Det detekterede koncentration af frie thiolgrupper er 2,9 gange højere i det oplyste prøve (fig. 8). Frie thiolgrupper i belyst sEGFR er ~ 1 uM.

kontrolprøve af sEGFR blev holdt i mørke i 75 min (negativ kontrol, NC). er blevet påvist frie thiolgrupper bruge Ellmann s analysen.

cirkulær dikroisme studier

I figur 9A vises CD spektre af frisk sEGFR (ikke-Illum.) og belyst sEGFR ( 75 min ved 280 nm). CD-spektret fjern-UV af ubelyste sEGFR viser nogle af de klassiske fjern-UV træk ved sekundær proteinstruktur, med tilstedeværelsen af ​​en dobbelt minimum ved 208-210 nm og 220-222 nm, karakteristisk for α-helix indhold . p-sheet strukturelle indhold (karakteristisk minimum ved ~218 nm) kan også bidrage til den anden minimum ved 220-222 nm [41]. Langvarig excitation med UVB lys fører til et fald i ellipticiteten intensiteten ved 205-225 nm og en spektral forskydning. Den ellipseform på 207,5 nm og ved 220 nm er faldet med 9% og 20%, hhv. Endvidere har den første negative peak flyttet fra 207,5 nm til 203 nm.

(A) Far UV CD-spektre blev registreret for en frisk sEGFR løsning (non Illum.) Og en sEGFR prøve, der tidligere blev belyst ved 280 nm (Illum. i 75 min). (B) Cirkulære dichroim termiske udfoldningskurver af fersk sEGFR (ikke-Illum.) Og UVB belyst sEGFR (Illum i 75 min.) Blev opnået ved opvarmning fra 4 ° C til 90 ° C (1 ° C.min

– 1). Ellipticiteten signal blev konstant overvåget ved 220 nm. Smeltetemperaturen af ​​ikke oplyste sEGFR, som svarer til overgangen midtpunktet af kurven, blev genvundet ved montering kurven med en Boltzmann-funktion (se metoder).

Cirkulær dichroisme baseret protein termisk udfoldning undersøgelser.

ellipticiteten intensitet ved 220 nm af frisk sEGFR (non Illum.) og belyst sEGFR (75 min ved 280 nm) blev kontinuerligt overvåges fra 4 ° C til 90 ° C (fig. 9B). For begge prøver falder efter opvarmning ellipticiteten intensitet ved 220 nm. En overgang med midtpunktet mellem 60-70 ° C observeres for den ikke-belyste sEGFR prøve. Data er monteret af en Boltzmann-funktion (se metoder). Den geometriske middelværdi fejl for montering R

2 var 0,99921. Værdierne inddrives fra fitting til

A

1,

A

2 og

dx

var -0,96 ± 9.97E-4, -0,83 ± 0,002, og 2,59 ± 0,08 , henholdsvis. Temperaturen af ​​mid-overgang

x

0 monteret værdi var 64,70 ± 0,07 ° C, hvilket svarer til smeltetemperaturen af ​​proteinet. Denne værdi er i overensstemmelse med den værdi, genvundet ved fluorescens spektroskopi vist i figur 5. En sådan overgang er ikke observeret for den belyste prøve.

EGFR bindende immunassay

Et bindende immunoassay blev anvendt til indirekte adgang virkningerne af UV-belysning på strukturen af ​​sEGFR bindingsstedet til EGF /TGF-α. Resultater, der vises i figur 10 viser, at ikke-belyste sEGFR binder LA1 anti-EGFR (bane “No-UV”, frisk prøve, og “NC”, negativ kontrol, prøve holdt i mørke i 75 min). sEGFR prøve belyses med 280 nm lys i 75 min ikke længere binder LA1 anti-EGFR, bekræftet af fuldstændig forsvinden af ​​sEGFR bånd (figur 10, bane “UV”). To sæt dobbelte prøver blev analyseret. Signal intensitetsprofiler langs proteinbåndene er vist. Den observerede i de regioner, hvor belyst sEGFR var til stede ( “UV” baner) intensitet er inden for det observerede støjniveau (støj intensitet fra ~0.02 til 0,2).

I hver brønd, præcis 1,4 ug ikke belyst ( “No-UV”), UV belyst i 75 min ( “UV”) og negative kontrol ( “NC”) sEGFR prøver blev indlæst. Prøver indlæst på godt 1-3 er dubletter prøver 4-6, men blev behandlet selvstændigt efter UV-belysning. Intensiteten profil langs brøndene viser, at signalet er observeret i brøndene med ikke-belyst protein, men intet signal er til stede i brøndene, der indeholder UV-belyst proteinprøver.

Diskussion

UVB excitation af aromatiske rester fører til dannelsen af ​​fotoprodukter. Tryptofan kan danne tryptofanyl kation-radikal, N-formylkynurenine (NKF) og kynurenin (Kyn) (fig. 1). NFK og Kyn er af særlig betydning, da de er fotosensibilisatorer, der kan generere reaktive oxygenarter (ROS) ved UV absorption [42], hvilket yderligere bidrager til protein strukturelle skader. Tyrosinrester vides at blive omdannet til eksempel tyrosil radikaler, dityrosin, trityrosine og pulcherosine (fig. 1). Disse reaktioner er sandsynligvis føre til ændringer eller at fuldføre tab af protein struktur og funktion [22], [43]. UVB excitation fører også til elektron udstødning fra sidekæderne af aromatiske rester [20], [24], [44] – [46]. Den elektron kan opfanges af disulfidbroer, hvilket fører til dannelse af en transient disulfid elektron addukt RSSR

• – (jf ordninger 1-8, [49]), som ved dissociering danner frie thiolgrupper (skema 9, [ ,,,0],47]). Naturen har holdt aromatiske rester i rumlig nærhed til disulfidbroer (SS) i proteiner [19], [28], hvilket gør forstyrrelse af SS en sandsynlig begivenhed på UV excitation. Ordningerne nedenfor resumeres nogle af fotoprodukter dannet som bidrager til SS forstyrrelser, hvilket fører til kropsbygning ændringer, der kan føre til tab af proteinfunktion. For yderligere oplysninger se venligst refereres litteratur [21], [22], [24]. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)

Proteiner rige på aromatiske rester og disulfidbroer er mest sårbare over for fotokemi og skader. sEGFR er et sådant protein. Det har i alt seks Trp, 16 Tyr, 18 Phe rester og 25 disulfidbroer (figur 2A). Interessant aromatiske rester og disulfidbroer spiller en kritisk strukturel rolle på dimergrænsefladen (figurerne 2B, 2C og 2D) at UVB-induceret fotokemi vil højst sandsynligt forringe EGFR dimerisering. Nærheden mellem aromatiske rester og disulfidbroer (Figur 2C) fremmer elektron overførsel fra de aromatiske rester til broerne, der fører til deres forstyrrelser. UV-induceret protein inaktivering involverer hurtig og kortrækkende elektron overførsel mellem photoexcited aromatiske rester og nærliggende disulfidbroer [20], [44], [45], [48]. Zhi Li et al. [49] viste, at hurtig elektronoverførsel er i overensstemmelse med direkte elektronoverførsel mellem triplet tryptophan og en nærliggende disulfidbro, hvilket fører til RSSR

• – og sandsynligvis bro brud (ordninger 8 og 9). Som vist i figur 3, er proteiner så store som sEGFR (600-650 aa) observeret at have en gennemsnitlig del af disulfidbroer ikke større end ~0.3%. Dette skyldes formentlig den stabiliserende virkning af det store hydrofobe kerne.