PLoS ONE: Organisationen af ​​Enzyme Koncentration hele Metabolic Netværk i Cancer Cells

Abstrakt

Hurtige fremskridt inden massespektrometri har tilladt for estimater af absolutte koncentrationer på tværs af hele proteomer, tillader afhøring af mange vigtige biologiske spørgsmål. Her fokuserer vi på en kvantitative aspekt af human cancer celle metabolisme, der har været begrænset af en mangel på tilgængelige data på den overflod af metaboliske enzymer. Vi integrerer data fra de seneste målinger af absolut proteinkoncentration at analysere statistikkerne for protein overflod i hele menneskets stofskifte netværk. På globalt plan, finder vi, at enzymerne i glycolysen omfatter cirka halvdelen af ​​den samlede mængde af metaboliske proteiner og kan udgøre op til 10% af hele proteom. Vi bruger derefter denne analyse til at undersøge flere udestående problemer i kræft stofskifte, herunder omlægning af glykolytisk flux for biosyntese, relative bidrag kvælstof tilegne veje, og oprindelsen af ​​cellulære redoxpotentiale. Vi finder mange konsistenser med nuværende modeller, identificere flere uoverensstemmelser, og find almindeligheder, der rækker ud over nuværende forståelse. Sammen vores resultater viser, at en forholdsvis simpel analyse af den overflod af metaboliske enzymer var i stand til at afsløre mange indblik i organiseringen af ​​den menneskelige kræftcelle metaboliske netværk

Henvisning:. Madhukar NS, Warmoes MO, Locasale JW (2015 ) Organisationen af ​​Enzyme Koncentration hele Metabolic Netværk i kræftceller. PLoS ONE 10 (1): e0117131. doi: 10,1371 /journal.pone.0117131

Academic Redaktør: Vasu D. Appanna, Laurentian University, CANADA

Modtaget: September 16, 2014 Accepteret: December 19, 2014; Udgivet: 26 januar 2015

Copyright: © 2015 Madhukar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: CPC, Kinetic og Gibss frie energier leveres som supplerende materiale i S1 og S2 Tables. LTQ protein kvantificering data, hvorfra CPC data, der anvendes i dette manuskript er afledt findes på: https://wzw.tum.de/proteomics/nci60

Finansiering:. JWL anerkender støtte fra National Institutes of Health ( https://www.nih.gov/) awards CA168997 og AI110613 og den Internationale Life Sciences Institute. NSM blev støttet af Tri-Institutional Training Program i Computational Biology and Medicine (https://www.triiprograms.org/cbm/), Program nummer: 1T32GM083937. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metabolisme udgør et grundlæggende element i celle fysiologi. Det giver mulighed for behandling af næringsstoffer ved kemisk reaktion netværk, hvilket resulterer i produktion af energi og biosyntetiske komponenter og regulering af signaltransduktionsprocesser ved at påvirke niveauet af metabolitter, der styrer aktiviteten af ​​proteiner. Dens funktion er afgørende for menneskers sundhed, og dens afvigende status er kendetegnende for mange sygdomme [1,2]. En kvantitativ, prædiktiv forståelse af stofskiftet har utallige muligheder [3-5], men har været begrænset af manglen på tilgængelige data på niveau med metabolitter, enzym udtryk og flux.

En væsentlig begrænsning i denne systemer niveau forståelse skyldes manglen på kvantitative målinger af protein overflod [6]. Den absolutte proteinkoncentration er afgørende for forståelsen enzymkinetik og derfor flux gennem en metabolisk vej [7]. For enhver kemisk reaktion, der involverer et enzym, satsen for denne reaktion er proportional med enzymet overflod, og dermed den absolutte koncentration af et enzym steder afgrænser på metabolisk flux og fungerer som et rimeligt skøn over sin virksomhed og, når der sammenlignes med andre enzymer i konkurrencen for et substrat, kan anvendes som et estimat af den relative anvendelse af denne substrat. Andre faktorer, såsom Michaelis-konstanten og omsætning satser er også vigtige, men hver af disse parametre er uafhængig af enzym koncentration. Således en analyse af protein-koncentrationer på tværs og inden for veje og i forhold til enzymer, der udnytter det samme substrat, kan give estimater af relative flux stammer fra de sammenlignede enzymer.

Tidligere undersøgelser har gennemført omfattende analyser af transkriptionelle overflod af metaboliske gener [3]. Disse undersøgelser har fokuseret på ændringer, der ledsager onkogen transformation og har udækkede indsigt i de veje, gener og reaktioner, der er ændret [1,3,8-11]. Alligevel er det også blevet vist, at der er i mange tilfælde kun en beskeden sammenhæng mellem transkript og protein overflod grund mange faktorer-såsom translationel regulering og proteinstabilitet-, der påvirker forholdet mellem mRNA og protein [12-14]. Desuden har disse undersøgelser fokuseret på tumor-normal sammenligninger stedet for koncentrationsfordelinger på tværs af netværket, der har en anden, men ikke desto mindre relevant, biologi i forbindelse med sin analyse.

Fremskridt i massespektrometri baseret proteomanalyse har tilladt for i dybden identifikation og kvantificering af mammale proteomer fra biologiske prøver [15-17]. Disse teknologier er også tilladt for estimater af protein overflod fra biologiske prøver ved hjælp af regression modellering. Med disse data ved hånden, er det så muligt at vurdere fordelingen af ​​proteinkoncentrationer på tværs af metaboliske netværk og gøre kvantitative evalueringer af enzym overflod tværs veje, ved filial punkter, hvor metaboliske flusmidler afviger, og for enzymer, der benytter fælles substrater. Vi har derfor gennemført denne analyse og udækket flere overraskende resultater vedrørende tilrettelæggelsen af ​​proteinkoncentrationer på tværs af menneskelige metaboliske netværk.

Metoder

Curation af en Metabolic, Pathway-Based, Proteome

til at begynde vores analyse fandt vi NCI-60 cellelinje panel, som er et sæt af cellelinier udviklet og vedligeholdes af National Cancer Institute, der er blevet anvendt i udstrakt grad til integrerede molekylære analyser og narkotika følsomhed profilering [18]. Den proteomisk kvantificering for NCI-60 panel gør brug af en standardiseret celleprotein kopiantal (CPC) metric (se S1 tabel), som er afledt fra Label Free Kvantificering (LFQ) kvantificering fra Gholami et al. [19]. Den NCI-60 proteom datasæt, der indeholder LFQ data er frit tilgængelig på https://wzw.tum.de/proteomics/nci60. Vi begyndte ved at frafiltrere proteiner i CPC datasæt, der blev påvist i kun én prøve eller vævstype. Disse eksempler proteiner indeholdt også en langt lavere gennemsnitlig CPC end alle andre prøver (~ 3000 CPC vs 71.000 CPC) angiver, at de ikke kan være relevante for at gøre de globale forudsigelser på stofskiftet. Hver protein i denne liste blev kortlagt til 86 kendte metaboliske veje ved hjælp af Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg, version 69,0 1. januar, 2014) kortlægning af gener til veje. Enhver protein, der var indeholdt i mindst én sti indgik som en del af den metaboliske proteomanalyse. De gennemsnitlige CPC-værdier på tværs af alle cellelinier for hver metaboliske og ikke-metabolisk protein blev anvendt til at beregne den metaboliske procentdel. De pathway procentdele blev beregnet på lignende måde, dog kunne ét protein være involveret i flere veje, og således at summen af ​​alle procentdele svarer ikke nødvendigvis 100%. For at beregne de forskellige sandsynlighed fordelingsfunktioner af forskellige protein klasser, blev alle CPC målinger på tværs af cellelinjer indlæst i PRISM (version 6.03), med et standardiseret analyse computing bin centre.

Glycolysis Pathway analyse

for hvert involveret i Glycolysis /glukoneogenese vej fra Kegg databasen protein, blev fordelingen klassificeret som CPC-værdier på tværs af alle cellelinjer. Kernen glycolytiske vej blev defineret som de progressive trin, gennem hvilke glucose ind glycolyse omdannes til lactat eller kan omdirigeres til flere forskellige biologiske veje. For at visualisere forskellene i protein tæller hele kernen glycolyse blev en pathway oprettet i CytoScape (version 3.1.1) med størrelsen af ​​knudepunkter svarer til den gennemsnitlige CPC af de respektive proteiner [20,21].

Branch punkt analyse

for at isolere metaboliske veje indeholdende forgrening trin, udnyttede vi Recon 2.2 støkiometri matrix til adskilte veje, hvor en enkelt metabolit fungeret som en reaktant til flere forskellige reaktioner-disse blev defineret som vore filialer [ ,,,0],22]. Da nogle grene kunne omfatte mere end én reaktant metabolit, vi udelukkede nogen gentagelser vores søgen produceret. For hvert sæt af grene (hvert sæt har samme reaktant metabolit) vi kun medtaget dem, hvor alle katalyserende enzymer indgik i vores metaboliske proteomanalyse. Vi beregnede to målinger fra CPC’er for disse forgreningsenzymer, hver baseret på antallet af betragtes enzymer. For alle forgrenende veje rangeret vi de involverede enzymer på basis af deres gennemsnitlige CPC for alle cellelinjer, med forgreningen divergens (BD) score defineret som: for forgreningspunkter, hvor der var mindst tre forskellige produkttyper muligheder, vi redid denne beregning, denne gang herunder de øverste tre klassificeret enzymer i stedet for blot de øverste 2.

Vi derefter adskilt grenene i 2 yderligere kategorier-én måde hælder veje, hvor forgrenede scoringer produceret en score ovenfor. 8, og ligeligt fordelt veje, hvor den øverste 2 BD score var mindre end. 2 eller top 3 BD score var mindre end 0. Filialer blev filtreret for at sikre ingen reaktioner blev gentaget i hvert sæt. For begge sæt grene, enten top 2 eller top 3 involverede enzymer er afhængige af, hvilken type score blev brugt til at differentiere dem-blev adskilt og kortlagt til deres respektive Kegg veje. For hvert sæt, blev antallet af enzymer, der falder ind i hver sti summeres og en Fischer eksakte test blev udført for at se, om der var nogen veje, der afveg betydeligt fra de to forgrenede sæt. Nøgletal for tællinger blev beregnet ved at dividere antallet af involverede One sidet enzymer med antallet af ligeligt fordelt Enzymer til hver af de Kegg veje.

cofaktor Analyse

Vi definerede oxidoreduktaser som proteiner, der enten havde NADP + /NADPH eller NAD + /NADH som reaktanterne eller produkterne. Begge reaktanter og produkter blev medtaget for at muliggøre proteiner med reversibel reaktion. EF Antal egnede reaktioner blev udvundet ved hjælp af Braunschweig-enzymet databasen (BRENDA, Slip 2014,2, Juli 2014) database og derefter kortlagt deres passende UniProt (Release 2013_11) eller Entrez (release December 15

th 2013) identifikatorer [22] . Vi udførte en lignende analyse for aminotransferaser, erstatter NAD forbindelser med α-ketoglutarat for at spore brugen af ​​kvælstof i hele cellen. En grafisk rig repræsentation af cofaktor forbrug blev oprettet ved hjælp CytoScape.

Kinetic Parameter Analysis

For hver metaboliske protein vi brugte BRENDA Database til at udtrække alle eksperimentelt rapporterede K

M værdier. The Simple Object Access Protocol (SOAP) interface blev anvendt til at opnå kinetiske egenskaber for alle metaboliske proteiner. Vi udelukkede alle værdier ikke refereres som en vildtype-eksperiment (såsom K

M værdier opnået efter et protein mutation) og yderligere forfinet listen ved at udelukke eventuelle afvigende målinger. Vi brugte derefter en tidligere offentliggjorte liste over tilgængelige AG ° værdier [23] plottet loggen

10 (CPC), log

10 (K

M), AG ° værdier for proteiner, som vi opnåede alle tre af disse variabler (se S2 tabel). For tilslutningsmuligheder analyse, CPC, AG ° og K

M værdier blev skaleret mellem 0 og 1, efterfølgende visualiseres i CytoScape og manuelt fordelt i fire grupper.

Resultater

Global analyse af Metabolic Proteome

for at undersøge ekspressionen og kvantificering af metaboliske proteiner vi først samles den delmængde af proteiner involveret i stofskiftet. Vi overvejede en nylig datasæt, der udnyttede dybe proteomiske målinger tværs af NCI-60 cellelinien panel og en regressionsmodel til at estimere protein overflod fra massespektrometriske data (S1 tabellen) [19]. Vi definerede metaboliske proteiner som helst protein tildelt til en kendt metabolisk pathway i Kegg databasen [3,24]. Kvantificering den relative størrelse af denne delmængde, fandt vi, at i gennemsnit på tværs af de 59 cellelinjer måles, det metaboliske komponent udgjorde ca. 18,5% af det samlede proteom (fig. 1a). Ved behandlingen af ​​fordelingen vi også observeret en nogenlunde log normalfordeling og fundet, at fordelingen af ​​metaboliske proteiner fulgte nogenlunde samme mønster som den samlede protein distribution (fig. 1b).

(a) Lagkagediagram diagraming den samlede procentdel af metaboliske proteiner på tværs af alle cellelinjer. Metaboliske proteiner adskiller sig ved en anden farve indsat. (B) Sandsynlighed fordelingsfunktion celleprotein kopi (CPC) værdier for alle proteiner og de metaboliske subset-forskellige undergrupper er angivet med forskellige farver. Log

10 værdier blev arkiveret lodret med en bin forskel på 10

0,3 og den relative hyppighed, eller procentdelen af ​​værdier falder i at bin, blev plottet.

Undersøgelse af proteiner omfattende metaboliske enzymer , vi sorteret proteiner i henhold til de 86 metaboliske Kegg metaboliske veje de blev tildelt. Fordi en enkelt protein ofte er involveret i flere biokemiske reaktioner, vi ikke begrænse hvert protein til enkelt vej, men tælles hvert protein på tværs af hver af de veje, som enzymet tilhørte. Af de 86 Kegg veje, fandt vi 6 veje ikke indeholdt eventuelle konstaterede proteiner, og fandt ikke yderligere disse veje. Baseret på denne opdeling var vi i stand til at kvantificere de totale protein tæller og brøkdel af alle proteiner, der var involveret i en bestemt sti på tværs af sæt af cellelinier (fig. 2). Ganske dramatisk, blev koncentrationerne af glycolytiske enzymer sig at være meget stor og i alt resulterede i næsten halvdelen af ​​den totale mængde af protein opdeles i metaboliske enzymer i celler. Dette fund sandsynligvis bekræfter den antagelse, at hovedparten af ​​metaboliske flux sker inden glykolyse og central kulstof stofskifte [1,25-29]. Vigtigere enzymer involveret i citronsyrecyklus (TCA) var typisk en størrelsesorden eller to lavere i udtryk end i glykolyse og disse numre sted grænser på flux der kan opretholdes i hver af disse veje. Andre veje, hvis substrater er umiddelbart afledt af glycolytiske carbon-såsom pentosephosphatvejen og dem, der involverer fedtsyresyntese-også havde meget lavere proteinkoncentrationer end hos glykolyse.

For hver fordeling medianen, standardafvigelser, max, og min er vist. Indsat indeholder et forstørret kig på veje med de højeste procenter af den metaboliske proteomanalyse.

Analyse af Glycolysis

Vi observerede, at andelen af ​​den proteom at kræftceller afsætte til glycolyse dværge mængden protein afsat til andre metaboliske veje (fig. 2). Dette er især bemærkelsesværdigt i betragtning af, at de eneste 32-proteinerne blev tildelt til den glycolytiske pathway henviser veje såsom purinmetabolismen, pyrimidin Metabolisme, og den oxidative phosphorylering blev tildelt op mod 60 proteiner. Selvom variation eksisterer på tværs af cellelinjer, denne analyse tyder på, at glycolytiske proteiner kan udgøre op til 10% af alle proteiner i en kræftcelle. Vi observerer også en bimodalitet til distribution af alle glycolytiske proteiner, der hidrører fra en overflod af højt udtrykte proteiner, og nogle isoformer udviser mindre ekspressionsniveauer (fig. 3b). Denne observation derefter motiveret os til at yderligere at undersøge organiseringen af ​​protein-ekspression i glykolysen. Vi undersøgte enzymer langs vejen i den rækkefølge, de enzymatiske reaktioner finder sted. Interessant, en ikke-monoton mønster viser i progressionen af ​​enzymniveauer som glucose metaboliseres via glycolyse til opnåelse lactat, med en top ved phosphoryleringen af ​​glyceraldehyd-3-phosphat til 1,3-biphosphoglycerate-katalyseret af glyceraldehyd-3-phosphat (GAPDH) -og yderligere senere top forekommer ved omdannelse af 2-phosphoglycerat at phosphoenolpyruvat-katalyseret af enolase (fig. 3c). Dette tilsyneladende ikke-tilfældigt mønster sandsynligvis har biologiske konsekvenser i hvordan metabolisk kontrol er fordelt over hele vejen og eventuelt hvordan branche punkter i vejen koordineres. Vi søgte derfor at undersøge denne hypotetiske forhold yderligere.

(a) Fordeling af celle protein kopi (CPC) værdier for alle glycolytiske /gluconeogene proteiner på tværs af alle cellelinjer. For hvert protein medianen, standardafvigelser, max, og min er angivet. (B) Sandsynlighed fordelingsfunktionen for CPC-værdier for alle metaboliske proteiner og de glycolytiske /gluconeogene subset-forskellige delmængder er angivet med forskellige farver. Værdier blev arkiveret lodret med en bin forskel på 10

0,2 og den relative hyppighed, eller procentdel af værdier, der falder ind at bin, blev plottet. (C) Fordeling af 11 glycolytiske proteiner i en sekventiel vej ordre. Center-prik viser gennemsnitlig CPC værdi for hvert protein med søjler angiver de max og min målinger på tværs af alle cellelinjer. (D) Pathway diagram af glycolyse aktivitet. Blå firkanter angiver forgrening i andre biologiske veje, blå sekskanter angiver mellemliggende metabolitter, og lilla cirkler indikerer reagerende enzymer. Størrelse af lilla cirkel er proportional med den gennemsnitlige CPC værdi for dette enzym tværs af alle cellelinjer.

Talrige punkter langs omdannelsen af ​​glucose til lactat forekomme hvorved underlaget kan viderestilles til et sti og dermed en anden slutprodukt. Faktisk mange har foreslået, at forbedret glukosemetabolismen observeret i cancerceller er en konsekvens af en metabolisk tilpasning for at øge spredningen af ​​glycolytiske mellemprodukter til biosynteseveje [1,3,30,31]. For at undersøge i hvilken grad glycolytiske flux kan omdirigeres til en anden end lactat produkt, sammenlignede vi glycolytiske enzym intensitetsniveauer med niveauerne af forgreningspunktet (BP) enzymer, der virker på samme substrat (fig. 3d). Vi fandt, at ekspressionsniveauerne af BP enzymer hele glykolyse var væsentligt lavere end enzymerne svarende til hovedgangen. Interessant var imidlertid, at ved visse forgreningspunkter, såsom en udgår fra 3-phosphoglycerat, ekspressionen af ​​det enzym, der katalyserer bindende trin til forgreningen anabolske pathway var sammenlignelige og i nogle tilfælde svarer til ekspressionen af ​​det tilsvarende enzym i glycolysen . Især dette sker ved phosphoglyceromutase (PGAM) trin i glycolysen, hvor 3PG fortsat kan metaboliseres langs glycolyse eller den kan omdirigeres til de novo serin syntese ved oxidation via phosphoglycerat-dehydrogenase (PHGDH). Selvom gennemsnit koncentrationen af ​​PHGDH var lavere i mange cancer cellelinjer, koncentrationen af ​​PHGDH var sammenlignelig eller endda højere end for PGAM i nogle tilfælde.

Global Branch Punkt Analyse

I betragtning de interessante resultater, vi observerede i glycolysen, vi næste forsøgt at systematisk vurdering proteinkoncentration struktur på tværs af menneskelige stofskifte netværk. For at analysere de relative niveauer af BP-enzymer uden for kernen glycolytiske vej, vi udnyttede Recon 2 database til at udtrække alle punkter i de kendte metaboliske veje, hvor en BP fandt sted. BPS blev filtreret kun dem, der indeholdt proteiner detekteret i den kvantitative proteomics datasæt til at omfatte. Denne filtrering resulterede i 251 BP’er med mindst to målte enzymer og 105 med mindst tre. For hver BP, vi beregnet to separate Branch Afvigelse scoringer (fig. 4a, se metoder) baseret på enten de øverste to eller tre mest stærkt udtrykt proteiner involveret i filialen. Det første resultat anses den del af proteinkoncentrationen på højeste rigelige protein involveret i grenen sammenlignet med den næsthøjeste protein. Den anden behandlede den del af proteinkoncentrationen på højeste rigelige protein involveret i grenen forhold til den anden og tredje højeste protein. En inspektion af disse scoringer (fig. 4c) viste en ikke-Gauss fordeling med en top nær en for første metriske (fig. 4b). For score, der betragtes som de to højeste udtrykte proteiner, viste det sig, at fordelingen toppede på visnings- at den mest almindelige forekomst i tilfælde BP’er langs den humane metaboliske netværk var, da proteinniveauer blev koncentreret langs en fremherskende rute i stofskiftet. Det blev imidlertid også observeret, at der findes mange undtagelser som fordelingen udviste en lang hale med tilstrækkelig tæthed nær nul. En inspektion af histogrammet for det andet metric (fig. 4c) viste en lignende struktur med den klare forskel, der viser, at i halen, er proteinkoncentrationer fordelt langs flere enzymer og således gennem flere ruter. Vi næste undersøgt, hvilke veje tendens til at have proteiner fordelt jævnt over filial point og som havde en tendens til at have udtrykket forekommer på en enkelt rute. Det blev konstateret, at for forgreningspunkter med en fremherskende rute, blev enzymsystemer, der involverer fedtsyrebiosyntese, fedtsyremetabolisme, og alanin metabolisme mest almindeligt forekommende. Denne observation er tydelig i både statistikker (fig. 4d), og forholdet mellem tællinger (fig. 4e). For veje med protein fordelt jævnt over filial punkter, den eneste statistisk signal observeret var i purin metabolisme, med ingen andre statistiske signaler til fælles veje observerede-tyder, at disse knudepunkter var spredt tilfældigt i hele metaboliske netværk.

( a) Diagram afklaring metode til beregning af forskellige Branch Afvigelse scoringer i 2 forskellige omstændigheder. Orange firkanter indikerer reaktant og produkt metabolitter med blå ovaler angiver de reagerende enzymer. (B) Histogram af Branch Afvigelse Resultaterne bygger på top 2 værdier. Hver bin er lavere ende inclusive med en bin størrelse på 0,1. (C) Histogram af Branch Afvigelse Resultaterne bygger på top 3 værdier. Hver bin er lavere ende inclusive med en bin størrelse på 0,1. (D) Plot angivelse af p-værdier for veje, der har markant forskellige tæller i ensidige og jævnt fordelt veje (defineret som en p-værdi 0,05). (E) Forholdet mellem ensidige tæller til ligeligt fordelt tæller for væsentlige veje.

cofaktor Analyse

En anden værdifuld konklusion, der kan drages af denne type datasæt ville være, hvordan visse cofaktorer eller afgørende substrater er fordelt på tværs af visse enzymatiske reaktioner. Vi undersøgte fordelingen af ​​enzymer, der bruges visse cofaktorer, og betragtes som en analyse af vigtige cellulære metaboliske funktioner, herunder vedligeholdelse af redoxpotentiale involverer både essentielle cofaktorer NADH og NADPH og assimilering af kvælstof.

Vi har forsøgt først at analysere den relative anvendelse af nitrogen, eller som aminotransferaser var mest udbredt i en celle. Brug af BRENDA database vi isolerede alle aminotransferaser, der blev detekteret i datasættet, og fandt, at blandt de mest udbredte enzymer var GOT2, GLUD1, og IDH2 (fig. 5). Sammen dette fund identificerer de vigtigste knudepunkter i kvælstof assimilation. Vi næste overvejet udnyttelsen af ​​cofaktorer er involveret i oxidation og reduktion, NADP

+ /NADPH, og NAD

+ /NADH. Vi først overvejet NAD

+ /NADH og fundet i overensstemmelse med vores observation, at glycolytiske enzymer udgør de mest udbredte enzymer i celler, at GAPDH og LDH omfattede det meste af proteinkoncentrationen anvendes til NADH-medieret redox koblede reaktioner i celler. Af lavere overflod var de enzymer der er involveret i TCA cyklus og biosyntetiske og vedligeholdelse reaktioner i sekundær metabolisme. For NADPH, i overensstemmelse med de seneste resultater, der har identificeret oxidationen af ​​folater som en vigtig kilde til cellulære NADPH, enzymet MTHFD er en af ​​de mest udbredte enzymer, der syntetiserer NADPH [32]. En storforbruger af NADPH var fedtsyre syntase (FASN), hvilket er i overensstemmelse med behovet for

de novo

lipid syntese anvendes i plasmamembranen dannelse i hurtigt spredning celler. Begge de store forbrugere (IdhA, FASN) og producenter (GAPDH, MTHFD og MDH2) af NAD (P) H er genstand for større forskningsindsats som lægemiddelkandidater mod kræft [11,33-36].

Netværk diagram glycolysens illustrerer overflod af aminotransferaser og enzymer, der udnytter NAD (P) /NAD (P) H som en cofaktor. Størrelsen af ​​noderne svarer til den gennemsnitlige overflod af proteinerne.

Korrelationer med kinetiske parametre

I sidste ende kan vi konstatere, at reaktionshastigheden eller flux gennem et punkt i stofskiftet indebærer ikke kun enzymkoncentrationen, men kinetiske parametre og termodynamik de kemiske forbindelser, der er involveret i reaktionen så godt. Disse parametre omfatter Michaelis konstant (K

M) og standard Gibbs Gratis Energies (AG °) af reaktionerne (S2 tabel). Vi undersøgte derfor forholdet mellem disse tre grundlæggende parametre. Overraskende ingen korrelation mellem gennemsnitlig proteinniveau og AG ° (fig. 6a), K

M værdier og AG ° (fig. 6b) og gennemsnitlig proteinniveau og K

M værdier (fig. 6c) blev observeret. For at få yderligere indsigt i forholdet mellem disse tre variable, vi også visualiseret disse tre variabler sammen for hvert enzym. Brug af denne fremgangsmåde udmærker 4 grupper (fig. 6d). Hovedparten af ​​de enzymer, visualiseret på denne måde havde moderate AG °, K

M værdier og protein kopiantal (gruppe 1) og var derfor ansvarlig for den generelle mangel på sammenhæng mellem disse tre variabler. Dette fund er i modsætning til en tidligere fastslået antagelse, at større proteinkoncentrationer er nødvendige for reaktioner tæt på ligevægt [37]. Desuden er denne analyse omfatter stærke beviser for, at hver af disse grundlæggende variable for en cellulær metabolisk reaktion er afkoblet mulighed for uafhængig indstilling af disse tre parametre for udviklingen af ​​det menneskelige stofskifte netværk. Også denne mangel på sammenhæng tyder på, at den samlede, proteinekspression er symbolsk for reaktionshastigheden siden K

M og AG ° for hver reaktion, der involverer et givet protein koncentration forekommer ukorreleret. Der var dog et par undtagelser fra denne generelle regel. Først proteinerne i gruppe 2 (fig. 6d) svarede stort set til de tidligere nævnte glycolytiske proteiner med ingen tilsyneladende store K

M eller meget lav AG ° værdier. Det svarer til den tanke, at disse proteiner skal udtrykkes meget at sikre en høj glykolytisk flux der kan resultere i opbygningen af ​​glycolytiske mellemprodukter og efterfølgende forbedret flux i de forskellige biosyntetiske grene. De to andre grupper (gruppe 3 og 4) indeholdt enzymer med enten meget store K

M værdier eller meget lave AG °. Den ekstreme K

M værdier indikerer, at disse enzymer har brug for en betydelig opbygning af substrater for at føre til en mærkbar fremad flux mens reaktioner med meget lave AG ° er yderst irreversible reaktioner. Faktisk tre enzymer med stor K

M værdier (GNPDA, GPT2 og GART) direkte dræne glycolytiske mellemprodukter i biosynteseveje mens tre enzymer med meget lav AG ° (ATIC, PPAT og QPRT) udnytte phosphoribosyltransferase diphosphat (PrRP) afledt fra pentosephosphatvejen for NAD (P) H og nucleotidsyntese. Også flere enzymer i gruppe 3 (GLS, NAGS, OAT, GOT1 og ASL) er involveret i arginin, aspartat, glutamin metabolisme, for hvilke metabolitter har nogle af de højeste intracellulære koncentrationer og /eller flusmidler.

( a) Scatter plot af log af den gennemsnitlige K

M og AG ° værdi med hver prik repræsenterer en anden metabolisk protein. (B) Scatter plot af log af den gennemsnitlige celle protein kopi (CPC) og AG ° værdier med hver prik repræsenterer en anden metabolisk protein. (C) Scatter plot af log af både den gennemsnitlige K

M og gennemsnitlig CPC værdi med hver prik repræsenterer en anden metabolisk protein. (D) Forbindelse analyse af CPC, AG ° og K

M værdier for de forskellige enzymer.

Diskussion

Det er vigtigt at bemærke, at disse analyser blev udført på data indsamlet fra et panel af cancercellelinjer snarere end humant væv og dermed resultaterne af denne analyse indledes med en række forbehold. Mens analyser på cellelinjer kan ofte kaste lys på den samlede cellulære forståelse, er der stor metabolisk mangfoldighed på tværs af forskellige vævstyper, der kan påvirke resultaterne af en global proteomisk analyse. For eksempel er cardiomyocytter menes at udtrække størstedelen af ​​deres energi fra fedtsyreoxidation og ca. 50% af deres volumen er besat af mitokondrierne [39]. Derudover er det blevet vist, at medierne betingelserne anvendt i vævskultur har væsentlig hvis ikke dominerende virkning på cellemetabolisme og indflydelse enzymaktivitet [38-40]. Således betingelser specifikke for cellelinjen og mikromiljø ændre fordelingen af ​​proteiner. Alligevel en analyse af protein overflod tværs af netværket giver indsigt i konkrete eksempler på, hvordan pattedyrcancerceller distribuere deres enzymkoncentrationer Salg

Generelt betragtede vi en analyse af protein-koncentration af metaboliske enzymer over den humane cancercellelinie metaboliske netværk i en forskelligartet antal celler. Denne analyse viser, at en relativt simpel beregning og vurdering kunne give flere indsigt i organiseringen af ​​kræft metaboliske netværk. I modsætning til tidligere afholdt forestillinger, behøver metaboliske enzymer, ikke synes at være nogen mere stærkt udtrykt end nogen anden protein i celler. Den største undtagelse er glycolyse, som tegnede sig for op til 10% af hele cellulære proteom. Den bemærkelsesværdige fordeling af proteinkoncentrationen for en enkelt metabolisk vej understreger dens centrale i udnyttelsen af ​​den større makronæringsstoffer, glucose, som anvendes som energikilde. Det giver også indsigt i de store strømme, der observeres i glykolyse og hvordan disse flusmidler kan være så hurtigt. Konstateringen opfordrer også spørgsmålstegn mange kontrolmekanismer, der er blevet foreslået at regulere glykolysen. For eksempel er det sandsynligt, at i mange tilfælde kan posttranslationelle modifikationer, såsom acetylering eller phosphorylering ikke få større regulatoriske roller siden deres støkiometri er begrænset af det lille antal kinaser og acetyltransferaser, som udtrykkes til at udføre disse reaktioner.