PLoS ONE: Den Interaction Virkninger af pri-lad-7a-1 rs10739971 med PGC og ERCC6 Gene polymorfier i Gastric Cancer og atrofisk Gastritis

Abstrakt

Baggrund

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge interaktion virkninger af pri-lad-7a-1 rs10739971 med

pepsinogen C Hotel (

PGC

) og

excision reparation tværs supplere gruppe 6

(

ERCC6

) gen-polymorfier og dens association med risikoen for mavekræft og atrofisk gastritis. Vi håbede at identificere miRNA polymorfi eller en kombination af flere polymorfier, der kunne tjene som biomarkører til forudsigelse af risikoen for mavekræft og dens forstadier sygdomme.

Metoder

Sequenom MassARRAY platform metode blev anvendt til at detektere polymorfier af pri-lad-7a-1 rs10739971 G → A,

PGC

rs4711690 C → G,

PGC

rs6458238 G → A,

PGC

rs9471643 G → C, og

ERCC6

rs1917799 i 471 gastrisk kræftpatienter, 645 atrofisk gastritis patienter og 717 kontroller.

Resultater

En interaktion effekt af pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi med

ERCC6

rs1917799 polymorfi blev observeret for risikoen for mavekræft (

P

interaktion = 0,026); og interaktion virkninger af pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi med

PGC

rs6458238 polymorfi (

P

interaktion = 0,012) og

PGC

rs9471643 polymorfi (

P

interaktion = 0,039) blev observeret for risikoen for atrofisk gastritis.

Konklusion

kombinationen af ​​pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi og

ERCC6

PGC

polymorfier kunne give et større potentiale forudsigelse end en enkelt polymorfi på egen hånd. Der er behov for Storstilet undersøgelser og molekylære mekanisme forskning for at bekræfte vores resultater

Henvisning:. Xu Q, Liu J-w, han C-y, Sun L-p, Gong Y-h, Jing J-j, et al. (2014) Samspillet Virkninger af pri-lad-7a-1 rs10739971 med

PGC

og

ERCC6

Gene polymorfier i Gastric Cancer og atrofisk gastritis. PLoS ONE 9 (2): e89203. doi: 10,1371 /journal.pone.0089203

Redaktør: Xiaoping Miao, MOE Key Laboratory for Miljø og Sundhed, Institut for Folkesundhed, Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi, Kina

modtaget: 20. november 2013; Accepteret: 16 Jan 2014; Publiceret: 25 feb 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key Basic Research Program Kina (973 Program ref nr. 2010CB529304), National Natural Science Foundation of China (Ref nr 31.200.968), og Science Technology Project i Liaoning-provinsen (Ref nr 2011225002) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Personer med lignende levevaner og lever i lignende miljøer har forskellige risici for kræft. Identifikation og forudsige personer med høj risiko for at udvikle kræft kan indikere behovet for at ændre levevaner. Single nucleotide (SNP’er) spiller en central rolle i at forudsige individer med forøget risiko cancer. I de senere år blev polymorfier af PRI-miRNA rapporteret at være biomarkører til forudsigelse af risikoen for kræft, såsom PRI-MIR-34b /c rs4938723 polymorfi [1], PRI-MIR-218 rs11134527 polymorfi [2] og PRI-MIR-938 rs2505901 polymorfi [3]. Undersøgelser har vist, at antallet af enkelt gen polymorfismer var forbundet med risiko for mavecancer [4]. Men gastrisk cancer er en kompleks flertrins sygdom med mange gener involveret, og enlige SNPs har begrænset evne til at forudsige mavekræft risiko [5] – [7]. Adskillige undersøgelser har rapporteret, at gen-gen interaktioner er vigtigere end den væsentligste virkning af et enkelt gen i komplekse sygdomme, såsom cancere [7] – [9]. Den grundforskning tilgang til gen-gen interaktioner er at undersøge kombinationen af ​​to eller flere polymorfier med mindre eller ingen effekt fra tidligere enkelt SNP undersøgelser [10], [11]. Imidlertid har de fleste tidligere studier med fokus på den intelligente rollen som en enkelt gen SNP og overset den potentielle anvendelse af gen-gen interaktioner.

I øjeblikket efterforskere primært fokus på gen SNP-SNP interaktioner, som kan forårsage protein- protein-interaktioner, og få studier har undersøgt interaktioner mellem miRNA polymorfier og gen-polymorfier, som kan forårsage protein-RNA interaktioner. miRNA er blevet rapporteret at deltage i multi-genet netværk af gastrisk carcinogenese [12]. Den samme miRNA blev rapporteret at regulere flere målproteiner, og de samme proteiner kunne moduleres ved multipel miRNA [13]. Som et resultat, virkningerne af miRNA og gener dannet et netværk.

Vores tidligere kandidat gen forening undersøgelse undersøgt sammenhængen mellem

pepsinogen C Hotel (

PGC

) og

excision reparation tværs supplere gruppe 6

(

ERCC6

) med risiko for mavekræft, og fandt, at

PGC

gen rs4711690 C → G, rs6458238 G → A, og rs9471643 G → C polymorfier havde beskyttende virkninger mod atrofisk gastritis [4]. PGC havde beskyttende virkninger på normale mave og viste lav ekspression i gastrisk cancer, og tabet af beskyttelse var forbundet med forekomsten af ​​gastrisk cancer [14]. ERCC6 er et medlem af DNA-reparation familie, som deltager i reparation DNA beskadigelse i carcinogenese [15].

ERCC6

rs1917799 T G polymorfi i promotorområdet var forbundet med øget gastrisk kræftrisiko i en kinesisk befolkning [16]. Lad-7a er en tumorsuppressor, og nylige undersøgelser vist, at funktionen af ​​modne Lad-7a er nært beslægtet med forekomsten og udviklingen af ​​mavekræft og nedsat ekspression af lad-7a er forbundet med malign biologisk adfærd [17], [ ,,,0],18]. Imidlertid blev Lad-7a genetiske varianter ikke undersøgt for deres foreninger og mavekræft risici. Rs10739971 er en SNP beliggende -559 bp opstrøms for lade-7a-1, som kan være en promotorregion af lad-7a-1. I Hapmap database, er det mindste allel frekvens rs10739971 er ≥5% i både europæere og asiater. Men om der er en sammenhæng mellem rs10739971 og sygdomsrisiko, og interaktioner mellem rs10739971 og andre polymorfier, forbliver ukendt. Vi antager, at de ovennævnte varianter kan være optimale kandidater til at undersøge potentielle SNP-SNP interaktioner på to eller flere loci, der bidrager til mavekræft ætiologi.

I dette case-kontrol undersøgelse ved hjælp af en kinesisk befolkning, undersøgte vi sammenslutning af pri-lad-7a-1 rs10739971 med gastrisk kræftrisiko, og samspillet virkninger af miRNA-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi og

PGC

og

ERCC6

polymorfier i prøver af den samme gruppe, og diskutere dens anvendelse udsigter i mavekræft og dets forstadier til sygdomme. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse forsøger at vurdere potentielle SNP-SNP interaktioner af miRNA SNP’er og gen SNPs ved to eller flere loci impliceret i gastrisk cancer modtagelighed. Vi håbede at finde kombinationer af gen-gen-polymorfier, der kunne forudsige risikoen for mavekræft og dens forstadier til sygdomme, og for at give eksperimentel evidens for tidlig diagnosticering af mavekræft.

Metoder

Patienter

i denne undersøgelse, i alt 1834 personer, som omfattede 471 gastrisk kræftpatienter, 646 atrofisk gastritis patienter og 717 kontroller, blev retrospektivt rekrutteret fra patienter, der gennemgår gastroskopi screening eksamen i Zhuanghe region og patienter, som gennemgik gastroskopi undersøgelse eller gastrisk kirurgi på First Affiliated Hospital i Kina Medical University, Liaoning-provinsen, Kina mellem 2002 og 2011. Fasting veneblod blev opsamlet, og alle tilmeldte deltagere blev diagnosticeret baseret på deres gastroskopisk og histopatologiske undersøgelser. Gastrisk kræft blev diagnosticeret baseret på WHO kriterier, og atrofisk gastritis og overfladiske gastritis blev klassificeret af Sydneys klassifikation. Støtteberettigede kontroller var de deltagere med en normal mave eller kun gastritis efter gastroskopisk og patologiske undersøgelser og havde ingen andre sygdomme.

Designet af undersøgelsen blev godkendt af menneskelige etiske komité Kina Medical University (Shenyang, Kina ). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere. Medicinske historier (herunder alder, køn, rygning, og alkoholforbrug) blev opnået ved spørgeskema og de optegnelser blev edb. Hver enkelt involveret i undersøgelsen forudsat skriftligt informeret samtykke til epidemiologisk undersøgelse. Detaljerede deltagende egenskaber er opsummeret i tabel 1.

Genomisk DNA ekstraheret

Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af en tidligere beskrevet fremgangsmåde med lille modifikation [19]. Kort fortalt blev en frossen koagel (500 pi) tilsat til 800 pi TE-buffer (triethanolamide), blandet godt og centrifugeret ved 10.000 ×

g

i 5 minutter for at dispergere blodproppen. Efter blodprop forstyrrelser, 400 pi TE, 25 pi 10% SDS og 5 pi 20 mg /ml proteinase K blev tilsat og inkuberet ved 37 ° C natten over. Supernatanten blev ekstraheret og et tilsvarende volumen af ​​phenol blev tilsat. Røret blev anbragt på en rotator i 15 minutter og derefter centrifugeret ved 10.000 x

g Salg i 15 min. Supernatanten blev fjernet, og en anden ekstraktion blev udført med tilsætning af et tilsvarende volumen af ​​en blanding af phenol og chloroform (01:01). Efter centrifugering blev supernatanten fjernet, og en tredje ekstraktion blev udført ved tilsætning af et tilsvarende volumen af ​​chloroform. Efter centrifugering blev supernatanten absorberes og to volumener proteinpræcipitation opløsning (to volumener absolut ethanol indeholdende 10% 3 mol /l natriumacetat) blev tilsat og inkuberet i 2 timer ved -20 ° C. Hver prøve blev centrifugeret ved 10.000 ×

g

i 10 min. Efter centrifugering blev den resulterende DNA-pellet skyllet med 75% ethanol og centrifugeret ved 10.000 ×

g

i 10 min. 75% ethanol blev dekanteret og røret vendes på rent absorberende papir i 30 minutter. Det resulterende DNA blev rekonstitueret i TE-buffer og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.

SNP genotyping

DNA prøver blev fortyndet til arbejder koncentrationer på 50 ng /pl før genotypebestemmelse. Analyserne, primer design og genotypning af 29 polymorfi sites udvalgt til en kandidat gen associeret undersøgelse blev alle udført af CapitalBio (Beijing, Kina) hjælp Sequenom MassARRAY platform (Sequenom, San Diego, CA, USA) mellem maj 2011 og December 2011 baseret på producentens anvisninger [4], [20]. Fem af 29 polymorfier blev yderligere udvalgt til interaktionsanalyse i nærværende undersøgelse. At evaluere kvaliteten af ​​genotypebestemmelse, blev 5% gentagne prøver genotypebestemmes og resultaterne var 100% konsekvent.

Påvisning af H. pylori i serum

serologiske test for

H. pylori

blev udført for at kontrollere status for

H. pylori

infektion ved hjælp af ELISA (

H. pylori

-IgG ELISA kit, BIOHIT Plc, Helsinki, Finland), som tidligere beskrevet [21]. Positive blev bedømt som titeren af ​​

H. pylori

-IgG højere end 34EIU (cut-off værdi givet ved protokol). Kort fortalt blev serumprøver fortyndet 1:200 (5 pi + 995 pi) med fortyndingspuffer og blandes godt. Derefter 100 pi af blindprøve, kalibratorer, kontroller og fortyndede prøver blev tilsat til brønde. Pladen blev dækket med inkubationen dæksel og inkuberet i 30 min ved 37 ° C. Efter inkubation blev brøndene vasket fem gange med 350 pi af fortyndet (1:100) vaskebuffer og pladen forsigtigt bankes flere gange på filtrerpapir. Derefter 100 pi blandet konjugat opløsning blev tilsat til brøndene og inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C. Efter inkubering blev brøndene vasket igen, og 100 pi af blandet substrat opløsning blev tilsat til brøndene, før inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur (20-25 ° C) i mørke omgivelser. Endelig blev 100 pi af blandet stopopløsning tilsat, og absorbansen blev aflæst ved 450 nm inden for 30 min.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS 16.0 software (SPSS, Chicago , IL, USA). Pearsons χ

2 tests blev anvendt til at evaluere forskelle mellem kønnene i etui og kontrolgrupper. ANOVA blev udført for at vurdere eventuelle forskelle mellem aldre i de forskellige grupper. Likelihood ratio test blev udført for at vurdere interaktionseffekter om risikoen for mavecancer ved at sammenligne den model, der kun indgår de vigtigste virkninger og den fulde model, der også indeholdt interaktionen. En

P

-værdi. 0,05 for alle tosidede tests blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Main effekt analyser af individuelle polymorfier

i vores tidligere undersøgelse fandt vi, at PRI-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi var signifikant forbundet med øget risiko for atrofisk gastritis (OR = 2,59,

P

= 0,018) i den mindre studiepopulation, men ingen signifikant sammenhæng blev fundet i den videre valideringen af ​​en større population (upublicerede data); PG

C

rs4711690, rs6458238 og rs9471643 polymorfier var signifikant forbundet med øget risiko for atrofisk gastritis (

P

= 0,093, OR = 0,75;

P

= 0,015, OR = 0,73;

P

= 0,033, OR = 0,69, henholdsvis) [4];

ERCC6

rs1917799 polymorfi var signifikant forbundet med øget risiko for mavekræft (OR = 1,38,

P

= 0,035) [20].

De to-vejs interaktion af pri -Lad-7a-1 rs10739971 og PGC, ERCC6 polymorfier i risikoen for mavekræft /atrofisk gastritis

for at undersøge om gen-polymorfier og miRNA polymorfisme havde en interaktion effekt, vi analyserede interaktioner mellem miRNA polymorfi og hvert gen polymorfi . Vi fandt, at miRNA polymorfi og

PGC

og

ERCC6

polymorfier viste stærk statistisk sammenhæng med gastrisk kræft eller atrofisk gastritis. Således har vi analyseret samspillet effekten af ​​pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi og

PGC

og

ERCC6

polymorfier, og dets foreninger, med risikoen for mavekræft og atrofisk gastritis. Resultaterne viste, at PRI-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi og

ERCC6

rs1917799 polymorfi havde interaktion virkninger for gastrisk kræftrisiko (

P

interaktion = 0,026, tabel 2). Denne SNP par viste øget risiko for mavekræft (OR = 2,59, 95% CI = 1,12-5,97). Pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi og

PGC

rs65458238 og rs9471643 polymorfier havde interaktion virkninger for risikoen for atrofisk gastritis (

P

interaktion = 0,012 og 0,039 henholdsvis tabel 3). For rs65458238 polymorfi, viste SNP parret øget risiko for atrofisk gastritis (OR = 2,77, 95% CI = 1,25-6,13); mens den anden SNP parret viste nedsat risiko for atrofisk gastritis (OR = 0,52, 95% CI = 0,28-0,97) for rs9471643 (tabel 3).

SNP-SNP interaktioner involverer flere SNPs ved hjælp af logistisk regression

Vi yderligere undersøgt SNP-SNP interaktion involverer tre positive SNP’er (PRI-lad-7a-1 rs10739971-

PGC

rs6458238-

PGC

rs9471643) og resultatet var statistisk signifikant (

P

interaktion = 0,001, tabel 4). Den SNP kombination viste øget risiko for atrofisk gastritis (OR = 23,55, 95% CI = 3,73 til 148,71).

Diskussion

Polymorphisms af gener eller miRNA kunne tjene som potentielle biomarkører for forudsige risiko for sygdom. Tidligere undersøgelser har hovedsageligt fokuseret på foreningen af ​​et enkelt gen polymorfi med sygdomsrisiko, og risikoen var ofte for svag effekt (OR 1,5). Som for kombinationen af ​​to eller flere SNP-SNP-interaktioner, er risikoen var ofte af moderat (OR≥1.5) eller stærk virkning (OR≥2) [4], [10], [22] – [24]. Den foreliggende undersøgelse, der for første gang, undersøgte interaktion virkninger af miRNA polymorfi og

PGC

og

ERCC6

polymorfier i en nordlige kinesiske befolkning. Undersøgelsen havde til formål at give eksperimentel evidens for tidlig diagnose og mekanismer i gastrisk kræft ved at finde kombinationer af gen-gen-polymorfier, der kunne forudsige risikoen for mavekræft og dens forstadier til sygdomme.

Blandt SNPs fra vores gruppe undersøgte under vores kandidat gen forening undersøgelse,

ERCC6

enkelt locus viste en svag effekt for gastrisk kræftrisiko (OR = 1,46) [16]; de tre

PGC

enkelt locus demonstrerede en svag beskyttende virkning for atrofisk gastritis risiko (OR for rs4711690 = 0.75, OR for rs6458238 = 0,73, OR for rs9471643 = 0,69) [4]. Vi hypotese derfor, at disse polymorfier kan være optimale kandidater til at undersøge potentielle SNP-SNP interaktioner på to eller flere loci, der bidrager til mavekræft ætiologi. Vi udførte samspillet effekt analyse af miRNA polymorfi og gen-polymorfier og fundet tre SNP-SNP par forbundet med sygdomme, hvoraf interaktionen af ​​et par (PRI-lad-7a-1 rs10739971-

ERCC6

rs1917799) var forbundet med gastrisk kræftrisiko, og interaktionerne mellem de to andre par (PRI-lad-7a-1 rs10739971-

PGC

rs65458238, og PRI-let-7a-1 rs10739971-

PGC

rs9471643) var forbundet med atrofisk gastritis risiko.

ERCC6

rs1917799 polymorfi og

PGC

rs6458238 og rs9471643 polymorfier er blevet rapporteret tidligere. I denne undersøgelse, vi derudover analyseret pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi i samme gruppe. Parret af pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi og

ERCC6

rs1917799 polymorfi havde en OR deres interaktion på 2,59 for gastrisk kræftrisiko, som var større end deres individuelle single-locus virkninger af 0,92 og 1,07, henholdsvis. Tilsvarende par pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi og

PGC

rs6458238 polymorfi havde en OR deres interaktion på 2,77 for atrofisk gastritis risiko, som var større end deres individuelle single-locus virkninger af 0,74 og 1,23 hhv. Parret af pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi og

PGC

rs9471643 polymorfi havde en OR deres interaktion på 0,52 for atrofisk gastritis risiko. Interessant, deres individuelle single-locus effekter var i strid med ovenstående resultater, med OR på 1,65 og 1,06, henholdsvis som fortjener yderligere uafhængig replikation af vores resultater.

Fordi pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi demonstreret interaktion effekter med både

PGC

SNPs på atrofisk gastritis risiko, vi yderligere gennemført interaktion analyse af de tre positive polymorfier. Resultaterne viste, at OR for risikoen for atrofisk gastritis var 23,55 (

P

= 0,001). Generelt er en single-locus har en svag effekt (OR 1,5) på sygdomsrisiko, og kombinationen af ​​to eller flere SNP-SNP-interaktioner ofte demonstrerer en moderat (OR≥1.5) eller en stærk virkning (OR≥2). I den foreliggende undersøgelse, OR af pri-lad-7a-1 enkelt locus var 1,61; OR for interaktion effekter med

ERCC6

PGC

var begge mere end 2; kombinationen af ​​de tre positive loci demonstrerede en endnu højere OR for 23.55. Disse resultater er angivet ansøgningen udsigterne til en kombination af to eller flere SNP’er som potentielle biomarkører til at forudsige risiko for sygdom.

Undersøge interaktion virkninger af miRNA polymorfier og gen-polymorfier vil bidrage til den samlede forståelse af genet netværk og rolle miRNA i den patogene proces. Resultaterne af SNP-SNP interaktioner har ofte underliggende mekanismer Snarere end at være blot statistiske resultater [9]. De tre par SNPs indikerede, at miRNA kan interagere med gener i gastrisk carcinogenese. PGC protein har en beskyttende virkning i epitelet af den normale mave, og dets ekspression faldt i en atrofisk gastritis gruppe sammenlignet med en normal gruppe [14], [25]. Den nøjagtige rolle af PGC i atrofisk gastritis er stadig ikke klar. ERCC6 er involveret i DNA-reparationsvej, og gentagen DNA-skade og reparation kan føre til celle carcinogenese [15]. På baggrund af resultaterne i nærværende undersøgelse, er det rimeligt at antage, at lade-7a kan deltage i de processer af PGC fremkalde atrofisk gastritis og ERCC6 fremkalde mavekræft. Ifølge resultater fra miRNA target forudsigelse software, der var mulige bindingssteder af lad-7a med 3′-UTR til både

PGC

og

ERCC6

. Hvorvidt SNP-SNP interaktion virkninger observeret i denne undersøgelse var på grund af binding af miRNA og dets målgener kræver stadig yderligere funktionelle eksperimenter.

Denne undersøgelse havde nogle begrænsninger. Først, selv om vi havde en relativ stor stikprøve af 471 gastrisk kræftpatienter, 645 atrofisk gastritis patienter og 717 kontroller, dette kan stikprøven stadig være utilstrækkelige til påvisning interaktion virkninger, især for sjældne alleler. For det andet behøver mekanismerne i de associerede SNP-SNP interaktioner afklares, og der kræves efterfølgende funktionelle eksperimenter. Det tredje adskillige genom-dækkende forening studier tyder på en integration af data fra genom-dækkende forening undersøgelser af mavekræft fra kinesiske befolkningsgrupper; derfor bør data integreres, og kan anvendes som kandidat polymorfi steder, der skal undersøges i fremtiden. For det fjerde, samspillet mellem gen og miljø for gastrisk kræftrisiko er en vigtig faktor, der skal overvejes, såsom rygning og drikkeri. I denne undersøgelse, vi samlet nogle data om rygning og drikkeri, men der er stadig næsten en tredjedel af manglende data fra prøverne. Interaktioner mellem gener og ryge og drikke adfærd på gastrisk kræftrisiko bør undersøges.

Konklusion

Denne undersøgelse, der for første gang, rapporterer, at PRI-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi og

ERCC6

rs1917799 polymorfisme kan have en interaktion effekt på mavens kræftrisiko; og pri-lad-7a-1 rs10739971 polymorfi kan have en interaktion effekt med

PGC

rs6458238 og rs9471643 polymorfier på atrofisk gastritis risiko. Nogle data er blevet indsamlet indeholder bestemmelser om eventuel opførelse af en gastrisk cancer netværk vej. Fremtidens store studier og mekanisme eksperimenter er forpligtet til at bekræfte resultaterne af denne undersøgelse.