PLoS ONE: Knockdown af Ki-67 ved Dicer-Substrat Lille interfererende RNA sensibiliserer Blære Cancer Cells til curcumin-induceret Tumor Inhibition

Abstrakt

Transitional celle carcinom (TCC) af urinblæren er den mest almindelige kræftform i urinvejene. De fleste af de TCC tilfælde er af den overfladiske type og behandles med transuretral resektion (TUR). Men en gentagelse er høj, og de nuværende behandlinger har den ulempe at fremkalde stærke systemisk toksicitet eller forårsager smertefulde blærebetændelse. Derfor ville det være af terapeutisk værdi til at udvikle nye koncepter og identificere nye lægemidler til behandling af blærecancer. Ki-67 er en stor nucleolar phosphoprotein hvis ekspression er tæt forbundet med celleproliferation, og curcumin, en fytokemiske afledt af rhizomet

Curcuma longa,

har vist sig at besidde stærke anticancer egenskaber. I denne undersøgelse vurderede vi den kombinerede effekt af curcumin og et siRNA mod Ki-67 mRNA (Ki-67-7) i rotter (AY-27) og human (T-24) blære cancerceller. Anticancer virkninger blev vurderet ved bestemmelse af cellelevedygtighed, apoptose og cellecyklus-analyse. Ki-67-7 (10 nM) og curcumin (10 uM), når de behandles uafhængigt, var moderat effektiv. Men i deres kombinerede tilstedeværelse, spredning af blære kræftceller var dybt ( 85%) hæmmede; hastigheden af ​​apoptose i den kombinerede tilstedeværelse af curcumin og Ki-67-7 (36%) var større end på grund af Ki-67-7 (14%) eller curcumin (13%) alene. En lignende synergi mellem curcumin og Ki-67-7 til induktion cellecyklusstop blev også observeret. Western blot analyse foreslog, at forbehandling med Ki-67-7 sensibiliserede blære cancerceller til curcumin-medieret apoptose og cellecyklusstop ved p53 og p21-uafhængige mekanismer. Disse data tyder på, at en kombination af anti-Ki-67 siRNA og curcumin kan være en levedygtig behandling mod spredning af blære cancerceller

Henvisning:. Pichu S, Krishnamoorthy S, Shishkov A, Zhang B, McCue P , Ponnappa BC (2012) Knockdown af Ki-67 ved Dicer-Substrat Lille interfererende RNA sensibiliserer Blære Cancer Cells til curcumin-induceret Tumor hæmning. PLoS ONE 7 (11): e48567. doi: 10,1371 /journal.pone.0048567

Redaktør: Bharat B. Aggarwal, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: August 23, 2012; Accepteret: September 28, 2012; Udgivet: November 12, 2012 |

Copyright: © 2012 Pichu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health tilskud AA016551. Den bevilgende myndighed ikke havde nogen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den mest almindelige urologisk cancer i. Sydøstasien og den næsthyppigste urologisk malignitet i Nordamerika [1]. Transitional cell carcinoma (TCC) tegner sig for mere end 90% af patienter diagnosticeret med blærecancer [2]. Mere end 70% af de TCC tumorer er overfladiske tumorer begrænset til blæren mucosa og lamina propia -TA eller T1 iscenesat tumorer og de resterende er af den invasive type. Forekomsten af ​​urinblæren kræft har løbende steget i de seneste to årtier [3]. En foretrukken behandling for overfladiske tumorer er transuretral resektion (TUR), men risikoen for tilbagefald (60-70%) på grund af refiksation af frigivne tumorceller og død af sygdommen (10-30%) er høj [4]. Den primære metode til at forhindre en gentagelse af tumoren, efter TUR, har været intravesikal instillation terapi (IVI) ved hjælp af kemoterapeutiske stoffer [5], [6] men de cytotoksiske virkninger af narkotika er af bekymring. På grund af sin højere effektivitet, intravesikal immunterapi bruge

Bacillus Calmette Guerin

(BCG) er blevet det behandling af valg i løbet af de seneste tre årtier. Men induktion af blærebetændelse og systemisk toksicitet er nogle af sine alvorlige bivirkninger [2]. Trods de aggressive terapier, patienter med blærecancer har en 5-års overlevelse på kun omkring 50% [7]. Endvidere væsentligt antal blærecancerpatienter er resistente over for konventionel intravesikal terapi og derfor er det nødvendigt at udvikle nyere og fortrinsvis mindre toksiske metoder til bekæmpelse af sygdommen.

En af de nyere tilgange at undertrykke tumorprogression er ved anvendelse af genspecifikke lægemidler, såsom antisense-oligonukleotider (AsODNs) eller små interfererende RNA’er (siRNA’er) mod mRNA’er af tumorspecifikke proteiner. Efter opdagelsen af ​​RNA-interferens (RNAi) i en række forskellige arter [8] – [10], der har været en enorm interesse for at udnytte det terapeutiske potentiale af siRNA’er i behandlingen af ​​forskellige sygdomme [11], herunder cancer [12] og inflammatoriske sygdomme [13]. Ki-67 er en stor nucleolar phosphoprotein hvis ekspression tæt forbundet med cellecyklus og det er strengt forbundet med celleproliferation [14]. Det er et DNA-bindende protein med en primær rolle i at opretholde højere orden struktur for DNA under processen med mitose. Detaljeret cellecyklus-analyse afslørede, at Ki-67-antigenet er til stede i kerner af prolifererende (G1, S-, G2- fase og mitose), men ikke i kerner af hvilende eller hvilende celler (G0- fase) [15]. Dette antyder, at Ki-67-inhibitorer kan have relativ specificitet for maligne celler. Yoa et al., [16] rapporterede, at blandt mange af cancerrelaterede gener testet, som af Ki-67 ekspression var en af ​​de højeste i rotte blæretumorer, på næsten 20 gange højere niveauer sammenlignet med normalt væv. Således har Ki-67 været et af generne af interesse til at målrette ved anvendelse AsODNs [17], [18] eller siRNA’er [19], [20]. I nyere rapport blev AsODN mod Ki-67 anvendt i kliniske fase-I forsøg til behandling af human blærecancer [21]. Selv om effektiviteten af ​​AsODNs demonstrere bevis for det princip, er det kendt, at siRNA’er er mindst en størrelsesorden mere følsom end AsODNs [22], [23] og dermed meget lavere mængde af lægemidlet behøver at blive anvendt til lignende effekt. Endvidere har det vist sig, at de længere (27 bp) Dicer-substrat siRNA’er (DsiRNAs) er mere følsomme end de standard 19-21 bp siRNA’er [24]. Således siRNA’er /DsiRNAs giver et bedre redskab end AsDONs at målrette tumorspecifikke gener.

Foruden de antisense-molekyler, i de seneste år, narkotika af vegetabilsk oprindelse har også fået megen opmærksomhed på grund af deres enorme potentiale i forebyggelse og behandling af cancer [25]. Curcumin er et polyphenolisk phytochemical afledt af rhizomet,

Curcuma longa

. På grund af sin stærke antiproliferative og anti-inflammatoriske virkninger, har det trukket en masse opmærksomhed fra forskere på området kræft. Til dato er der mere end 70 kliniske forsøg på forskellige stadier af færdiggørelse, afprøvning af effektiviteten af ​​curcumin mod mange sygdomme (www.clinicaltrials.gov). Rolle curcumin i moderne medicin er for nylig blevet revideret [26] – [28]. Anticancer potentiale curcumin er afledt af dens evne til at undertrykke proliferation af en lang række tumorceller, ved nedregulering af ekspressionen af ​​prolifererende gener, såsom COX2, MMP-9, chemokiner, cyclin D1 og den nukleare faktor KB (NF- KB) [29]. Tharakan et al., [30] under anvendelse af et ortotopisk musemodel for blærecancer, rapporterede, at curcumin afskaffet konstitutiv aktivering af NF-KB i tumorvævet, apoptose og nedsat COX-2-ekspression. Men i nærværelse af det kemoterapeutiske lægemiddel, gemcitabin, lave koncentrationer af curcumin forstærker virkningerne af lægemidlet gennem modulering af NF-KB-signalering pathway [31]. Disse observationer viser tydeligt det terapeutiske potentiale af curcumin i behandlingen af ​​cancer.

Da curcumin hæmmer spredning af tumorceller ved at målrette flere steder i de apoptotiske og spredning veje, vi hypotese, at overlejring af den multi-målrettet curcumin følgende molekylstruktur inhibering af Ki-67, ville have en større inhiberende virkning på tumorvækst. Faktisk Vore data viser for første gang, at forbehandling af blære cancerceller med DsiRNA mod Ki-67-mRNA fremmer celle-cellecyklusstandsnings og sensibiliserer cellerne til curcumin-induceret apoptose. De formodede molekylære mål for curcumin og Ki-67 DsiRNA diskuteres.

Materialer og Metoder

SiRNA Design

I alt tre DsiRNA dobbelthuse rettet mod rotte Ki-67 mRNA blev udformet (Integrated DNA Technology, Coralville, IA, USA). Sekvenserne for de tre DsiRNAs er som følger; 1) Ki-67 -2; Sense-sekvensen 5 ‘- CGA ACA AAG UCA UCA GAC ACA GUG A-3’; antisense-sekvens 5’UCA CUG UGU CUG august ACU UUG UUC GUU-3 ‘; 2) Ki-67-7; Sense-sekvensen 5 ‘- CAA GAG UGA GGG AGU GCC UUU GAA G-3’; antisense-sekvens 5 ‘- CUU CAA AGG CAC UCC CUC ACU CUU GUU -3 «og 3) Ki-67-9; Sense sekvens 5’CCA CCA GAG CCA AUA GAU ACU UCA G-3 ‘og antisense-sekvens 5’CUG AAG UAU CUA UUG GCU CUG GUG GUG-3’. En irrelevant DsiRNA, i det følgende benævnt som “kontrol” DsiRNA designet, og har følgende sekvens; Sense sekvens 5’CAA GAG UGA GGG AGU GCC UUU GAA G-3 ‘; antisense-sekvens 5 ‘- CUU CAA AGG CAC CGG AUC ACU CUU GUU-3’. Selv forkortelsen “DsiRNA” oprindeligt bruges til at understrege, at de længere siRNAs blev brugt i den aktuelle undersøgelse, er den generiske betegnelse “siRNA” i flæng i hele teksten.

Cell Culture

Transplanterbare rotte-afledte TCC celler (AY-27 celler) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Ronal Moore (University of Alberta, Canada). Karakteriseringen af ​​en blære tumormodel ved hjælp af denne transplanterbar cellelinie er blevet rapporteret [32]. Cellerne blev holdt i monolag, i et dyrkningsmedium bestående af RPMI-1640 (Gibco-BRL) suppleret med 10% FBS, 30 mM HEPES (pH 7,3), 1 mM pyruvat, penicillin-streptomycin og 2,0 g /l NaHCO

3. Celler blev holdt ved 37 ° C i 5% CO

2 og 95% luft atmosfære ved fremgangsmåden ifølge Xiao

et al

[32]. AY-27 celler blev passeret når sammenflydende ved standard trypsinisering og reculturing procedure. Hvor det er angivet, til sammenligningsformål, human-afledte T-24 blærecancer cellelinier (American Type Culture Collection) blev også anvendt i denne undersøgelse og opretholdt i vævskultur som beskrevet for AY-27-celler.

SiRNA Transfektion

dagen før transfektion blev cellerne trypsiniseret, fortyndet med frisk medium og overført til plader med 12 brønde (0,8-1,0 × 10

5cells /brønd). DsiRNAs blev transficeret under anvendelse af specielt udformet reagens til siRNA transfektion (Lipofectamine ™ RNAiMax) ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen, USA). Rutinemæssigt transfektion blev udført ved 8-10% cellekonfluens.

Curcumin Behandling

Når angivet, blev tumorceller behandlet med forskellige koncentrationer af curcumin (Sigma-Aldrich, USA), enten alene eller i kombination med DsiRNA. Curcumin blev opløst i DMSO, og i et givet forsøg, slutkoncentrationen af ​​DMSO var altid mindre end 0,1% vol.

cellevækst Curve

Til evaluering tumorproliferation, tumorvækst blev vurderet ved at måle det samlede antal celler på forskellige stadier. På hvert trin blev celler løsgøres ved trypsinisering, vasket med PBS, farvet med trypanblåt og de levende celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer. Hver eksperimentel betingelse blev gentaget tre til seks gange.

MTT assay

antiproliferative virkninger af siRNA mod Ki-67 i nærvær eller fravær af curcumin blev bestemt ved MTT-assayet. Assayet var baseret på evnen af ​​mitokondrier til at reducere 3- (4, 5 dimethylthiaol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) farvestof i rotte (AY-27) og humane (T-24) blærekræft celler som beskrevet af Plumb [33]. Kort beskrevet efter udsættelse af cellerne til forskellige behandlingsbetingelser blev mediet fjernet, skyllet med PBS, og MTT-opløsning (5 mg /ml i RPMI-medium) blev tilsat og inkuberet i 37 ° C i 3 timer. Efterfølgende blev mediet fjernet og erstattet med en syre-isopropanol opløsningsmiddel til at opløse bundfaldet. Indholdet blev placeret på et rysteapparat i 5 minutter og absorbans måles ved 570 nm.

kvantitativ real-time PCR (qPCR)

Efter transfektion med siRNA’er og /eller behandling med curcumin blev celler høstet på et passende interval og totalt RNA blev fremstillet ved PureLink RNA mini kit (Invitrogen, USA). Til cDNA-syntese blev 1 ug totalt RNA revers transkriberet til cDNA i 20 pi reaktioner under anvendelse Quantitect Revers transkription (Invitrogen, USA). qPCR blev udført med Lyset cycler® 480 detektionssystem (Roche, USA) under anvendelse af Brilliant® SYBR® Green QPCR Master mix protokol (Stratagene, USA). Kort beskrevet blev 2 pi cDNA amplificeret ved PCR i 25 pi reaktioner indeholdende 12,5 pi 2 x SYBR green reagenser og 0,2 pM af hver af primerne. Den indledende inkubering i 10 minutter ved 95 ° C blev efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min. Hvert forsøg blev udført tredobbelt

Ki-67 Protein Expression:. Immunfluorescensfarvning

Celler blev dyrket på 25 mm dækglas i 6-brønds plader. Efter udsættelse for siRNA og /eller curcumin under forskellige betingelser blev celler vasket med koldt PBS og fikseret med 4% formaldehyd. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med Ki-67 primære antistof (M19, Santa Cruz Biotechnology Inc.,) (1:100) i 3 timer og vasket tre gange med PBS. Dækglassene blev derpå inkuberet med FITC-mærket sekundært antistof (1:400) i mørke i en time ved stuetemperatur, vasket med PBS og farvet i 10 minutter med propidiumiodid (PI) opløsning. Dækglassene blev derefter vasket med PBS og monteret på en slæde i nærvær af monteringsmedium (antifade opløsning, Invitrogen, USA). Glassene blev derefter set under Bio Rad Radiance 2001-system koblet til et Olympus IX70 mikroskop med 60 × og 40 × nedsænkning olie mål (UAp0340, NA 1.35). En dobbelt linje Kr /Ar-ion laser kilde blev brugt til billeddannelse med excitation indstillinger på 488 nm for FITC og 588 nm for PI.

Påvisning af apoptose ved Annexin V Assay

Apoptose blev målt ved hjælp af PE Annexin V Apoptose Detektion Kit I (BD Biosciences, USA) i henhold til producentens protokol. Kort fortalt, efter udsættelse for siRNA med eller uden curcumin blev cellerne vasket med koldt PBS og derefter resuspenderet i bindingsbuffer efterfulgt af tilsætning af PE Annexin V og 7-amino-Acitomycin (7-AAD) og analyseret i Beckman Coulter s Epics XL-MCL ™ flowcytometer, (USA). Rutinemæssigt den gennemsnitlige fluorescens afledt fra 20.000 celletal per prøve blev registreret.

Cell Cycle Analysis

For at bestemme virkningen af ​​anti Ki-67 DsiRNA og /eller curcumin på cellecyklusfaser, AY-27-celler blev udsat for forskellige eksperimentelle betingelser, medierne fjernet, og cellerne blev løsnet ved trypsinbehandling. Cellerne blev derefter vasket med PBS og fikseret i iskold 70% ethanol i 2 timer ved -20 ° C. Cellerne blev derefter vasket en gang med PBS, resuspenderet i 300 pi en iskold modificeret PI opløsning (50 ug /ml PI opløsning, 0,1% Triton X-100 og 0,1% natriumcitrat, i PBS) og inkuberet i 30 minutter inden analyse. PI-fluorescens blev målt ved Beckman Coulter s Epics XL-MCL ™ flowcytometer, (USA). Rutinemæssigt blev den gennemsnitlige fluorescens afledt fra 20.000 celletællinger pr prøve registreres. Cellerne blev scoret som procentdelen af ​​celler i hver af cellecyklus faser (G

o /G

1, S og G2 /M).

Western blot analyse

Blære cancerceller, efter udsættelse for curcumin og DsiRNA under forskellige betingelser, blev trypsinbehandlet, vasket med PBS, og lyseret med iskold RIPA (Sigma- Cat # R0278) puffer. Lysaterne blev holdt på is i 20 minutter, vortexet 3-4 gange, og derefter centrifugeret i en mikrofuge ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 0-4 ° C. Supernatanterne blev fjernet og analyseret for proteinindhold. Prøver (40 ug) af protein fra hver prøve blev opløst i 4 × NuPage lithium-dodecylsulfat (LDS) og underkastet SDS-PAGE under reducerende betingelser. De separerede proteiner blev overført til en nitrocellulosemembran og blokeret i enten 5% bovint serumalbumin (BSA) eller 5% fedtfri tørmælk i en Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 (TBST) ved standardprocedurer. Membranerne blev derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med de primære antistoffer mod følgende antigener: β-actin, cyklin E, og p53 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). Andre anvendte antistoffer var imod spaltet Caspase3, phosphoryleret-RB (pRb-P) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA), cyklin D1, (BD Bioscience, San Jose, CA), Ki-67, NF-KB (p65 underenhed), P27 /Kip og p21 (Abcam, Cambridge, MA). Blottene blev derpå vasket grundigt med TBS-T og inkuberet med passende peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse eller anti-kanin (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) sekundære antistoffer ved fortyndinger 1:15,000 og 1:20,000 henholdsvis 2 timer ved stuetemperatur før den sidste vask med TBST. Proteinbåndene blev detekteret ved forøget kemiluminescens-system under anvendelse SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). KODAK billede Station 440CF (Kodak Scientific Imaging Systems, New Haven, CT) blev anvendt til at visualisere og kvantificere signalet netto intensitet bands. Alle eksperimenter blev udført i triplikater. Repræsentative blots er vist.

Protein Assay

Proteinindhold i cellelysater blev målt under anvendelse Micro BCA ™ proteinassaykit (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) under anvendelse af bovint serumalbumin som den interne standard.

Statistisk analyse

Hvor angivet, værdier præsenteres som gennemsnit ± SE for (n) bestemmelser. Data, var underlagt statistisk analyse af parrede t-test ved hjælp af Microsoft Excel-programmet og værdierne med P. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Hæmning af Ki-67 Gene Expression og Cell Proliferation af DsiRNA

in vitro

effektiviteter af tre DsiRNA konstruerer målrettet at rotte Ki-67 mRNA blev testet som beskrevet ovenfor i AY-27 celler. Som vist i figur 1A, ud af de tre DsiRNAs (Ki-67-2, -7, -9), Ki-67-7 udviste maksimal inhibering. MRNA-ekspression, analyseret ved qPCR, viste en 39%, 50% og 28% fald i ekspressionen af ​​Ki-67 mRNA ved Ki-67-2, Ki-67-7 og Ki-67-9 henholdsvis sammenlignet med celler behandlet med transfektionsreagens alene. Tilsvarende celleviabilitetstest ved MTT viste, at Ki-67-7 behandling var den mest effektive af de tre (fig. 1B). Således blev Ki-67-7 valgt som den mest effektive DsiRNA mod Ki-67-mRNA til efterfølgende undersøgelser. Endvidere viste dosis-respons-undersøgelser, at Ki-67-7 var mest effektive ved 10 nM koncentration (1c). Under vores forsøgsbetingelser nåede en yderligere stigning i Ki-67-7 koncentration ikke øge den anti-proliferative effekt af siRNA.

× 10

5 celler /brønd) som beskrevet i Materialer og Metoder. Efter 24 timer blev de transficeret med hver af siRNA-konstruktioner (Ki-67-2, Ki-67-7 og Ki-67-9) rettet mod Ki-67-mRNA. Efter 48 timer blev RNA ekstraheret og niveauerne af mRNA blev bestemt ved kvantitativ PCR som beskrevet i Methods. Celler behandlet med transfektionsreagens alene blev anvendt som kontrol. Hastigheden for ekspression af Ki-67 mRNA blev normaliseret til ekspressionen af ​​β-actin. Værdier repræsenterer data fra én (to) forsøg under anvendelse af gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser. b) AY-27 celler blev dyrket i 12-brønd (0,8 x 10

5 celler /brønd) plader i 24 timer og transficeret med forskellige siRNA konstruktioner som beskrevet i Fremgangsmåder. Cellelevedygtighed blev bestemt 48 timer efter transfektion ved MTT-assayet. Celler behandlet med transfektionsreagens alene tjente som kontrol (= 100%). Barer angiver værdier, der midlerne ± S.E af tre bestemmelser. (

* P 0,05). c) AY-27 celler blev dyrket i plader med 12 brønde (0,8 x 10

5 celler /brønd) som beskrevet i Fremgangsmåder. Fyrre timer efter siRNA transfektion blev virkningen af ​​forskellige koncentrationer af Ki-67-7 på cellelevedygtigheden bestemt ved MTT-assayet. Celler behandlet med transfektionsreagens alene tjente som kontrol. Cell levedygtighed værdier er udtrykt som procent kontrol og er de midler ± SE for 3-8 bestemmelser (

* P 0,05,

*** P 0,005).

Effekt af curcumin på Tumor Proliferation: Synergi med Ki-67-7

virkningerne af curcumin og Ki-67-7 blev testet i både human-afledte (T-24) og rotte-afledt (AY-27) blære cancerceller. Sekvenssammenligninger viste, at der var 80% homologi i målsekvensen af ​​Ki-67-7 mellem rotte og humane Ki-67 mRNA’er. I dosis-respons-undersøgelser observerede vi, at tumorcellevækst blev inhiberet af curcumin i en dosisafhængig måde (fig. 2A og 2B) i begge celletyper, men T-24-celler var mere følsomme over for curcumin end AY-27 celler ved 20 uM og derover. Men ved 10 μ M, graden af ​​inhibering (25-30%) var ens i begge celletyper. I begge tilfælde blev der observeret en drastisk reduktion (60-85%) i celle levedygtighed mellem 10 og 20 uM curcumin. Men med henblik på at sammenligne de kombinatoriske virkninger af DsiRNA og curcumin (CusiRNA), den lavere dosis (10 uM) af curcumin blev anvendt sammen med den optimale dosis (10 nM) i DsiRNA (Ki-67-7). Dataene viste næsten fuldstændig (85%) inhibering af cellelevedygtighed under den kombinerede behandling af curcumin og DsiRNA (fig. 3A og 3B). Kontrol siRNA havde ubetydelig effekt på cellelevedygtighed tyder specificiteten af ​​Ki-67-7 mod sit mål.

T-24 (2a) og AY-27 (2b) celler blev udsået i 12-brønds plader (0,8 × 10

5 celler /brønd) og dyrket i 48 timer (40-50% konfluens) som beskrevet i Fremgangsmåder. Efter eksponering for forskellige koncentrationer af curcumin i 24 timer blev cellerne vasket med PBS og inkuberet i yderligere 24 timer i curcumin-frit medium. Celler inkuberet med DMSO (0,1%) alene blev behandlet som kontroller. DMSO alene havde ringe indvirkning på tumorcellevækst (data ikke vist). Celleproliferation blev vurderet på grundlag af cellelevedygtighed, målt ved MTT-assayet. Cellelevedygtighed blev udtrykt som procent af levedygtigheden observeret i DMSO-behandlede kontrolceller. Værdier er fra et repræsentativt (to) (2a) eller 3-8 (gennemsnit ± S.E.) konstateringer (2b).

* P 0,05,

** P 0,01,

*** P. 0,005

Samme antal (0,8 × 10

5 celler /brønd) af blære cancerceller T-24 (3a) og AY-27 (3b) dyrket som beskrevet i Metode enten transficeret med Ki-67-7 eller kontrol DsiRNA (10 nm) eller behandlet med transfektionsreagens alene i 24 timer. Efterfølgende hvor det er angivet, curcumin (10 uM) blev sat til cellerne og inkuberet i 24 timer efterfulgt af yderligere 24 timers inkubering i fravær af curcumin. Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assay i slutningen af ​​72 timer fra transfektion. Celler behandlet med DMSO plus transfektionsreagens tjente som kontrol. Data præsenteret er middelværdien ± S.E. på 3-5 bestemmelser (

* P 0,05,

** P 0,01). 3c) AY-27-celler (0,8 x 10

5 celler /brønd) blev behandlet nøjagtigt som beskrevet ovenfor i forklaringen til figur 3A og 3B og i slutningen af ​​24, 48 og 72 timer efter curcumin behandling (som er den samme som 48, 72 og 96 timer efter siRNA transfektion), blev cellevækst vurderet på grundlag af celletal, som beskrevet i Methods. Dataene er gennemsnit ± S.E. af tre bestemmelser.

antiproliferativ virkning blev også bestemt ved at overvåge kurven cellevækst. Vækstkurverne baseret på celleantal blev bestemt ved 24, 48 og 72 timer efter DsiRNA og curcumin behandling. Kombineret behandling (CusiRNA) resulterede i en markant hæmning af celledeling og efterlignede den samme tendens som for levedygtighed celle studier (fig. 3C). De cellulære protein værdier også korreleret godt med vækstkurver (data ikke vist).

Virkninger af Ki-67-7 og Curcumin på Ki-67 mRNA og protein Expression

For at afgøre, om reduktionen i tumorlevedygtighed celle under CusiRNA behandling var relateret til Ki-67-proteinniveauer målte vi niveauerne af både Ki-67 mRNA og proteinekspression. Data viser reduktioner i niveauerne af Ki-67 mRNA med 17%, 37% og 57%, når udsat for curcumin, Ki-67-7 og CusiRNA (fig. 4A). Ligeledes under anvendelse af immunfluorescensfarvning teknik, vi observeret, at i modsætning til Ki-67-7, curcumin

per se

havde minimal indflydelse på Ki-67-protein-ekspression (fig. 4B).

a) AY -27 celler blev behandlet med Ki-67 siRNA i nærvær eller fravær af curcumin præcis som beskrevet i forklaringen til figur 3A og 3B. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev RNA ekstraheret og Ki-67-mRNA-ekspression blev bestemt ved kvantitativ PCR under anvendelse af β-actin som intern standard som beskrevet i Methods. Ki-67-mRNA-niveauer udtrykkes som procent af graden af ​​ekspression i kontrolceller, som blev behandlet med transfektionsreagens og DMSO. Streger indikerer værdier, som er gennemsnittet ± S.E. af tre bestemmelser. b) AY-27-celler blev dyrket på dækglas placeret inde plader med 12 brønde og behandlet med siRNA (Ki-67-7), curcumin eller som en kombination, som beskrevet i forklaringen til figur 3A og 3B. Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden blev celler eksponeret for Ki67 primært antistof (M19) og FITC-mærket sekundært antistof efterfulgt af PI (propidiumiodid), og observeret under konfokal mikroskopi som beskrevet i Methods. Scale bar indsætter = 5 um. Øget nedregulering af Ki-67 protein på grund af Ki-67-7 blev observeret.

induktion af apoptose ved Ki-67-7 og Curcumin

Tab af cellelevedygtighed er ofte et resultat af apoptose eller nekrose. Omfanget af apoptose, en tidlig indikator for celledød, blev kvantificeret ved flowcytometrisk analyse ved anvendelse Annexin V at detektere de forskellige stadier af apoptose (fig. 5). Data tyder mild induktion af apoptose, når cellerne blev separat behandlet med curcumin eller Ki-67-7. Imidlertid blev omfanget af apoptose (højre to kvadranter på fig. 5) i nærvær af CusiRNA sig at være synergistisk (36% vs 13% for curcumin og 14% for Ki-67-7) efter korrektion for basal apoptose ( 11%) i kontrolceller (fig. 5). Figuren viser også (venstre øverste kvadrant i fig. 5), at graden af ​​nekrose (Annexin V negativ, 7AAD positive) var minimal under alle behandlingsbetingelser.

AY-27 celler blev behandlet med anti -ki-67 siRNA, curcumin eller i den kombinerede tilstedeværelse af både som beskrevet i forklaringen til figur 3A og 3B. Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden blev cellerne høstet, farvet med fluorescens-konjugeret Annexin V og 7AAD som beskrevet i Methods. Efter flowcytometrisk analyse blev procentdelen (antal skær i figuren) af normale celler eller dem, der gennemgår apoptose og nekrose beregnet ved anvendelse passende software (Flow Jo v.9). Hastigheden af ​​apoptose blev målt ved tilsætning procenterne i de højre to kvadranter i hver af figurerne. Dataene er fra en repræsentant (af to identiske) eksperiment.

Ki-67-7 og Curcumin på cellecyklusfaser

Effekten af ​​Ki-67-7 på cellecyklus blev bestemt i nærvær eller fravær af curcumin. Data viser en generelt skift i retning af G0 /G1-fasen i alle de behandlingsbetingelser, men effekten var maksimal i nærvær af CusiRNA (fig. 6). Der var ingen signifikant ændring i G2 /M-fase, når separat udsat for enten curcumin eller Ki-67-7, men der blev observeret en 33% fald når cellerne blev eksponeret for CusiRNA. Interessant, med en stigning i G0 /G1 og fald i G2 /M-faser, der var en to-fold shift (forholdet G0 /G1 til G2 /M) mod vækststandsning i nærvær af CusiRNA sammenlignet med kontrol (fig. 6 ).

AY-27 celler blev behandlet med Ki-67-7, curcumin eller med dem begge, som beskrevet tidligere i forklaringen til figur 3A og 3B. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev cellerne behandlet med PI og fordelingen af ​​celler i forskellige cellecyklus faser blev bestemt ved flowcytometri som beskrevet i Methods. Celler blev scoret som procentvise fordeling af celler i hver af de cellecyklusfaser (G

o /G

1, S og G2 /M). Barer angiver værdier, som er middel ± SE af tre bestemmelser

Effekt af Ki-67-7 og Curcumin om Multiple signalering:. Molekylære mål i cellecyklus og apoptose

Hæmning af cellecyklusprogression, induktion af apoptose eller en kombination af begge, er de vigtige begivenheder i forbindelse med tumorinhibering. Data præsenteret ovenfor tyder klart, at en kombination af curcumin og Ki-67-7 påvirke både begivenhederne. For at forstå den rolle, som nogle af molekylære mellemprodukter, der sandsynligvis vil påvirke disse begivenheder, bestemte vi niveauerne af nogle af de regulatoriske proteiner associeret med apoptose og cellecyklusprogression. Øgede niveauer af spaltet-caspase3 ved Western blot analyse bekræftede induktion af apoptose, der mest blev udtalt i CusiRNA gruppen (fig. 7). Der var imidlertid en markant reduktion i niveauerne af tumorsuppressorproteinet, p53, i samme gruppe. Cyclinerne D1 og E, proteinerne forbundet med G1-S overgangen i cellecyklus faser, blev også dybt inhiberet af CusiRNA. Som forventet blev reduktion i cyclin D1 forbundet med en reduktion i niveauerne af pRb-P. Reduktion i p53 var også forbundet med en reduktion i p21, en inhibitor af cyclin E. Men det var stigningen i p27-protein, en anden inhibitor af cyclin E, der syntes at korrelere godt med inhibering af cyclin E i CusiRNA gruppen. Disse observationer var ens i begge celletyper. På den anden side, inhibering af transkriptionsfaktoren NF-KB var mere tilskrives curcumin behandling i AY-27 celler, hvorimod i T-24-celler, blev det primært inhiberet af CusiRNA. Salg

blære cancerceller (T -24 og AY-27) blev dyrket og udsat for Ki-67-7 og curcumin som beskrevet ovenfor i forklaringen til figur 3A og 3B. Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden blev samlet protein ekstraheret og udsat for Western blotting under anvendelse af egnede antistoffer som beskrevet i Methods. Til formål med at knytte proteiner med specifikke roller, blev de grupperet i forskellige kategorier, såsom gentranskription (A), cellecyklusfremadskriden (B) og apoptose (C). β-actin blev anvendt som intern kontrol. Da forskellige proteiner (for eksempel cyclin D1 og NF-KB) fra den samme membran blev identificeret i forskellige kategorier, er det samme β-actin skamplet vises på mere end én lejlighed. Viste data er western blots fra et enkelt forsøg, som er repræsentativt for 2-3 identiske eksperimenter.

Diskussion

Transitional cell carcinoma (TCC) af urinblæren er den mest almindelige cancer i urinvejene.