PLoS ONE: Identifikation af nye biomarkører for metastatisk kolorektal cancer Brug angiogenese-Antibody Array og intracellulær signalering Array

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de tre førende årsager til dødelighed af kræft. CRC dræber over 600.000 mennesker om året på verdensplan. Den mest almindelige dødsårsag fra CRC er metastase til fjerne organer. Men biomarkører for CRC metastaser forbliver dårligt defineret. Vi sammenlignede primære og metastatiske CRC cellelinier til deres angiogenese-protein-profiler og intracellulære signalsystemer profiler for at identificere hidtil ukendte biomarkører for CRC metastase. Til dette formål anvendte vi primære og metastatiske CRC-cellelinier som et modelsystem og normal human colon cellelinie som en kontrol. Den angiogenese profiler to isogene CRC cellelinier, SW480 og SW620, og HT-29 og T84 viste, at VEGF blev opreguleret i både SW620 og T84 henviser koagulationsfaktor III, IGFBP-3, DPP IV, PDGF AA /AB, endothelin I og CXCL16 blev nedreguleret specifikt i metastatiske cellelinier. Desuden fandt vi, at TIMP-1, amphiregulin, endostatin, angiogenin blev opreguleret i SW620 mens nedreguleret i T84. Angiogenin blev nedreguleret i T84 og GM-CSF blev også nedreguleret i SW620. For at inducere CRC celle metastase, behandlede vi cellerne med pro-inflammatoriske cytokin IL-6. Ved IL-6 behandling blev epitel-mesenkymale overgang induceret i CRC-celler. Når DLD-1 og HT-29-celler blev behandlet med IL-6; Akt, STAT3, AMPKα og dårlige phosphoryleringsniveauerne blev forøget. Interessant nok viste SW620 det samme signal aktivering mønster med IL-6 behandling af HT-29 og DLD-1. Vores data tyder på, at Akt, STAT3, AMPKα og Bad aktivering kan være biomarkører for metastatisk kolorektal cancer. IL-6 behandling specifikt reducerede phosphoryleringsniveauerne af EGFR, HER2-receptoren, Insulin R og IGF-1R i receptortyrosinkinase-array studie med HT-29. Tilsammen har vi identificeret nye biomarkører for metastaserende CRC gennem angiogenese-antistof-array og intracellulære signalering array-studier. Nuværende undersøgelse tyder på, at disse nye biomarkører kan bruges som CRC prognose biomarkører, og som potentielle mål for metastaserende CRC terapi

Henvisning:. Chung S, Dwabe S, Elshimali Y, Sukhija H, ArOH C, Vadgama JV (2015) Identifikation af Nye biomarkører for metastatisk kolorektal cancer Brug angiogenese-Antibody Array og intracellulær signalering Array. PLoS ONE 10 (8): e0134948. doi: 10,1371 /journal.pone.0134948

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: 5. november 2014 Accepteret: 15 juli 2015; Udgivet: 10 August, 2015

Copyright: © 2015 Chung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH, NCI, NIMHD, NCATS) Tilskud til JV Vadgama: U54 CA143931, U54MD007598, UL1TR000124. S. Steven Chung er en lærd understøttes af kliniske Forskning Uddannelse og karriereudvikling af NIMHD 5MD007610, pilot pris fra karriereudvikling støtte fra U54CA143931 U54MD007598 og

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser .

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform hos mænd og den anden hos kvinder over hele verden, der tegner sig for ca. 608 tusind dødsfald på verdensplan [1]. Trods betydelig forbedring i de terapeutiske modaliteter, over 50% af CRC patienterne til sidst udviklede tilbagevendende sygdom og metastase fører til død inden for 5 år efter diagnosen [2]. Metastase forekommer i en fase med tumorudvikling ved metastatiske variante celler, der besidder invasive aktiviteter kendetegnet ved øget cellemigration, vævsinvasion, og orgel kolonisering. Til dato, er de mekanismer, der forårsager CRC metastaser ikke fuldt forstået.

Kræft specifikke biomarkører spiller en vigtig rolle i kræft afsløring, prognose, forebyggelse og behandling. I løbet af de sidste fire årtier, er blevet gjort en betydelig indsats for at karakterisere nyttige biomarkører for CRC [3-5]. Der er imidlertid ingen værdifulde biomarkører for CRC metastase. Derfor er det vigtigt at identificere nye biomarkører, der kan bruges til at forudsige metastatiske potentiale CRC, som prognostiske indikatorer og tjene som cellulære mål for den målrettede-terapi på CRC. I vores foreliggende undersøgelse har vi udnyttet de angiogenese-relaterede antistof-arrays med primære og metastatiske CRC cellelinjer at identificere og karakterisere de hidtil ukendte biomarkører forbundet med colorektal cancer metastase.

angiogenese og udvikling af metastaser er uløseligt forbundet. Eksperimentelle data antyder, at tumormetastaser påvirkes af opløselige faktorer secerneret fra den oprindelige tumor [6-8]. Heri, undersøgte vi de angiogenese-relateret protein udtryk profiler til identifikation metastase specifik angiogenese gensæt. I første omgang, vi studerede to isogene kolorektale cancer cellelinjer SW480 og SW620. Den primære cancercellelinie SW480 blev afledt fra en Dukes stadium B colon carcinoma opnået fra en 50-årig mandlig patient og den metastatiske SW620 varianten blev afledt fra den samme patients tumor metastaseret til lymfeknuderne [9]. Eftersom variationen fra genetisk baggrund kan i vid udstrækning undgås i disse to cellelinjer, udgør de en unik model til undersøgelse kolorektal cancer metastase. Vi undersøges yderligere et andet par af primære og metastatiske cancer cellelinjer, HT-29 og T84. T84 blev afledt af CRC celler, der var metastaseret til lungen [10].

Adskillige proinflammatoriske cytokiner frigivet af medfødte og adaptive immunceller har vist sig at regulere væksten af ​​cancerceller og bidrage til tumor promotion og metastase . Blandt disse interleukin-6 (IL-6) tager en central plads i human cancerudvikling og metastase. En øget ekspression af IL-6 er blevet associeret med en ugunstig prognose hos patienter med forskellige typer af cancer, herunder colorectal cancer [11]. Flere undersøgelser har fundet en forøget ekspression af IL-6 i patienter med CRC, hvor IL-6-niveauer er forhøjede i serum fra patienter og i tumorvæv selv [12-13]. IL-6-ekspression var forbundet med tumor stadium, størrelse, metastase og overlevelse af patienter med colorectal cancer [14]. Baseret på disse observationer, vi behandlede kolorektal cancer celler med IL-6 til at fremkalde dem til at blive mere invasive og metastatiske. Vi overvågede ændringer i epitel-mesenkymal overgang fænotype, stamcellefaktor markør Oct-4 og EMT driver STAT3 (signal transducer og aktivator af transkription 3) phosphorylering som respons på IL-6 behandling på en dosisafhængig måde. Vores undersøgelse giver yderligere bevis på CRC metastaser patofysiologi, og endnu vigtigere, opdagelsen af ​​nye biomarkører og potentielle lægemiddelkandidater mål for metastaserende CRC terapi.

Materialer og Metoder

Kræft cellelinjer og Cytokine

SW480, SW620, HT-29, RKO, T84 og DLD-1 CRC cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). Normal human colon cellelinie FHC (CRL-1831) blev også købt fra ATCC. De blev holdt i en monolagskultur i DMEM /F12 (Dulbeccos modificerede Eagle-medium) med 10% føtalt bovint serum, 2,5% L-glutamin og 0,5% Penicillin /Streptomycin i hele denne undersøgelse. IL-6 blev købt fra Sigma (katalognummer: I3268, Sigma, St. Louis, MO). IL-6 blev tilsat til cellekulturen ved 1, 5, 10 enheder per ml efter behov. En enhed defineres som den mængde IL-6 kræves for at inducere halvmaksimal proliferation af T-1165 celler

in vitro

.

Angiogenese-relateret antistof Array

Humant angiogenese Array Kit blev købt fra R . Catalog # 7323). For HT-29 og DLD-1, IL-6 var forbehandlet og cellelysater blev fremstillet. Hele proteinlysater blev fremstillet ved anvendelse lysepuffer, der blev leveret i kittet. 100 pi af hver lysater blev anbragt på membranen vindue af antistoffet arrayet-slide. Lysatet behandles objektglas blev inkuberet i natten over ved 4 ° C på en orbitalryster. Objektglasset blev derefter vasket med 100 pi 1X-array vaskebuffer og inkuberet på orbitalryster i 5 minutter ved stuetemperatur. Denne procedure blev gentaget tre gange mere. 75 pi 1X Detection Antibody Cocktail blev tilsat til hver af de 16 brønde og dækket med en forseglingstape tilvejebragt i kittet. Det blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur på en orbital ryster. Derefter blev tre gange af vaske udføres, og objektglasset blev inkuberet i 30 minutter med 75 pi 1X HRP-koblet streptavidin. Objektglasset blev vasket og behandlet med Lumi Glo og peroxid. Bio-rad Gel Documentation System blev brugt til at tage detaljerede billeder af array ved hjælp af Mængde One-software ved hjælp af ChemiDoc XRS funktion.

Aktiveret receptortyrosinkinase arrays

Kræftceller blev vasket med PBS indeholdende 100 mmol /l Na

3VO

4 og opløst i lysis buffer. 300 ug totalt protein blev inkuberet med Humane Phospho-RTK Arrays (R CXCL16, GM-CSF, endotelin-1, endostatin, IGFBP-3 og PDGF-AB /BB kan udgøre en universel metastase signatur i CRC. I mellemtiden, SW620 specifikt protein, fx koagulationsfaktor III kan være en lymfeknude rettet angiogenese faktor. Tilsvarende T84 specifikke proteiner, fx angiogenin og amphiregulin, sandsynligvis lunge-specifik metastatiske angiogenese proteiner. Vores resultater viser, at i primære tyktarmskræft celler, PDGF’er udtrykt mens i metastatiske kolon kræftceller, kan PDGF ekspression nedreguleres. Imidlertid kan det stromale PDGF signalering for metastatiske cancerceller overudtrykkes i patienter med tyktarmskræft. Det er stadig uvist, om dette er tilfældet i kliniske prøver af kolorektale tumorer.

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT), en transdifferentiering proces karakteriseret ved nedsat epitel markører såsom E-cadherin og øget mesenkymale markører såsom vimentin har været impliceret at spille en rolle, hvor transformerede epitelceller erhverve evnen til at invadere, modstå apoptose og metastaserer [29]. Navnlig EMT proces resulterer ofte i ekspressionen af ​​cancer stamceller træk [30]. Vi har behandlet CRC-celler med cytokin IL-6 og induceret EMT fænotype samtidig med pSTAT3 og Oct-4-ekspression. Både autokrin og parakrin IL-6 signalering inducerede tumor aggressivitet. Vore data er konsistente med de kliniske data, hvor IL-6 spiller en rolle i tumorgenese og metastase (28). Derudover har vi vist de specifikke intracellulære signalsystemer komponenter, der aktiveres ved IL-6, STAT3, Akt, AMPKα og BAD. Endelig har vi opdaget, at specifikke receptor tyrosinkinase (EGFR, HER2) aktiviteter nedreguleres af IL-6 i humane CRC HT-29-celler. Yderligere undersøgelser er rettet mod udvikling af inhibitor cocktails til disse nye CRC biomarkører i et klinisk anvendelse. Sammenfattende har vores undersøgelse identificeret en potentiel vej til målrettet-terapi for CRC ved hjælp af de nye biomarkører for metastaserende CRC.

Støtte Information

S1 Fig. Angiogenese-relateret protein udtryk profiler af FHC, SW480, SW620, HT-29 og T84. Salg Primære og metastatiske kolorektale cancercellelinjer SW480, SW620, HT29 og T84 blev analyseret for angiogenese protein udtryk profiler. SW480 udtrykte koagulationsfaktor III, CXCL16, GM-CSF, endothelin 1, endostatin, IGFBP-3, PDGF-AB /BB tydeligvis mens ikke udtrykke VEGF. SW620 udtrykte VEGF mens nedreguleret koagulationsfaktor III, CXCL16, GM-CSF, endothelin 1, endostatin, IGFBP-3, PDGF-AB /BB udtryk. Sideløbende kolorektale cancer cellelinjer HT-29 og T84 blev analyseret for angiogenese protein udtryk profiler. I HT-29. DPP IV, TIMP-1, angiogenin, endothelin, amphiregulin og PDGF /AB, blev BB-proteiner udtrykt henviser VEGF ikke blev udtrykt i HT-29. I T84, blev VEGF udtrykt mens DPP IV, TIMP-1, angiogenin, endothelin, amphiregulin og PDGF /AB, BB ekspressionsniveauerne blev nedsat

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134948.s001

(JPG)

S2 fig. Menneskelig angiogenese vifte justering for metastaser signatur.

At identificere fælles proteiner, der blev opreguleres eller nedreguleres selektivt i metastatiske CRC-cellelinjer, to metastatiske CRC cellelinjer, SW620 og T84, deres angiogenese arrays blev rettet ind med primær cellelinie SW480. Primær CRC cellelinje SW480 blev anvendt som en reference-cellelinie, blev lymfe-metastatisk SW620 celle-array fremlagt. Samtidig blev lunge-metastatisk T84 vifte justeret. VEGF blev opreguleret i begge SW620 og T84-celler. Tværtimod CXCL16, GM-CSF, endostatin, endothelin-1, IGFBP-3 og PDGF /AB, blev BB protein ekspressionsniveauer faldt i både SW620 og T84 celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134948.