PLoS ONE: Genetisk Ablation af Bel-x Dæmper invasiv uden at påvirke Apoptose eller tumorvækst i en musemodel af bugspytkirtlen Neuroendokrine Kræft

abstrakt

tumorcelledød moduleres af en iboende celledød pathway styret af pro- og anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien. Opregulering af anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer er blevet vist at undertrykke celledød i prækliniske modeller for human cancer og er impliceret i human tumor progression. Tidligere gain-of-funktion undersøgelser i RIP1-TAG2 model af pancreas-ø carcinogenese, der involverer ensartede eller fokal /tidsmæssig overekspression af Bcl-x

L, demonstrerede accelereret tumor dannelse og vækst. For specifikt at vurdere rollen af ​​endogent Bcl-x i reguleringen apoptose og tumorprogression i denne model, vi manipuleret en pankreatisk β-celle-specifikke knockout af begge alleller af

Bcl-x

hjælp af Cre-LoxP system homolog rekombination. Overraskende var der ingen mærkbar effekt på tumor celle apoptose satser eller på tumorvækst i

bcl-x

knockout-mus. Andre anti-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer blev udtrykt, men ikke indholdsmæssigt ændret på mRNA niveau i

Bcl-x

-null tumorer, der tyder på redundans uden kompenserende transkriptionel opregulering. Interessant nok blev forekomsten af ​​invasive carcinomer reduceret, og tumorceller, der mangler Bcl-x blev svækket i invasion i en to-kammer trans-brønd assay under betingelser efterligner hypoxi. Medens funktionen af ​​Bcl-x i at undertrykke apoptose og derved fremme tumorvækst er åbenbart overflødig, genetiske ablation implicerer Bcl-x i selektivt letter invasion, stemmer overens med en nylig rapport dokumenterer en pro-invasiv evne Bcl-x

L ved eksogen overekspression

Henvisning:. Hager JH, Ulanet DB, Hennighausen L, Hanahan D (2009) Genetisk Ablation af Bd-x Dæmper invasiv uden at påvirke Apoptose eller tumorvækst i en musemodel for pancreas Neuroendokrine Kræft. PLoS ONE 4 (2): e4455. doi: 10,1371 /journal.pone.0004455

Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: August 23, 2008; Accepteret: December 26, 2008; Publiceret: 11 feb 2009

Copyright: © 2009 Hager et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af AP Giannini Foundation for Medicinsk Forskning (DBU), Statens Institut for Diabetes og Digestive og nyresygdomme (NIDDK) (LH), og tilskud fra National Cancer Institute (DH, R01CA45234). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

for alle kræft at stige i masse og maligne potentiale, skal celleproliferation overgå celledød [1]. Til dette formål humane tumorer aktivere eller deaktivere forskellige veje for at undslippe eller minimere apoptose. Behovet for at nedmodulere apoptose også skyldes, at aktiverende mutationer i onkogener samt overekspression af vildtype onkogen alleler, fremkalder ikke blot hyperproliferation, men også celledød [2] – [4]. En betydelig mængde beviser understøtter påstanden om, at uden en vis grad af undertrykkelse af apoptose, kan onkogen-udtrykkende celler ikke fremskridt forbi relativt små, præmaligne proliferative læsioner [1], [5].

Den første direkte genetisk forbindelse mellem modulering af apoptose og tumorvækst kom fra den opdagelse, at ekspression af

Bcl-2

genet blev dysreguleret via kromosomal translokation i follikulært lymfom, og at dette gen er homolog med

C. elegans

regulator af celledød, ced-9 [6] – [9]. Bd-2 viste sig at være prototypen på en familie af strukturelt beslægtede apoptotiske regulatorer, opdelt i to undergrupper, der alternativt undertrykke eller inducerer apoptose [10]. Den anti-apoptotiske arm af Bcl-2-familien omfatter Bcl-2, Bcl-x (multiple anti-apoptotiske splejsningsvarianter), Bcl-w, A1, Mcl-1 og Boo [10] – [12]. Aktivering af apoptose som respons på onkogen-induceret hyperproliferation er blevet beskrevet i en række af gensplejsede musemodeller for cancer, og især i to modeller af pancreas neuroendokrine øcelle kræft. I en sådan model, RIP1-tag2 [13], [14], er SV40 T-antigenerne udtrykkes konstitutivt i p-cellerne i de endokrine pancreas under kontrol af rotte insulin-promotor, hvilket resulterer i en flertrins pathway til invasive carcinom, som er stokastisk natur og tidsligt langvarig. Ved 2-3 ugers alderen, den normale postnatale udviklingsmæssige proliferation af ø-celler tilspidses, og i voksne mus der er en relativ langsom omsætning af p-celler, med en lav proliferationshastighed opvejet af en lav apoptotisk hastighed, hvilket resulterer i en meget beskeden stigning i β-cellemasse med alderen. I modsætning hertil p-cellerne af RIP1-tag2 øer begynder hyperprolifererende ved 3-4 ugers alderen sammen med en ledsagende aktivering af apoptose. En tidlig undersøgelse rapporterede, at apoptose toppede ved den angiogene holm fase men var betydeligt ned-moduleret i tumorer, hvilket antyder at resistens over for celledød blev et kritisk trin i tumorudvikling fra angiogene ø forstadier [15]. En nyere undersøgelse af denne model har vist, at ned-modulation er ikke altid tilfældet, idet sene tumorer (herunder invasive karcinomer) i de nuværende tilbagekrydsning generationer har typisk apoptotiske satser svarende til angiogene holme, hvilket tyder på en mere subtil fænomener på spil i ekspansiv tumorvækst (ref [16]). To veldefinerede suppressorer af apoptose er blevet identificeret i denne model: funktionel inaktivering af p53 via store T-antigen-ekspression, og opregulering af overlevelsesfaktor IGF-II [17], [18]. Genetiske undersøgelser med kors til et IGF-II null allel anført, at det i høj grad fungerer som en overlevelse faktor i denne model, idet fravær af IGF-II fremkaldte meget forøget (5 ×) apoptotiske satser i hyperproliferative læsioner, og de små tumorer opstår havde en mindre malign cellulær fænotype; navnlig, forblev proliferationshastigheden uændret [18], [19].

En påvisning af, at anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien kan modulere celledød i denne model kom fra eksperimentel overekspression af

Bcl-x

L

i p-celler via rotteinsulin promotoren (

RIP-Bd-x

L

), hvilket resulterede i undertrykt apoptose og en stigning i tumorbyrde , sammen med en generel “acceleration” af tumor vej [15]. For nylig samme RIP-

Bcl-x

L

transgen er også blevet vist at undertrykke apoptose i en anden musemodel af ø-celle karcinom, hvori et myc-fusionsprotein, myc

TAM, blev udtrykt i p-celler under styring af rotte insulin promotoren [20]. Myc

TAM er kun aktiv i overværelse af tamoxifen, der giver mulighed for inducerbart og reversibel genekspression. Postnatal behandling af mus med tamoxifen resulterer i en hurtig induktion af myc

TAM ekspression samtidig med hyper-proliferation af p-cellerne. Interessant nok blev denne hyper-spredning ledsaget af massiv β-celle apoptose, der resulterede i holm involution indenfor 6-10 dage. Over-ekspression af

Bcl-x

L

via samme

RIP-Bd-x

L

transgen undertrykt denne apoptose, hvilket resulterer i en stigning i β-cellemasse og en hurtig progression til invasive carcinomer. Således i to forskellige transgene musemodeller for ø-celle karcinom, fremkaldt af to funktionelt forskellige oncoproteiner, overekspression af

Bcl-x

L

undertrykker apoptose, hvilket resulterer i accelereret tumordannelse. Resultaterne indikerer, at den observeret i disse tumortyper apoptose er, i det mindste delvist, medieres af mitokondrie død pathway. I denne rapport, vi udforske den rolle, endogene Bcl-x spiller i modulering apoptose og tumorvækst i RIP1-TAG2 model via målrettet sletning af genet i onkogen-udtrykkende p-celler ved hjælp af Cre /loxP-systemet.

Resultater

Bcl-x-ekspression i RIP1-tAG2 ø-celle carcinogenese

In situ hybridisering med en pan-isoform sonde til pancreas vævssnit fra RIP1-tAG2 mus tidligere foreslået, at

Bcl-x

mRNA var beskedent opreguleret i tumorer i forhold prækursorer læsioner [15]. For at bekræfte, at Bcl-x mærkbart udtrykkes på proteinniveauet under islet tumorigenese, gik vi videre med en vurdering af niveauerne af Bcl-x-protein ved Western blotting under anvendelse af lysater fra normale øer og fra adskilte faser pancreasø tumorigenese i RIP1-tag2 mus. Som angivet i figur 1, et bånd, der migrerer ved 27 kDa i overensstemmelse med Bcl-x

L isoform blev påvist ved lignende niveauer i normale øer og i de tre neoplastiske stadier. Derudover en lidt hurtigere vandrende bånd, hvilket potentielt svarer til den alternative splejsningsvariant Bcl-x

β [21], [22], blev påvist i den angiogene holm og tumor stadium, men ikke normale øer eller hyperplastisk ø-fase. Således de overordnede niveauer af Bel-XL protein beskedent forhøjet i de angiogene ø og tumor etaper.

Protein ekstrakter fra puljer af normale, ikke-transgene holme (N), hyperplastiske øer (H), angiogene holme ( A), og tumorer (T) fra RIP1-tag2-mus blev immunblottet med antistoffer mod Bcl-x og β-actin som ladningskontrol. Den 27 kDa-båndet repræsenterer Bcl-x

L; den hurtigere vandrende bånd til stede i angiogene ø og tumorekstrakter kan repræsentere den alternative splejsningsvariant, Bcl-x

β.

Generering af en β-celle specifikt gen knockout af bcl-x

for at vurdere den funktionelle rolle af Bcl-x i RIP1-tag2 tumorigenese, vi inaktiverede

Bcl-x

genet i p-celler i endokrine pancreas ved anvendelse af Cre /loxP system for homolog rekombination. RIP-Cre linje ansat udtrykker Cre i ca. 82% af p-cellerne, mægle effektiv rekombination ved loxP sites [23], [24]. Den “floxet” allel af

Bcl-x

,

Bcl-x

fl /fl

, hvori exon 1 og 2 er flankeret af loxP-sites, er blevet vist at være en effektiv substrat for Cre-rekombinase, der producerer en null allel efter rekombination i andre væv [23] – [25]. Vi først genererede

RIP-Cre

,

Bcl-x

fl /fl

mus (og forskellige kontrol genotyper) mangler onkogen, og alderen dem ud til 12 wks at vurdere mulige virkninger på β-celle udvikling og homeostase.

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

Bcl-x

fl /fl

mus blev født i forventede Mendelsk nøgletal, og nåede voksenalderen uden tidlig dødelighed eller åbenlys patologi. Vi undersøgte H

Bcl-x

fl /fl

mus ville være, at p-cellerne med udgår

Bcl-x

døde, og dermed de normale øer observerede stammede fra ikke-rekombineret, ” Escaper “p-celler, som ikke udtrykker transgenet-afledte Cre. For at vurdere denne mulighed, isolerede vi genomisk DNA fra puljer af holme isoleret fra

RIP-Cre

;

bcl-x

fl /fl

mus og udført PCR-analyse med primere, der ville forstærke og adskiller et rekombineret allel fra en ikke-rekombineret allel (figur 2B). Effektiv rekombination blev påvist i

RIP-Cre

;

bcl-x

fl /fl

holme. Som forventet blev rekombineret allel ikke påvist i kontrol mangler RIP-Cre transgen (eller i milt fra

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

mus, hvor Cre ikke udtrykkes)

(A) H

RIP-Cre; Bd-x

+ /+

;

og RIP-Cre; Bd-x

fl /FLL

. Flere sektioner af hvert af dyrene er vist i mikrofotografier blev undersøgt. (B) Genomisk DNA fra puljer af pancreasøer blev isoleret fra mus af forskellige genotyper. PCR blev udført under anvendelse af en primer, der binder opstrøms for 5 ‘loxP-stedet og et andet primer, der binder 3’ til den nedstrøms loxP site. PCR-fragmentet af den ikke-rekombinerede allel og den rekombinerede allel er 2,9 kb og 150 bp. Pancreasøer blev isoleret (materialer og metoder) fra 4-6 dyr i hver genotype og samles.

Vurdering af funktionelle rolle af Bel-XL i RIP1-TAG2 tumorigenese

For at undersøge rolle Bcl-x ved modulering af apoptose i RIP1-tag2 tumorigenese, genereret vi sammensatte mus, der var homozygote for

Bcl-x

fl /fl

allel og enten transporteres både RIP1-tag2 og RIP-Cre transgener, eller bare den RIP1-tag2 transgen. Yderligere kontroller medfølger mus, der gennemførte den RIP1-tag2 transgen, og enten

Bcl-x

+ /+ eller bcl-x

fl /+

alleler. Vi alderen ud kohorter af disse mus til 13 uger gamle, og kvantificeres både tumorbelastning (volumen) og tumor nummer. Den målrettede knockout af

Bcl-x

resulterede ikke i en signifikant forskel i tumorbyrde (figur 3A). Dette væsentlige “vildtype” tumorbelastning i knockout dyr blev ledsaget af en formindskelse i tumorantal ca. 40%; dog har denne virkning ikke statistisk signifikans (figur 3B). At afgøre, om denne mangel på åbenlys fænotypisk virkning på tumorvækst også blev afspejlet i den apoptotiske kurs, vi udførte TUNEL assays af formalin-fikserede paraffinsnit fra

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

RIP1-tag2

;

bcl-x

fl /fl

dyr. Som foreslået af tumorbyrden og tumorantal data, var der ingen signifikant forskel i den apoptotiske sats i tumorer fra “knockout” versus kontrol dyr (figur 3C).

(A og B) Sammenligning af tumorvolumen og antal. Makroskopisk synlige tumorer fra 13 uger gamle dyr blev udskåret, fastgøres eksokrine væv fjernet og målt med lineal. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af formlen V = (x * y

2) × 0,52. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM; + /+ Og FL /+: n = 7; FL /FL: n = 24; RIP-Cre; Fl /Fl: n = 22. Statistisk signifikans blev bestemt ved ikke-parametrisk T-test (Mann-Whitney). P = 0,98 (D) Apoptotisk sats. Apoptotiske celler blev kvantificeret via TUNEL mærkning af pancreas sektioner fra 13 uger gamle dyr. Data repræsenterer middelværdi ± SEM (n = 5 mus /gruppe). Den procent TUNEL

+ celler blev beregnet ud fra sektioner af 16-17 individuelle tumorer /gruppe. Statistisk signifikans bestemmes ved ikke-parametrisk T-test (Mann-Whitney). . P = 0,98

For at kontrollere, at

Bcl-x

blev effektivt slettet i tumorerne opstår i

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

mus, vi overvåget rekombination ved hjælp af en PCR-baseret analyse på genomisk DNA fra 12 tilfældigt valgte tumorer (interval 5,2 mm

3-229 mm

3) : 10/12 tumorer udviste fuldstændig rekombination, 1/12 udviste delvis rekombination, og 1/12 havde nogen rekombination (figur 4A og data ikke vist). Da Cre transgen ikke er udtrykt effektivt i 10-20% af p-cellerne, og bemærke, at forholdet af tumorer med rekombineret vs. ikke-rekombinerede

Bcl-XL Salg alleler var også -10 %, konkluderer vi, at der ikke var nogen selektiv vækstfordel af

Bcl-x

+ /+

celler, der manifesterede sig i den klonale udvækst af p-celler, der huser ikke-rekombineret alleler, i modsætning til situationen med andre gener, der har kritiske roller i RIP1-tag2 tumorigenese (f.eks VEGF [26]). Navnlig nogle af de største tumorer udviste fuldstændig rekombination, igen støtter opfattelsen af, at tabet af Bcl-x-funktionen ikke forringer tumorvækst. Som en anden målestok for rekombination effektivitet, vi vurderede

Bcl-x

udtryk ved kvantitativ RT-PCR (Taqman) på første streng cDNA afledt fra 10 uafhængige

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

tumorer og 10

RIP1-tag2

;

Bcl-x

fl /fl

kontroller (figur 4B og S1). Der var en signifikant reduktion i

Bcl-x

udtryk i 9/10 af

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

tumorer i forhold til

RIP1-tag2

;

Bcl-x

fl /fl

kontroller, hvilket indikerer, at

Bcl-x

blev slettet i de fleste p-celler i disse tumorer. Men en tumor udtrykte vildtype-niveauer af

Bcl-x

, hvilket antyder, at det er opstået en β-celle, der ikke udtrykker Cre, og således rummede et ikke-rekombineret allel. Denne forudsigelse blev bekræftet ved at screene alle 10 i

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

tumorer for Cre udtryk, og som forudsagt denne ekstraordinære tumor ikke udtrykke Cre, i modsætning til de 9 tumorer, som udviste meget reducerede

Bcl-x

ekspression (figur 4C). Eksklusive denne Cre-negative, Bcl-x-positive “Escaper” tumor fra analyse, middelværdien

Bcl-x

udtryk i “KO” tumorer var 9,5 gange lavere end for kontroller. Således udgår

Bcl-x

i β-celle-rum af disse tumorer medført en reduktion -90% af

Bcl-x

ekspression, hvilket bekræfter, at overvægten af ​​

Bd-XL

udtryk i RIP1-tAG2 tumorer er β-celle oprindelse, og at Cre effektivt var slette

Bcl-x

uden tilsyneladende fænotypisk konsekvens. Det resterende

Bcl-x

ekspression sandsynligvis stammer fra det stromale komponent af læsionerne (hovedsagelig vaskulære og immune celletyper), selv om vi ikke formelt kan udelukke, at disse tumorer er oligo-klonal, og at nogle af den resterende

Bcl-x

mRNA afledt fra relativt sjældne p-celler, der huser ikke-rekombinerede

Bcl-x

alleler. For at afgøre, om den betydelige reduktion af

Bcl-x

mRNA observeret i bcl-x “KO” tumorer medført en tilsvarende reduktion i Bd-x protein niveauer, vi foretaget en Western blot analyse på lysater fra 5 uafhængige

RIP1-tag2; RIP-Cre

;

bcl-x

fl /fl

tumorer. Overensstemmelse med PCR-baseret analyse af rekombination og kvantitativ RT-PCR-analyse af

Bcl-x

mRNA niveauer, Bcl-x-proteinniveauer blev signifikant reduceret sammenlignet med vildtype (wt) tumorer (figur 4D) , hvilket indikerer Cre-medieret deletion af

Bcl-x

locus i langt størstedelen af ​​beta-celler

RIP1-tag2; RIP-Cre

;

bcl-x

fl /fl

tumorer. Desuden dette resultat bekræfter, at de immunoreaktive bånd detekteret i normale holme og RIP1-TAG2 læsioner (figur 1) var i virkeligheden stammer fra

Bcl-x

. Sammen støtter dataene den konklusion, at Bcl-x har ikke en central rolle i modulering tumor apoptose i denne vej, og at dens funktion er enten ikke-essentiel, redundant, og /eller kan let opvejes af andre gener, såsom andre antiapoptotiske medlemmer af Bcl-2 familie

(A) Effektiv rekombination af

Bcl-x

i

RIP1-tAG2

.;

RIP-Cre

;

bcl-x

fl /fl

tumorer. Genomisk DNA blev isoleret fra individuelle tumorer fra

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

RIP1-tag2

;

Bcl-x

fl /f

l

mus. PCR blev udført under anvendelse af en primer, der binder opstrøms for 5 ‘loxP-stedet og et andet primer, der binder 3’ til den nedstrøms loxP site. PCR-fragmentet af den ikke-rekombinerede allel og den rekombinerede allel er 2,9 kb og 150 bp. (B)

Bcl-x

udtryk er reduceret betydeligt i

Bclx

-KO tumorer. Kvantitativ RT-PCR (Taqman) blev udført på 1

st cDNA syntetiseret fra RNA isoleret fra individuelle tumorer fra

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

RIP1-tag2

;

Bcl-x

fl /fl

. En spanning probe, som har registreret alle større anti-apoptotiske splejsningsvarianter blev anvendt. Genekspression blev normaliseret til og afbildet som en funktion af GAPDH-ekspression. (D) Den RIP-Cre transgen udtrykkes ikke i

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

tumorer, der bevarer

Bcl-x

udtryk. Cre-mRNA-ekspression blev overvåget ved RT-PCR på 1

st cDNA syntetiseret fra RNA isoleret fra individuelle tumorer fra

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

RIP1-tag2

;

bcl-x

fl /fl

mus. Efter 27 cykler PCR blev cDNA fraktioneret på agarosegeler og visualiseret ved ethidiumbromidfarvning. PCR-produktet er 520 bp. * Ikke-rekombineret, Cre-negativ tumor. (D) Bcl-x-proteinniveauer er signifikant reduceret i

Bcl-x

-KO tumorer, som afsløret ved Western blotting som i figur 1. β-actin anvendes som lastning kontrol.

Expression profilering andre Bcl-2 familiemedlemmer i ø tumorigenese

Dernæst søgte vi at afgøre, om de 5 andre kendte anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien kan udtrykkes under RIP1-tag2 tumorigenese , derved potentielt kompensere for fraværet af Bcl-x. Vi kvantificeret

Bcl-2

,

Bcl-w

,

A1

,

Mcl-1

og

Boo

mRNA-niveauer ved hjælp af kvantitativ RT-PCR-analyse (Taqman) den 1.

st cDNA fra normale øer (isoleret fra ikke-transgene mus), hyperplastiske holme, angiogene holme, og tumorer fra RIP1-tAG2 mus. Som vist i figur 5 og S2, fire af generne blev udtrykt; den femte,

Boo

, blev ikke påvist i nogle af prøverne og var meget variabel i replikat analyser, i overensstemmelse med dens udtryk bliver stort set begrænset til de mandlige og kvindelige kønsorganer [27]. Blandt de fire udtrykte medlemmer, kun

Bcl-w

blev udtrykt på niveauer sammenlignelige med

Bcl-x

. Ekspressionsniveauer er præsenteret i forhold til kontrollen gen, GAPDH, som udviste den mindste variabel ekspression sammenlignet med L19 og Gus mellem normale øer og de forskellige neoplastiske ø læsioner (Figur S3). For at bestemme om en eller flere af de anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer var transcriptionaly opreguleret i fravær af Bcl-x og derfor potentielt funktionelt kompensere for

Bcl-x

“knockout”, udførte vi kvantitativ RT-PCR-analyse på den samme 10 uafhængige

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

10

RIP1-tag2

;

Bcl-x

fl /fl

tumorer, hvori

Bcl-x

ekspression blev kvantificeret (i figur 4B). Der viste sig at være nogen signifikant forskel i mRNA ekspressionsniveauer af disse 5 gener (figur 6 og S4). Derudover Taqman analyse af de samme tumor cDNA’erne for opregulering af medlemmer af IAP klasse af anti-apoptotiske proteiner (CIAP1, CIAP2, Survivin, XIAP, og BRUCE) tilsvarende undladt at afsløre nogen væsentlig transkriptionel opregulering af disse gener i

Bcl-x

-KO tumorer (data ikke vist).

mRNA niveauer af det pro-overlevelse Bcl-2 familiemedlemmer

Bcl-x

,

Bd-2

,

Bcl-w

,

A1

,

Mcl-1

og

Boo

blev vurderet ved hjælp af kvantitativ RT-PCR (Taqman) på første streng cDNA syntetiseret fra total RNA puljer (4-6 dyr pr pool) af normale, ikke-transgene holme og af hyperplastiske holme, angiogene holme og tumorer fra RIP1-tAG2 mus. Genekspression blev normaliseret til og plottet som en procentdel af GAPDH udtryk.

mRNA niveauer af

Bcl-x

,

Bcl-2

,

Bd-w

,

A1

,

Mcl-1

og

Boo

blev vurderet ved hjælp af kvantitativ RT-PCR (Taqman) på første streng cDNA syntetiseret fra total RNA isoleret fra individuelle tumorer fra

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

(n = 9 tumorer fra 5 mus, en tumor fundet at ikke udtrykker Cre og udviser vildtype-niveauer af

Bcl-x

udelukket fra disse data) og

RIP1-tag2

;

Bcl-x

fl /fl

mus (n = 10 tumorer fra 5 individuelle mus). Relativ genekspression blev normaliseret til og præsenteres som en procentdel af GAPDH-ekspression. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM. Statistisk signifikans bestemmes ved ikke-parametrisk T-test (Mann-Whitney). P 0,05 betragtet som signifikant

Rolle Bcl-x i modulerende invasion i RIP1-TAG2 tumorignesis

Ud over at modulere apoptose i tumorceller, der har været rapporter at Bcl-. 2-familiemedlemmer kan desuden fremme carcinogenese via virkninger på tumorcelleinvasion [28] – [31]. I en rapport, blev en dissociation mellem evnen af ​​Bcl-x

L til at modulere apoptose og invasivitet af humane gliomaceller observeret [29]. For nylig opregulering af Bcl-x

L af somatisk genoverførsel under RIP1-tag2 tumorigenese blev rapporteret at øge invasivitet, uden at reducere apoptose [32]. Motiveret af disse resultater, og ved den tydelige manglende effekt af tab af Bcl-x på den samlede RIP1-tag2 tumorcelle apoptose og tumorbelastning, en potentiel rolle for Bcl-x i tumorinvasion blev vurderet. Tumorer fra

RIP1-tag2

;

Bcl-x

fl /fl

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

mus blev scoret som ikke-invasive, indkapslede tumorer (IT) eller invasive karcinomer (IC1-microinvasive; IC2-stærkt invasiv) i henhold til kriterierne i Lopez og Hanahan [ ,,,0],16]. Interessant nok var en signifikant højere andel af indkapslede, ikke-invasive tumorer i

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

mus sammenlignet med

RIP1-tag2

;

Bcl-x

fl /fl

mus (22,8% vs. 4,3%; p 0,02) (figur 7 og S5) Salg

Tumorer i H

Bcl-x

fl /fl

(n = 46 tumorer fra 5 mus) og

RIP1-tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

mus (n = 35 tumorer fra 5 mus), blev scoret som enten ikke-invasiv ø tumorer /adenomer (IT) eller invasive karcinomer (enten IC1 eller IC2) og andelen af ​​tumorer i hver klasse blev beregnet. Fordeling af tumorer typer blev sammenlignet mellem de to grupper ved hjælp af Fishers eksakte test. p = 0,017.

For at dokumentere virkningen af ​​tab af Bd-x på invasionen, kræftceller med vildtype eller udgår

Bcl-x

(βTC-Bcl-x- wt eller βTC-Bcl-x-knockout [KO]) blev frembragt ved at udlede β-tumorcellelinjer ( “βTC”) fra tumorer i

RIP1-tag2

;

bcl-x

fl /fl

mus, og inficere cellerne med adenovirus, der gør eller ikke udtrykker Cre (Ad-Cre-GFP eller Ad-GFP). To uger efter infektion med Ad-Cre-GFP, blev niveauerne af Bcl-x-protein i cellen population reduceret med ca. 75-80% (figur 8A), sandsynligvis afspejler rekombination af

Bcl-x

gen i de fleste celler; serum-udsultede celler +/- Cre blev podet i de øvre kamre i porøse transwell indsætter enten ikke-coatede eller Matrigelcoatede at vurdere effekten af ​​tab af

Bcl-x

udtryk om migration og invasion, hhv. At tage højde for eventuelle forskelle i cellevækst mellem βTC-Bcl-x-wt eller βTC-Bcl-x-KO-celler over tidsforløbet for migration /invasion assays blev lige antal celler udpladet i tre eksemplarer, og totale celleantal bestemt efter en 48-timers inkubation. I løbet af denne periode var der ingen tydelig forskel i cellevækst mellem vildtype og Bcl-x-KO-celler (Figur 8B). Dette var konsistent med den manglende virkning af tabet af Bcl-funktionen på tumorvækst og apoptose in vivo. Desuden var der ingen signifikant forskel i antallet af migrerende eller invaderende celler langs et serum-gradient (figur 8C, D). Imidlertid βTC cellerne var dårligt invasive i disse ex vivo assays, som tidligere rapporteret [32], i modsætning til den almindelige udseende af invasive cancerceller under tumorprogression. Vi spekulerede derfor, om de typiske celle dyrkningsbetingelser ikke ordentligt kan baseres invasionen-inducerende mikromiljø in vivo. Især forskellige rapporter, herunder tidligere undersøgelser i RIP1-tag2 model, har vist en rolle for hypoxi at stimulere tumor invasion [33] – [36]. Vi gentog derfor migration /invasion assays i forhold efterligner hypoxi, ved at inkorporere cobaltchlorid (CoCl

2), som har vist sig at inducere biokemiske reaktioner svarende til dem observeret under lavt iltindhold [37], [38]. I denne tilstand, blev samlet celleoverlevelse reduceret (figur 8B) selvom vildtypecellerne påvist en 2-fold stigning i antallet af migrerende celler (p = 0,006), og en 1,5 gange stigning i invaderende celler (p = 0,07 ) (figur 8C, D) i forhold til det totale antal af overlevende celler. En lignende stigning i indvandringen blev observeret som reaktion på CoCl

2 behandling af βTC-Bcl-x-KO-celler (p = 0,02) (Figur 8C); I modsætning hertil har disse celler ikke udviser forøget invasion under disse pseudo-hypoxiske betingelser, og sammenlignet med de celler, vildtype udviste en beskeden endnu signifikant fald (45%; p = 0,005) i det relative antal af invaderende celler (figur 8D) . Disse data, der er i overensstemmelse med in vivo-analyse, tyder på, at mens ekspression af multiple Bcl-2-familiemedlemmer kan gøre Bcl-x funktionelt overflødige i form af virkninger på tumorcelle apoptose, kan Bcl-x udviser ikke-redundante og særskilte funktioner i forbindelse til tumorindtrængen.

βTC-

Bcl-x

fl /fl

tumorceller blev inficeret med adenovirus, der udtrykker Cre eller kontrol GFP og udpladet in triplo i nærvær eller fravær af cobaltchlorid at vurdere effekten af ​​reduceret Bcl-ekspression på cellemigration og invasion. (A) Western blot af Bel-x og actin protein niveauer i βTC-

Bcl-x

fl /fl celler behandlet +/- Cre på tidspunktet for migration /invasion assays. (B) Cellevækst. 2 × 10

5 βTC-

Bcl-x

fl /fl

celler +/- CRE blev udpladet i nærvær eller fravær af CoCl blev talt

2 og celler efter 48 timer. (C og D) cellemigration og invasion-assays. Celler blev udpladet i kontrol trans-brønd skær (C) eller Matrigelcoatede skær (D). For migrationen assay resultater plottet som det gennemsnitlige antal migrerende celler /10 × felt (8 felter /membran talt), mens det for invasionen assays det totale antal invaderende celler /membran afbildes. CoCl

2 behandling resulterede i et signifikant fald i invasionen af ​​βTC-Bcl-x-KO-celler sammenlignet med vildtypeceller (P = 0,005). De viste resultater repræsenterer middelværdien ± SEM af resultater fra tre uafhængige forsøg udført in triplo og er korrigeret for ændringer i det samlede celleantal (blandt B) sammenlignet med kontrolceller (-Cre, COCI

2).

diskussion

i denne undersøgelse, søgte vi at bestemme, om genetisk deletion af en fremtrædende anti-apoptotisk medlem af Bcl-2-familien, Bcl-x, ville påvirke tumorigenese.