PLoS ONE: B-celler og Ektopiske Follikulære Structures: Nye spillere i anti-tumor Programmering med Prognostisk Power til patienter med metastatisk kolorektal Cancer

Abstrakt

Bemærkelsesværdigt begrænset information til rådighed om de biologiske mekanismer, der bestemmer sygdommen enhed metastatisk colorektal cancer i leveren (CRCLM) med ingen gode kliniske parametre at estimere prognose. I de sidste par år, at forstå forholdet mellem tumor egenskaber og lokal immunrespons har fået stigende opmærksomhed. I betragtning af de mangeartede roller B-celle-drevne reaktioner, vi havde til formål at belyse den immunologiske aftryk af B-lymfocytter ved metastatisk site, sammenhængen med makrofager, og deres prognostiske relevans. Her præsenterer vi roman algoritme gør det muligt at vurdere en sammenhæng mellem den lokale patient-specifikke immunologiske kapacitet og klinisk resultat. Den mikroskopi-baserede imaging platform blev brugt til automatisk scanning af store vævssnit og efterfølgende kvalitative og kvantitative analyser af immun celle undertyper hjælp afstamning markører og enkelt celle genkendelse strategi. Resultaterne indikerer massiv infiltration af CD45-positive leukocytter begrænset til metastatisk grænse. Vi rapporterer for første gang akkumulering af CD20-positive B-lymfocytter ved tumor – liver grænseflade omfatter den større population inden for de store CD45-positive aggregater. Slående, funktionelt aktive, aktiverings-induceret cytidindeaminaseinhibitor (AID) findes -positive ektopiske lymfoide strukturer til at blive samlet i den metastatiske margen. Desuden CD20-baserede datasæt afslørede en stærk prognostisk effekt: patienter med forhøjet CD20 indhold og /eller ektopiske follikler havde signifikant lavere risiko for tilbagefald som afsløret ved univariat analyse (p 0,001 for begge), og i modeller justeret for klinisk-patologiske variabler (p 0,001 og p = 0,01, henholdsvis), og viste forlænget samlet overlevelse. I modsætning hertil CD68 farvning afledte datasæt viser ikke en forening med kliniske resultat. Tilsammen vi udpege størrelsen af ​​B-lymfocytter, herunder dem organiseret i ektopiske hårsække, som en ny prognostisk markør, der er overlegen i forhold til klinisk-patologiske parametre. Resultaterne understreger antitumorale rolle B-celle-drevne mekanisme (r), og dermed indikerer en ny måde at tænke om potentielle strategier for CRCLM patienter behandling

Henvisning:. Meshcheryakova A, Tamandl D, Bajna E, Stift J , Mittlboeck M, Svoboda M, et al. (2014) B-celler og Ektopiske Follikulære Strukturer: Nye spillere i anti-tumor Programmering med Prognostisk Strøm af patienter med metastatisk kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (6): e99008. doi: 10,1371 /journal.pone.0099008

Redaktør: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, Frankrig

Modtaget: Januar 29, 2014 Accepteret: 9 maj 2014; Udgivet: 6 juni 2014

Copyright: © 2014 Meshcheryakova et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den østrigske Science Fund (FWF; https://www.fwf.ac.at/) projekter P22441-B13 og P23228-B19 til DM. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastatisk kolorektal cancer fortsat en terapeutisk udfordring trods af de seneste forbedringer i systemisk behandling herunder udviklingen i cytotoksiske og målrettede midler [1], [2] og tværfaglig ledelse. Bemærkelsesværdigt begrænsede oplysninger om biologiske mekanismer, der bestemmer prognosen for denne sygdom, og kan betragtes som entry point for nye terapeutiske interventioner. Endvidere er der ingen kliniske parametre til rådighed til at estimere overlevelse prognose for patienter efter leverresektion. Men der er beviser at overveje kolorektale cancer levermetastaser (CRCLM) som et immunogent cancer typen siden øget tæthed af T-lymfocytter på den metastatiske margen med anti-tumorale T-celle effektorer-drevne mekanismer blev vist at være prognostisk betydning [3].

det er almindeligt accepteret, at solide tumorer udgør et eksempel på væv, hvor immunceller, enten bopæl eller infiltrere, kan få afvigende aktiveret dermed påvirke det kliniske forløb af sygdom [4], [5]. solide tumorer af forskellig oprindelse, kan dog variere betydeligt i leukocyt sammensætning. Givet bidrag af begge typer af immunceller – cytotoksiske T-lymfocytter (CTL’er) og T-hjælperceller (TH) -celler, regulatoriske T (Treg) -celler, NK-celler, DC’er, monocytter /makrofag-afstamningsceller, og B-celle-undergrupper – den vævs- specifikke mekanismer for hver respektiv tumortype forbinder patient-specifik immunologisk kapacitet og det kliniske resultat kunne overvejes. At beskrive bedst kræft type tilskrevet og patient-orienteret heterogenitet i mængde og /eller typer af infiltrerende immunceller og deres distributionsmønstre inden tumoren samt de deraf følgende trinvise begivenheder til at generere tumor-ledsager immunrespons, en ny terminologi var integreret såsom

immun landskab

,

immun contexture, den Immunoscore, den immunome

, og

kræft-immunitet cyklus

[4], [6] – [8 ]. På den ene side er faste tumorer generelt karakteriseret som immunosuppressive baseret på flere netværksmekanismer herunder aktivering af immunosuppressive veje og signaler, induktion af tolerance over for tumorantigener og rekruttering af immunosuppressive celler, såsom Treg celler, myeloide-afledte suppressorceller og tumor- associerede makrofager (TAM’er) [9] – [11]. På den anden side, undersøgelser, der fokuserer på T-celler foreslået en stærk anti-tumoral potentiale CD8-positive CTL’er hos patienter med forskellige cancertyper [12]. Bemærkelsesværdig, der er stærk positiv sammenhæng mellem tætheden af ​​infiltrater med cytotoksiske og hukommelse T-celle fænotyper og langvarig patient overlevelse med primær og metastatisk kolorektal cancer [3], [13] – [16].

Mindre er kendt om den funktionelle rolle af tumor /stroma infiltrerende B-celler om mekanismerne bag pro- versus anti-tumor programmering af neoplastiske væv. De mange forskellige B-celle-medierede handlinger omfatter antigen-afhængig T-celle priming, maskineriet til generering af immunoglobuliner, sekretion af cytokiner og chemokiner, der medierer (fremmer eller hæmmer) celledifferentiering og inflammation [17] således bidrage til sygdom patogenese gennem antistof-afhængig og -uafhængige mekanismer [18] – [22]

Yderligere relativt nyt aspekt forbinder B cellebiologi og inflammation er baseret på opdagelsen af ​​germinale center (GC) -lignende strukturer uden for sekundære. lymfoide organer. Faktisk har flere undersøgelser vist eksistensen af ​​ektopiske follikulære strukturer (også kaldet tertiære lymfoide strukturer) på steder med kronisk betændelse i forskellige væv, hvilket antyder klasseskift af immunoglobuliner og somatiske hypermutation events at finde sted lokalt under kontrol af aktiverings-induceret cytidindeaminaseinhibitor (AID) ([23] – [26], revideret i [13], [27], [28]). Vigtigt er, bortset fra godartede væv med kroniske inflammatoriske processer, er der rapporteret ektopiske follikulære strukturer i nogle typer af faste tumorer. Tilstedeværelsen af ​​tertiære lymfoide strukturer blev undersøgt i ikke-småcellet kræftpatienter og fundet at være associeret med gunstige kliniske resultater; enten tæthed af modent DC’er [29] eller endvidere blev densiteten af ​​follikulære B celler [30] anvendes til at vurdere den prognostiske virkning af tertiære lymfoide strukturer. Ektopiske follikulære strukturer blev også påvist hos patienter med infiltrerende duktalt carcinom i brystet, hvilket tyder på en

in situ

antigen-drevet B-celle respons på en række af tumor- og bryst-associerede antigener [31]. For primær kolorektal cancer (CRC), i en pilotundersøgelse blev ektopiske follikulært strukturer forudsagt af immun gen-array profilering og bekræftet ved immunfarvning [32].

I betragtning af beviser til støtte for potentielle bidrag tumor infiltrerer B celler til sygdommen patogenese, progression og /eller sygdom opløsning, vi havde til formål at undersøge B-celle-drevet immun kontrol hos en patient kohorte med kolorektale cancer levermetastaser (CRCLM). Men en generel svagt punkt for evaluering tilstedeværelse og prognostiske effekt af hjemmehørende og /eller infiltrerende immunceller på tværs af de store patientprøve med CRCLM (eller anden form for komplekse malignt væv) er kravet om kvantificering algoritmer. Faktisk er behovet for automatiseret, reproducerbar kvantificering af immuncellepopulationer baseret på histologiske evalueringer blevet fremhævet af det videnskabelige samfund inden for translationel forskning regionen og bestemte algoritmer er blevet beskrevet [33] – [35]. Den mest succesfulde eksempel på immun scoring vurdering er baseret på forholdet mellem T-celle-undergrupper (CD3

+, CD8

+, CD45RO

+, og Granzyme B

+) hos patienter med primær kolorektal kræft. Immunoscore blev foreslået som en prognostisk markør til anvendelse i rutinemæssig test [36], [37]; at fremme den verdensomspændende brug af Immunoscore arbejdsgruppen blev indledt blandt 22 internationale ekspertcentre [38].

I den aktuelle undersøgelse, brugte vi en automatiseret TissueFAXS-baserede mikroskopi og en nyetableret algoritme til detektion og kvantificering af immuncellepopulationer tværs en storstilet eksemplar af CRCLM. I betragtning af de mangeartede roller B-celle-drevne reaktioner især på steder med kronisk inflammation, vi havde til formål at belyse den patient-specifikke aftryk af B-lymfocytter ved metastatisk grænse med særlig fokus tilskrives fænomenet ektopisk follikel dannelse, sammenkobling mellem B-celler og infiltrere /hjemmehørende makrofager, og vurdering af deres prognostiske effekt.

Materiale og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i det medicinske universitet i Wien (EK-Nr. 1277/2012). Det informerede samtykke blev givet afkald af den institutionelle gennemgang bord på grund af den tilbagevirkende kraft af undersøgelsen.

Profil af undersøgelsens patienter

Et panel af paraffinindlejrede eksemplarer af patienter med CRCLM blev hentet med tilbagevirkende kraft fra 65 patienter, der blev opereret på Institut for kirurgi, Medical University of Vienna. Første gruppe består af 14 patienter, som havde en leverresektion mellem 2001 og 2007, havde metachronous præsentation af metastatisk sygdom (ingen metastaser, når den primære tumor blev diagnosticeret) og gennemgik resektion uden præoperativ kemoterapi (panel I). Den mediane opfølgningstid for denne gruppe var 50,2 måneder (95% CI: 33.6-66.8 måneder). Denne kohorte af patienter tilladt os at vurdere den immunologiske aftryk i behandlingsnaive prøver. Anden gruppe (panel II, n = 51) omfattede tilfældigt udvalgte patienter, som fik kemoterapi før leverresektion; inklusion dato var mellem 2006 og 2009; medianen opfølgningstid var 32,2 måneder (95% CI: 24.4-40.0 måneder). Som et resultat af tilfældig udvælgelse, panelet II omfattede de patienter, der havde fluoropyrimidin-baseret cytotoksisk kemoterapi i kombination med oxaliplatin (46 patienter) eller med irinotecan (5 patienter). Derudover fik alle patienter bevacizumab som den foretrukne regime på vores institution i løbet af denne periode. Patienterne fik deres sidste behandling med kemoterapi 21 dage før operationen; den sidste bevacizumab behandling blev givet op til 5 uger før operationen. Inden panel II, 19 ud af 51 prøver blev evalueret for CD45, mens alle 51 prøver blev evalueret for B-celle- og makrofag slægter. For patienter med mere end én metastase, udvælgelse af den mest hensigtsmæssige metastase til farvning var på offentliggørelse af patolog; typisk, blev de samme vævsprøve, som blev anvendt til diagnostisk procedure og terapi svar overvågning medtaget til undersøgelsen. Klinisk-patologisk karakteristika af patienter er opsummeret i tabel 1: demografiske data, patologisk iscenesættelse af TNM klassifikationssystem, antal og størrelse af levermetastaser, vitalitet levermetastaser (for panel II), sygdom interval, og data om postoperativ kemoterapi leveres. Både dato for tilbagefald og enten dødsdagen eller dato sidst set blev registreret. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som tidsperioden mellem diagnose og cancerrelateret død (med 22 dokumenterede tilfælde af cancer-relaterede dødsfald); tilbagefald overlevelse (RFS) som tiden mellem diagnosticering af metastase og sygdomsprogression som estimeret ved gentagelse af metastase eller enhver type tumor (med 46 dokumenterede tilfælde af sygdomstilbagefald). Sygdom interval (DFI) blev defineret som tiden mellem diagnose af primære kolorektale kræft og levermetastaser hos patienter med metachronous udvikling af metastatisk sygdom. Vitality af levermetastaser blev vurderet som beskrevet [39].

Immunfarvning på paraffin vævssnit og farvning evaluering

Paraffin-indlejrede 4 um-tykke sektioner undergik rutine farvning med hæmatoxylin og eosin. Dele af CRCLM prøver blev taget for CD45, CD20, AID, IgM, CD138, og CD68. For at detektere CD45, en fælles leukocyt-antigen, kanin klonal antistof, klon E19-G (DB Biotech, Kosice, SR) blev anvendt. CD20 (monoklonalt muse-antistof, klon L26, fra Thermo Scientific, Cheshire WA7 1PR, UK eller kanin klonal antistof, klon E17-P, fra DB Biotech, Kosice, SR) blev anvendt som generel B-cellemarkør. For at detektere AID, klone ZA001 mus IgG1-kappa (Invitrogen, Paisley, UK) blev anvendt. Anti-AID antistoffer blev tidligere vist at være funktionel i immunfarvning af Raji, lymfoblastoide celler afledt fra en Burkitts lymfom, og AID-positive celler i paraffin vævssnit herunder mandler og næsepolypper 24,40,41. For at detektere IgM blev et kanin-polyklonalt antistof, der anvendes (Acris, Herford, Tyskland). For at detektere CD68, monocytter /makrofager afstamning markering, muse-monoklonalt antistof, klon KP1 (Thermo Scientific, Cheshire WA7 1PR, UK) blev anvendt. For immunhistokemi metode blev DAKO EnVision +, Peroxidase-system (DAKO, Glostrup, Danmark) anvendes efter det første antistof. Snit blev modfarvet med hæmatoxylin for nuklear visualisering. En fluorescerende farvning med anti-mus og anti-kanin Ig sekundære antistoffer konjugeret til Alexa farvestoffer 488 og 568 (Invitrogen, Paisley, UK) blev anvendt til CD45-farvning såvel som for dobbelt farvning (CD20 og CD68). Nuklear kontrastfarvning i dette tilfælde blev udført med DAPI (Roche, Mannheim, Tyskland). TissueFAXS (TissueGnostics, Wien, Østrig), en fuldt automatiseret mikroskopi-baserede væv analyse system blev anvendt til erhvervelse af syge eksemplar væv og kvantitativ analyse. Den TissueFAXS teknologi lov til automatisk at scanne vævssnit i fluorescens eller lyse felt modes store, for at kunne visualisere vævsstrukturer efterfulgt af identifikation af de enkelte celler i komplekset native væv miljø og kvantitativ analyse af positivt farvede celler [24], [42], [43]. Således er denne fremgangsmåde forudsat de mikroskopiske billeder af hele metastatiske vævssnit. Hver prøve bestod fra 100 eller flere individuelle synsfelter. Som repræsentativt eksempel blev et areal på 400 mm

2 af vævsprøve typisk erhverves for opfølgning analyser. For erhvervelse 20x /0,5 mål blev anvendt (EF Plan_NeoFluar, Zeiss). Filter sæt var fra Chroma TechnologyCorp (DAPI 350/460 nm; FITC /Cy2 470/525 nm; TxRed /Cy5 620/700 nm). Kvantitativ analyse af infiltrerende immunceller blev udført under anvendelse TissueQuest eller HistoQuest software (TissueGnostics, Wien, Østrig) i immuno og til immunhistokemisk farvning, henholdsvis. Evalueringen af ​​farvede immunceller blev udført uden kendskab til de kliniske parametre for hver patient. For at bestemme den prognostiske relevans blev ektopiske follikler defineret ved (i) karakteristiske kompakt, runde lymfoide samlet morfologi med (ii) en minimal diameter på 20 celler, og (iii) tilstedeværelsen af ​​CD20-positive B-celler. Således har alle lymfoide aggregater, som opfylder disse kriterier uafhængigt af deres aktivering status inkluderet i prognostisk markør. Ektopiske follikulært strukturer blev beregnet på baggrund af en komparativ analyse af CD45 og CD20 farvede mønstre for hver enkelt prøve af tre uafhængige observatører med stærke expertize i mikroskopi. Alle individuelle farvning-afledte variabler på tværs af bestemte områder blev brugt til korrelation med clinicophathological parametre. For nogle farvning-baserede variabler blev få prøver udelukket fra kvantificering analyse baseret på væv kvalitet og /eller baggrund farvning; i de tilfælde, det nøjagtige antal af prøver fremgår af figur legender.

Statistisk analyse

I forbindelse med magt beregning, under antagelse af en tosidet signifikansniveau en hazard ratio på 3,0 kan påvises med en effekt på 90%, hvis der observeres 35 arrangementer i prøven. Kategoriske data blev beskrevet af absolutte og relative frekvenser. Gruppe forskelle blev testet ved chi-squared test eller chi-squared trend test for ordinale variabler. Ved sparsomme data eksakte tests blev anvendt. Kontinuerlig data blev beskrevet med median, minimum og maksimum. Gruppeforskelle blev vurderet ved Wilcoxon rang sum test eller ved t-test i tilfælde af normal fordeling (normalfordeling blev opnået efter logaritmisk transformation). En analyse af varians blev brugt til at sammenligne de tre regioner (grænsekontrol, portal felt, fjernt lever) inden patienterne. En justering Tukey blev foretaget for multiple parvise sammenligninger. Korrelationer koefficienter blev beregnet ved Spearman korrelation for ordinale variabler og Pearsons korrelation for log2 forvandlet kontinuerlige variabler. OS og RFS blev vist ved Kaplan-Meier grafer og gruppe forskelle blev testet under anvendelse log-rank test. For ordenstal variabler anvendtes en log-rank test med en tendens virkning. Derudover blev hazard ratio og tilsvarende konfidensintervaller 95% estimeret ved Cox regressionsmodeller. Farvning-afledte værdier blev log2 transformeret til Cox regressionsmodeller at opnå omtrentlig normalfordeling. Interaktioner mellem de to plader og afsmitning-baserede variabler blev beregnet. I tilfælde af ikke-signifikant interaktion eller hvis begge effekter for de to paneler direkte i samme retning, blev en stratificeret Cox regressionsmodel anvendes, når panelet I og II-data analyseres i kombination. Multivariate Cox regressions modeller blev anvendt til at justere prognostiske virkninger af farvning-baserede variabler til klinisk parameter (er) fundet at være signifikant i univariate Cox regression. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS software-version 20 (IBM Corporation, Armonk, New York, USA); alle p-værdier givet som to-sidet og p ≤ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Algoritme til karakterisering og kvantitativ analyse af hjemmehørende og infiltrerer immuncellepopulationer inden CRCLM vævsprøver

for at analysere og kvantificere tilstedeværelsen af ​​hjemmehørende og infiltrerende immunceller i CRCLM væv vi etableret en algoritme ved hjælp af TissueFAXS systemet. For prøvens sammenligning anvendte vi ensartet strategi ved at gøre delregioner ved tumor – liver grænse (ca. 0,5 × 0,5 mm på hver side af grænsen med en gennemsnitlig størrelse på ca. 30 mm

2) og i leveren vævet omkring portal vene områder (fem repræsentative områder dimensioneret til 0,25 mm

2) og områder i levervæv fjernt til portalen vener navngivet som fjernt lever i opfølgningen beskrivelser (tre repræsentative områder dimensioneret til 0,25 mm

2) ( et repræsentativt billede er vist i figur 1, a). Study design er sammenfattet af rutediagrammet i figur 1, blev B. paraffinindlejrede sektioner først farvet med anti-CD45 antistoffer til påvisning alle klasser af bosiddende og /eller infiltrerende immunceller tværs af patientprøver. Dernæst at angive immuncellepopulationer vi diskriminerede mellem B celle afstamning og monocyt /makrofag afstamning (figur 1, B). Kvantitativ analyse ved anvendelse af TissueQuest /HistoQuest software blev anvendt til at bestemme mængden af ​​CD45-positive, CD20-positive og CD68-positive celler, som findes inden for det ovenfor angivne steder af interesse. Beregningen algoritme er beskrevet i figur S1. For at bestemme den kliniske relevans af patient-specifikke immunrespons på stedet af metastaser blev farvning-afledte datasæt bruges til tilpasning til klinisk-patologiske parametre.

(A) Definition af regioner af interesse inden CRCLM vævsprøver til at sammenfatte kvantificering strategi mellem de prøver. Ved køb af en storstilet prøve ved hjælp af mikroskopi-baserede TissueFAXS systemet blev regioner af interesse defineret på tumor – liver grænse (angivet med et

rød og linje), inden levervæv omkring portalen vene områder (angivet med punkterede pladser i

grøn

) og områder inden for levervæv fjernt til portalen vener (angivet med stiplede firkanter i

blå og). Notatet defineret heri strategi for brug af 0,5 × 0,5 mm område for analyse af tumor – liver grænse blev etableret empirisk baseret på mikroskopisk evaluering af CD45-farvede sektioner viser lymfocyt akkumulering i denne region; dette blev angivet uafhængig til, men matcher kvantificering område defineret af Halama et al [3]. Målestok: 1 mm. (B) Undersøgelsens design. Undersøgelsen design er sammenfattet af flowchart herunder farvning med etablerede markører, immun celle organisation mønster, kvantificering og vurdering af klinisk relevans ved tilpasning til klinisk-patologiske parametre.

Patient-specifikke omfang og fordeling mønster af CD45 -positive celler på det sted, CRCLM

Gross undersøgelse afslørede massiv infiltration af CD45-positive celler begrænset til tumoren – lever grænsen af ​​metastaser. Repræsentative billeder er vist i figur 2, A. Forskellige mønstre for immuncellepopulationer ophobninger blev observeret blandt patienterne og kan sameksistere i samme prøve på tumor – liver kant: enkeltceller, diffunderede celleaggregater, og ektopiske follikler strukturer (figur 2 B ). Mængden af ​​CD45-positve celler på tre områder af interesse udviste stor variabilitet mellem patienter, som bestemt ved kvantitativ analyse: ved grænsen spænder fra 8% til 46% (median 19%), i levervæv ved site af portal vener spænder fra 9% til 56% (median 29%) og inden for den fjerne levervæv fra 4% til 16% (median 9%); Analysen blev udført for panel I og panel II sammen. Vigtigere, CD45-afledte datasæt viste ingen signifikante forskelle mellem panel I og panel II (figur S2)

(A) Massive infiltration af CD45-positive celler begrænset til tumoren -. Liver grænse metastaserne. Repræsentative dele af de metastatiske områder for to CRCLM patienter er vist (rød kanal for CD45, blå kanal for kerner /DAPI). T: tumor; L: leveren. Målestok: 200 um. (B) Forskellige mønstre af CD45-positive celle ophobninger ved metastatisk grænse. Repræsentative billeder af forskellige former for immun celle infiltrater vises: (

en

) enkelte celler; (

b

) store immun celle aggregater; (

c

) fremtrædende ektopisk follikel. Ud over de fusionerede billeder (

a-c

, rød kanal for CD45 og blå kanal for DAPI), billeder af de enkelte kanaler er inkluderet (

d-f

for DAPI

g-i

for CD45); de enkelte kanaler vises i sort /hvid, mens flettede billeder vises i farver. T: tumor; L: leveren. Scale bar: 50 pm. (C) (

en

–

c

) Kaplan-Meier-estimater for patienter stratifikation baseret på CD45-afledte værdier ved grænsen. Kaplan-Meier-kurver for RFS baseret på CD45 værdier for panel I, panel II, og deres kombination er vist at give patienternes lagdeling i lave og høje grupper risiko (højere end median indikerer lav risiko); p-værdi af log-rank test indikeres. Panel I: Medianen er lig med 20,95, under median n = 6 ovenfor median n = 7; Panel II: Medianen er lig med 17,66, under median n = 10, over median n = 9; panel I + II: Medianen er lig med 19,13, under median n = 16, over median n = 16. (

d

) Boxplots af CD45 datasæt for patienter uden tilbagefald (Nej) versus patienter med recidiv (Ja ) til tiden på 17 måneder. Snittet off blev fastsat i henhold til den seneste hændelse (16,3 måneder), hvor der ikke er sket censurering dermed giver klar adskillelse af de censurerede individer (≥32.2 måneder) som visualiseret på (

b

). Medianen CD45 værdi, som blev anvendt til patient stratificering i lave og høje grupper risiko på Kaplan-Meier plot (

b

) er angivet ved punkteret linie; p værdi vises (t-test)

CD45-positive bosiddende og /eller infiltrerende lymfocytter inden CRCLM væv:. prognostiske effekt

For at bestemme den kliniske relevans af patient-specifikke immunologiske aftryk blev CD45-afledte datasæt korreleret med recidiv overlevelse (RFS) og samlet overlevelse (OS). Som anslået af Cox regressionsanalyse (tabel S1), tilstedeværelsen af ​​CD45-positive celler ved tumoren – liver grænse, blev fundet at udvise en stærk positiv prognostisk effekt på RFS i begge patientgrupper paneler (panel I: HR = 0,004, 95% konfidensinterval : 0,001-0,627, p = 0,033; panel II: HR = 0,156, 95% CI: 0,045 til 0,546, p = 0,004) og for panel i og panel II sammen (HR = 0,093, 95% CI: 0,028-0,305 , p 0,001); kombinationen af ​​datasæt var muligt baseret på yderligere testning for interaktioner mellem de to paneler og farvning-baserede variabler (tabel S2). Endvidere blev et højere indhold CD45 ved den metastatiske grænse sig at korrelere med bedre OS, men med svagere prognostiske virkning (tabel S1). Med hensyn til RFS var patienterne opdelt i grupper med en højere procentdel af CD45-positive celler (over medianen), og med en lavere procentdel af CD45-positve celler (under eller lig med medianen). Figur 2, C viser de tilsvarende Kaplan-Meier grafer. Separate analyser af panel I og panel II samt deres kombination viste statistisk signifikante forskelle mellem høj og lav risikogrupper (log-rank test: p 0,001, p = 0,009 og p 0,001 henholdsvis). Da ingen arrangementer er til stede i gruppen lav risiko for panel I (n = 7), den tilsvarende HR af Cox regressionsanalyse går mod uendelig. Derudover, for data panel II, distribution af CD45-baserede værdier kan vises for patienter med og uden tilbagefald på 17 måneder, når ingen censur er opstået endnu (Figur 2, C,

d

). Patienter uden tilbagefald viste signifikant højere CD45-indhold i forhold til dem med en gentagelse (p = 0,019). I modsætning til grænsen, havde tilpasning af lever-afledte datasæt (portåren områder og fjernt lever) ikke afsløre statistisk prognostisk effekt på RFS eller OS (tabel S1).

Sammenfattende vores resultater understrege en stærk virkningen af ​​patientspecifikke lokal immunreaktion finder sted på stedet af metastase af det kliniske resultat af CRCLM patienter. Det giver os motivation til at afgrænse effekten af ​​de enkelte immunceller delmængder der omfatter CD45-positive cellepopulation ved hjælp af en større kohorte af patienter. I overensstemmelse hermed i de opfølgende eksperimenter præciserer B-celle og makrofag afstamninger en forstørret kohorte af patienter inden panel II blev undersøgt (n = 51).

Patient-specifikke omfang og organisering mønster af CD20-positive B-lymfocytter på det sted, CRCLM

Dernæst at karakterisere B-celle afstamning ved CRCLM site, blev vævsprøverne analyseret for CD20-positive celler. Slående, blev den største del af cellerne i de store CD45-positive cellulære aggregater og især i ektopiske follikler sig at være CD20-positive B-celler; interessant nok kun spormængder af CD20-positive B-celler blev påvist i de ikke-organiseret CD45-positive lymfocytpopulationer (figur 3, A). Forskellige organisation mønstre af CD20-positive celler blev observeret inden for de tre områder af interesse. Repræsentative billeder er tilvejebragt i figur 3, B. Ved grænsen, enkelte celler (figur 3, B,

en

) og /eller celle aggregater (figur 3, B,

b

), og /eller ektopiske follikler (figur 3, B,

c

) blev påvist. Notatet blev CD20-positive B-celler fundet at akkumulere omkring tumor øer (Figur 3, B,

b

, indsæt). Store B-celle aggregater blev så godt opdaget omkring portalen vener tæt på grænseområdet, mens enkelte CD20-positive celler på fjernere portal vener blev observeret (figur 3, B,

d

,

e

henholdsvis). Især inden for fjernt levervæv, på tværs af hele prøven kun sparsomt fordelt, enkeltbegivenheder blev fundet (figur 3, B,

f

). I tråd, kvantitative evalueringer af tre regioner afslørede tilstedeværelsen af ​​B-celler mod tumoren – liver grænse i intervallet fra 0,3% til 13% med en medianværdi på 2% og i leveren væv omkring portalen vener i området fra 0,1% til 36% med en medianværdi på 4%; enkelt CD20-positive celler blev påvist inden fjernt levervæv (median på 0,1%); analyse blev udført for panel I og II i kombination. Derudover sammenligning af de to kemoterapi grupper i panel II observerede vi ingen større forskel i fordelingen af ​​farvningsresultaterne-afledte værdier og har ingen angivelse for gruppe forskelle mellem kemoterapier (Tabel S3). Vigtigere, sammenligning af CD20 variabler for panel I og panel II viste ingen signifikante forskelle i tre regioner af interesse (Figur S3).

(A) delpopulation af CD20-positive B-celler ved metastatisk grænse. Repræsentative eksempler på CD45-positive (

en

) ektopisk follicle, (

c

) storcellet aggregat og (

e

) ikke-organiseret celle befolkning og de tilsvarende områder farvet for CD20 er vist (

b

,

d

,

f

henholdsvis). Kvantitativ analyse blev udført ved hjælp TissueQuest og HistoQuest software; procentdelen af ​​positive celler er angivet. Scale bar: 100 um. (B) Forskellige organisation mønstre af CD20-positive celler i de tre regioner af interesse. Repræsentative billeder (i) ved grænsen: (

en

) enkelte celler, (

b

) celle aggregater; Indsæt: mere strøm afbildning af CD20-positive celler i kontakt med colon tumor epitelceller, (

c

) ektopiske follikulære strukturer; (Ii) omkring portalen vener (

d

) nær ved grænsen og (

e

) fjernt til grænsen samt (iii) inden levervæv (

f

) vises. T: tumor; L: leveren. Scale bar: 50 pm.