PLoS ONE: 3D Kulturer af prostatakræft celler dyrket i en roman High-Throughput Culture Platform er mere modstandsdygtige over Kemoterapeutica Sammenlignet med celler dyrket i Monolayer

Abstrakt

På trods monolagskulturer bliver flittigt brugt til udvikling af kræft narkotika og testning, 2D kulturer tendens til at være overfølsomme over for kemoterapi og er relativt fattige forudsige, om et lægemiddel vil give kliniske fordele. Mens generelt mere kompliceret, tre dimensional (3D) dyrkningssystemer ofte bedre rekapitulere sand kræft arkitektur og give et mere præcist lægemiddelrespons. Som et skridt hen imod at gøre 3D-kræft kulturer mere tilgængelig, har vi udviklet en mikrobrønd platform og overfladebehandling protokollen til at aktivere high throughput fremstilling af 3D-kræft aggregater. Heri vi bruger denne roman system til at karakterisere prostatakræft celle mikroaggregater, herunder vækst kinetik og narkotika følsomhed. Vores resultater viser, at prostatacancerceller er levedygtige i dette system, men nogle ikke-kræft prostata cellelinier er ikke. Dette system gør det muligt for os til konsekvent at kontrollere for tilstedeværelsen eller fraværet af en apoptotisk kerne i 3D kræft mikroaggregater. Svarende til tumorvæv, 3D mikroaggregater vise dårlig polaritet. Kritisk respons 3D mikroaggregater til det kemoterapeutiske stof, docetaxel, er mere i overensstemmelse med

in vivo

resultater end de tilsvarende 2D kontroller. Kumulativt, vores resultater viser, at disse prostatakræft mikroaggregater bedre rekapitulere morfologi prostata tumorer i forhold til 2D og kan bruges til high-throughput test af lægemidler

Henvisning:. Chambers KF, Mosaad EMO, Russell PJ, Clements JA , Doran MR (2014) 3D kulturer af prostatacancerceller dyrket i et Novel High-Throughput Culture Platform er mere resistente over for kemoterapi sammenlignet med celler dyrket i monolag. PLoS ONE 9 (11): e111029. doi: 10,1371 /journal.pone.0111029

Redaktør: Wendy J. Huss, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Juni 5, 2014, Accepteret: September 26, 2014; Udgivet: November 7, 2014

Copyright: © 2014 Chambers et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. MRD er finansieret af en Movember New Concept Grant (NCG 3212) tildelt gennem Prostata Cancer Foundation af Australiens Research Program (http: //www. prostate.org.au). JAC er støttet af en National Health og Medical Research Council of Australia Principal Research Fellowship (https://www.nhmrc.gov.au). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tre-dimensionel (3D) cellekultur er motiveret af behovet for at udføre eksperimenter, der bedre rekapitulere fysiologiske mikromiljø. Konventionelle todimensionale (2D) cellekulturer ofte ikke efterligne de cellulære funktioner og signalveje i vævet. Følgelig 2D cellekulturer kan føre til skæve og begrænsede data [1], [2]. Microarray profilering af 2D versus 3D-kulturer har vist, at 50% af generne ændres i ekspression på 3D kultur [3]. Nogle af disse forskelle kan tilskrives forskelle i den mekaniske spænding af matrixen. For eksempel, celler dyrket i 2D på vævsdyrkningsplast erfaring forhøjet trækspænding, en million gange større end for blødt væv [4], og dette er kendt for at ændre cellefysiologi [5]. Kunstigt høje trækspændinger kan dybt påvirke celle morfologi, cytoskelet arrangement, celle-celle adhæsion og migration. 3D-kulturer bedre efterligner naturligt væv mekaniske spændinger og således tilvejebringe en mere repræsentativ patofysiologisk tilstand end ved anvendelse af konventionelle vævskulturplader [6], [7]. Denne relative effekt er tydelig i løbet af

in vitro

kemoterapi test, hvor 2D kulturer er typisk overfølsom over for medicin, mens 3D kultur narkotika følsomhed oftere paralleller svarer

in vivo

scenario [8], [9 ].

på trods af at 3D-kulturer fungerer som mere robuste

in vitro

cancer drug test modeller, de fleste laboratorier stadig afhængige af 2D kulturer som deres primære værktøj. Dette skyldes dels den øgede arbejdskraft og omkostninger forbundet med oprettelse af 3D-modeller, og fordi der ikke er enighed om en fælles standard model, som kunne bruges på tværs af feltet. Flere typer af 3D-dyrkningssystemer, med forskellige fordele og faldgruber, der i øjeblikket ansat. Naturlig ekstracellulær matrix (ECM) geler, såsom type I-collagen og laminin-rige Matrigel kan tilvejebringe de mekaniske og kemiske signaler til vævsmorfogenese imidlertid indeholde en række udefinerede vækstfaktorer og ECM-proteiner, der er forskellige batches ændrer mekaniske egenskaber af gelen. Syntetiske geler bestående af peptid-funktionaliserede syntetiske polymerer er skræddersyede til at efterligne specifikke ECM egenskaber og derfor tilbyder et alternativ [10]. Dog kan scaffold og gel baserede systemer være dyrt at opskalere til store high-throughput undersøgelser og vanskelig at analysere. Teknikker såsom flydende-agar overlay og polyHEMA tilbyde et billigere alternativ, men størrelse og ensartethed aggregaterne kan ikke være strengt reguleret, og dette ville oversætte til forskellige penetration narkotika satser [11], [12]. Vi har tilpasset et højt gennemløb mikrobrønd-system til kultur prostataceller som mikroaggregater en kontrolleret størrelse. Dette system tilbyder en fordel frem for andre 3D dyrkningssystemer i, at dimensionerne af mikroaggregaterne kan reguleres strengt og aggregater af en defineret størrelse er fremstillet af en skalerbar karakter for high-throughput drug test. Heri viser vi, at prostata kræftceller selv samle ind aggregater, der reagerer på medicinsk behandling i overensstemmelse med den forventede

in vivo

følsomhed.

Materialer og metoder

Fabrication og multi-lagdeling af mikrobrøndene

fremstillingen af ​​polydimethylsiloxan (PDMS) mikrobrønde arrays blev udført som tidligere [13] beskrevne. I dette tilfælde anvendte vi blød litografi til dannelse arrays af 360 × 360 × 180 um mikrobrønde eller 800 × 800 × 800 um på PDMS diske, som derefter blev monteret i brøndene på en 48-brønds vævskulturplade. Kort fortalt blev en silica wafer anvendes til at danne en PDMS støbeform, hvorfra en invers polystyren støbeform blev oprettet. PDMS mikrobrønd overflade blev skabt i -plader, som benytter den sidstnævnte skimmel og arket blev udstanset til skiver (figur 1A). Patricer med forskellige størrelser kan anvendes til at skabe skær til enhver størrelse vævskultur plastbeholder. Ved hjælp af denne teknik tusindvis af mikrobrønde kan produceres

massevis

(600 mikroaggregater /cm

2 eller 150 mikroaggregater /cm

2 for de mindre og større mikrobrønde henholdsvis). PDMS overflade blev enten overtrukket med 5% pluronic /phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning eller flerlaget med chitosan (CHI) og hyaluronsyre (HA), som begge forhindre celleadhæsion til PDMS overflade. Som tidligere beskrevet [13] multi-layering begynder med en elektropositiv poly-lysin lag til støtte yderligere lag adhæsion og fem lag CHI og HA sekventielt inkuberet i 15 minutters intervaller. Vi har tidligere vist, at den øvre HA lag blokke celleadhæsion på PDMS mikrobrønde, og at dette fremmer celleaggregering [14]. Efter belægning inserterne blev steriliseret i 70% ethanol og vasket natten over med PBS klar til brug.

(A) En polystyren støbeform [13], blev anvendt til at kaste PDMS ark med en mikro-mønstret overflade. Skiver blev udstanset af PDMS ark til dannelse indsatser til flerbrøndsplader, og disse overflader blev belagt med enten 5% pluronic eller flerlaget med CHI og HA. LNCaP-celler (50.000) blev podet på enten (B) pluronic belagt (3D pluronic) eller (C) i flere lag (3D multi) mikrobrønde og Alamar blue assay blev anvendt til måling metabolisme i 3D versus 2D-celler. Begge belægninger produceret levedygtige aggregater, at øget i stofskiftet over 7 dage ved en sammenlignelig hastighed til celler dyrket i 2D kultur. Tre tekniske replikater blev udført pr tid-point.

Celler og prostata microaggregate kultur

prostatakræft-cellelinier, RWPE-2 [15] og LNCaP [16], og ikke-kræft celler line RWPE-1 [15], blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Celler blev dyrket i RPMI 1640, 5% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco) plus 1% penicillin /streptomycin (P /S) (Gibco) i 5% CO

2 ved 37 ° C. For mellemstore optimering undersøgelser, keratinocyt-SFM, 2% bovin hypofyse (BPE), plus epidermal vækstfaktor (EGF) supplement (Gibco) blev også anvendt. Enten 50.000 eller 100.000 celler blev podet per brønd i 1 ml dyrkningsmedium. Mikroaggregater blev dannet gennem tvunget aggregering; pladerne blev centrifugeret ved 1000 rpm i 5 min for at lette pelletering af cellerne i mikrobrøndene. I tvungen aggregeringsproces cellerne suspenderet i mediet ensartet pelleteret indenfor array’et af mikrobrønde ved bunden af ​​brønden. Medium blev udvekslet på dag 3, 6, 8, 10, og 13. Under mediet udveksling, blev omhu ikke at aspirere mikroaggregaterne. Medium blev tilsat og trækkes fra det samme punkt i brønden under hver central. Plader blev inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2. Fase kontrast billeder blev taget med et Nikon Eclipse-Ti omvendt mikroskop og den centrale diameter af hver microaggregate blev målt ved hjælp af Image-J software (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Et minimum af 50 mikroaggregater blev målt per time-point.

Skæring, immunofluorescens og konfokal billedbehandling

mikroaggregater blev fikseret med 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minutter og enten indlejret i Tissue-Tek optimal skæring temperatur (OLT) forbindelse (VWR International) til sektionering eller immunfarvet direkte. Prøver blev permeabiliseret med 0,5% Triton-X 100 i 20 min og inkuberet med primære antistoffer til E-Cadherin (Invitrogen, AB_86564), β-catenin (Santa-Cruz, AB_626807) (fortyndet 1:200), α6-integrin (Millipore , AB_10834933), laminin-5 (Abcam, AB_2133782), spaltet caspase-3 (Cell Signalling Technology, AB_331440) (fortyndet 1:100) og Ki67 (Abcam, AB_443209) (1:400) natten over ved 4 ° C. Den respektive sekundære antistof konjugeret til Alexa-488 (Invitrogen) blev tilsat i 1 time ved stuetemperatur; 4 ‘, blev 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, Sigma-Aldrich) anvendt til at farve kerner og Rhodamin Phalloidin (Invitrogen) blev anvendt til at farve for F-actin. Mikroaggregaterne blev monteret ved hjælp Prolong guld (Invitrogen) og filmede med et Leica TCS SP5 konfokal mikroskop eller et Nikon Eclipse-Ti omvendt mikroskop.

Levende /dead farvning

Celler blev inkuberet med 2 ug /ml fluoresceindiacetat (FDA) (Sigma-Aldrich) i 15 minutter og 20 ug /ml propidiumiodid (PI) (Sigma-Aldrich) i 2 minutter ved 37 ° C for at farve levende og døde celler hhv. FDA er en celle-gennemtrængelig esterase substrat, der måler både enzymatisk aktivitet og celle-membran integritet. Propidiumiodid binder til DNA, men er kun i stand til at trænge ind i kompromitterede membraner af døde eller døende celler. Celler blev afbildet under anvendelse af et Leica TCS SP5 konfokalt mikroskop og den procentvise areal af døde celler pr microaggregate blev kvantificeret under anvendelse af Image-J software (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Mindst 10 mikroaggregater blev analyseret pr tid-point.

Alamar blå og WST-1 cellelevedygtighedsassays

At etablere cellestofskiftet over 14 dages microaggregate vækst, Alamar blå (Invitrogen) assay blev anvendt i henhold til fabrikantens anvisninger. På dag 1, 3, 7 og 14 blev tilsat et volumen på 3% af Alamar blue per brønd. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 1 time og 100 pi medium overført til en 96-brønds sort plade. Fluorescens (excitation 544 nm, emission 590 nm) blev påvist under anvendelse af en pladelæser (BMG Omega, BMG LABTECH). WST-1 (Roche) blev anvendt til at kvantificere levedygtigheden af ​​RWPE-1 og RWPE-2 celler dyrket i forskellige medietyper. Celler blev dyrket i 3 dage efterfulgt af tilsætning af 10% WST-1 i 1 time før læsning absorbans ved 450 nm på en Bio-Rad Benchmark Plus-pladelæser.

PicoGreen assay.

den PicoGreen assay (Invitrogen) anvendes som et mål af levedygtige celler ved at detektere total dobbeltstrenget DNA, blev udført ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet blev DNA ekstraheret med 0,5 mg /ml proteinase K (Roche) phosphatbufret EDTA (PBE). Prøver blev fortyndet (1:10) i RNaseA opløsning (Invitrogen) og inkuberet med PicoGreen assayreagens før bliver aflæst på en fluorescenspladelæser (BMG Omega, BMG LABTECH; excitation 485 nm emission 520 nm).

Drug behandlinger Salg

LNCaP-celler blev podet i 48-brønds plader med eller uden PDMS skær og dyrket i to dage før behandling med fortyndinger af 0,01-1000 nM docetaxel (Sigma-Aldrich) i 72 timer, som blev sammenlignet med en DMSO-vehikelkontrol. Protokollen for Alamar blue blev tilpasset til at læse i pladen gennem de klare PDMS indsætte ved hjælp af 10% Alamar blue og inkubere i 2 timer. En seriefortynding af celler viste, at fluorescensen var i forhold til celleantal (R-kvadreret værdi på 0,99; data ikke vist). IC50 blev beregnet ved anvendelse CalcuSyn Statistik pakke (Biosoft, UK) som tidligere rapporteret [17].

3D kultur af RWPE-1-celler i Matrigel basalmembranmatrix

RWPE-1-celler blev dyrket i Matrigel (BD Biosciences) i 7 dage for at vurdere polaritet. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt [18], [19]; Kort beskrevet blev RWPE-1-celler podet i enten 1% eller 8% Matrigel i nærvær af keratinocyt-SFM-medium suppleret med 2% BPE (Gibco). Polariteten af ​​celler dyrket i Matrigel plus eller minus mikrobrønd insert blev sammenlignet.

Resultater og Diskussion

Det PDMS mikrobrønd system producerer prostatakræft mikroaggregater ensartet og kontrolleret størrelse

formålet med dette arbejde var at fremstille et høj-throughput PDMS microaggregate for afprøvning af terapeutiske lægemidler for prostatakræft. Oprindeligt søgte vi at karakterisere væksten af ​​prostatacancerceller i mikrobrønd-systemet og sammenligne morfologi, og vækstrate til normale celle modstykker. PDMS er en inaktiv polymer, der i stigende grad anvendes i vævskultur applikationer [20]. Den er egnet, fordi det er billigt og kompatibelt med hurtig fabrikation metode såsom blød litografi [21]. PDMS overflader er blevet støbt og anvendt i kultur applikationer til at styre formen og størrelsen af ​​enkelte celler [22], og specifikt mikrobrønde dannet af PDMS er blevet anvendt til fremstilling af celleaggregater at øge differentiering af humane embryonale stamceller til neuronceller [23 ], [24] og mesenkymale stamceller til osteoblaster eller chondrocytter [13], [24], [25]. Denne undersøgelse er den første, der kultur prostataceller på en PDMS mikrobrønd overflade til kontrolleret aggregatstørrelse. Prostatacancerceller blev dyrket som 3D aggregater af nøje kontrollerede dimensioner under anvendelse af en PDMS mikro-overflade består af 600 mikro-brønde /cm

2, i hvert tilfælde 360 ​​um ved 360 um (figur 1A). Den mikrobrønd overflade blev modificeret med enten 5% pluronic eller flere lag (figur 1B og C). Begge overfladebelægninger blokeret overflade celleadhæsion og fremmet microaggregate formation. Aggregater dannet ud fra LNCaP-celler forblev levedygtige og steg i stofskiftet over 7 dage ved hastigheder sammenlignes med celler dyrket i 2D kultur (figur 1B og C). På dag ét, efter 50.000 celler blev udsået, LNCaP-celler dannet ensartede mikroaggregater af 70 um diameter (figur 2A). Over en 7 dages kultur aggregaterne ensartet voksede til at være 120 um diameter. Dette syntes at være en begrænsende diameter og størrelsen ikke væsentlig forøgelse med yderligere kultur (figur 2A). RWPE-2-celler dannet betydeligt mindre aggregater af 60 um på dag et, og mikroaggregaterne ikke steg i diameter over 14 dage (figur 2A). Diameteren af ​​de RWPE-1-celler blev ikke målt som aggregaterne var ustabile, adskille i løs klynger af celler efter tre dage i kultur. RWPE-1 og RWPE-2-celler blev dyrket i RPMI 5% FBS + PS stedet for deres anbefalede vækstmedium, keratinocyt-SFM, for at optimere microaggregate formation. I sidstnævnte medium de RWPE-1 og RWPE-2-celler dannede dispergerede klynger af celler med en høj andel af døde celler efter 7 dage (Figur S1a). Ændring af vækstmediet havde nogen væsentlige negative virkninger på cellens stofskifte i forhold til det anbefalede medium (figur S1B). Derfor RPMI 1640, 5% FBS + P /S blev anvendt i alle yderligere eksperimenter

(A) Diametrene af LNCaP og RWPE-2 celleaggregater blev målt over 14 dage.; betyder +/- SD, n = 50 fra * p 0,05, blev en parret studerende t-test bruges til at vise signifikante forskelle i diameter på dag 7 og 14. (B) FDA /PI pletten blev brugt til at farve levedygtige celler grøn og døde celler røde på de viste dage og den procentvise areal af døde celler pr microaggregate er blevet kvantificeret at vise, at de ikke-cancer prostataceller (RWPE-1) har større celledød (procent røde pixels) i mikrobrønd skær i forhold til prostata kræftceller (LNCaP og RWPE-2); gennemsnit +/- standardafvigelse, n = 10. En parret studerende t-test blev anvendt til beregning signifikans * p 0,05. (C) De konfokale billeder og fase kontrast (dag 14 Fase) viser, at prostatakræft-cellelinier (RWPE-2 og LNCaP) vokser så kompakte glatte mikroaggregater indtil dag 14. Omvendt har de ikke-cancercellerne (RWPE-1) form spredte løse klynger, som er ikke-levedygtige, og uden nogen definerbar diameter på dag 14. Scale bar er 100 um.

Prostata kræftceller er levedygtige i PDMS mikrobrønd systemet og har en lavere spredning sats i forhold til monolag

levedygtighed prostata mikroaggregater blev vurderet over 14 dage ved at beregne procentdelen af ​​døde celler med hensyn til de levende celler (figur 2B) fra FDA /PI farvede microaggregate konfokale billeder (figur 2C). FDA dye Resultaterne viser, at prostatacancer celletyper, LNCaP og RWPE-2, har en intakt cellemembran over 14 dage. I modsætning hertil ikke-kræft cellelinie, RWPE-1 viser en proportional stigning i lyserede cellemembraner over 14 dage og vise løs organisation (dag 14 fase). Tilsvarende LNCaP mikroaggregater demonstrere en forøgelse af stofskiftet i løbet af 14 dage (figur 3A) og en stigning i DNA-indhold (figur 3B). Imidlertid RWPE-2 mikroaggregater viser et klart fald i metabolisme (figur 3C) og et fald i DNA-indhold (figur 3D) trods intakte cellemembraner i henhold til FDA-farvning (figur 2B). Derfor RWPE-2-celler sandsynligvis vil være i en hvilende celle tilstand, uden celledeling eller celledød. Dette understøttes af den microaggregate størrelsessortering data, som viser, at RWPE-2 mikroaggregater ikke signifikant forøgelse i diameter (figur 2A). For RWPE-2 celle 2D data, der var en svag korrelation mellem assays, trods den klare sammenhæng mellem assays til 3D-data; i 2D metabolismen faldt efter dag 3 (figur 3C), men DNA-indholdet fortsatte med at stige indtil dag 14 (figur 3D). Dette indikerer, at cellerne stadig var i stand til at dele sig og blev derfor ikke næringsstof sultet, men viser dårlig korrelation mellem disse assays, der tidligere er blevet dokumenteret [26]. Ikke desto mindre havde de LNCaP PicoGreen data korrelerer godt med Alamar Blue-metaboliske data (figur 3A og B). Samlet, metabolisme og proliferation af alle celler var lavere i 3D sammenlignet med monolag (figur 3), hvilket stemmer overens med tidligere undersøgelser [9]. 2D overflade tilvejebringer et stort overfladeareal til binding, som er en forudsætning for vellykket celledeling dvs. fokale vedhæftning ankerpunkter er angivet for såvel delende celler, som er nødvendige for proliferation [27]. Men dette giver en falsk repræsentation af division sats i et væv og den nederste 3D replikation sats er mere analogt med sprednings satser i tumorer,.

levedygtighed LNCaP- (A og B) og RWPE-2 (C og D) microaggreagtes versus det samme antal celler dyrket i 2D blev vurderet via Alamar blue (A og C) og PicoGreen assay (B og D). LNCaP mikroaggregater demonstrere en forøgelse af stofskiftet i løbet af 14 dage (A) og en stigning i DNA-indhold (B). Imidlertid RWPE-2 mikroaggregater viser et fald i metabolisme (C) og et fald i DNA-indhold (D). Gennemsnit +/- SD; n = 4. Dataene repræsenterer tre eksperimenter. * P 0,05, blev en parret studerende t-test, der anvendes til at bestemme signifikans mellem 2D og 3D

Prostata cellelinjer dyrkes som mikroaggregater vise dårlig polaritet ligner tumorer

mikroaggregater var. fikseret på dag 7 og immunfarvet for apikal (E-cadherin og β-catenin) og basal (α6-integrin og laminin-5) markører for 3D polaritet (figur 4). Disse markører blev udvalgt efter deres tidligere anvendelse som apikale og basale overflade markører i 3D matrixsystemer [18], [28] – [30]. Ud fra disse data er det klart, at alle mikroaggregater ikke havde et hult lumen og dannede ikke polære strukturer, med kun laminin-5 observeres i en position forventet for en polær aggregat, som var på den basale overflade på den ydre kant af den microaggregate (Figur 4 LM-5). For at kontrollere, at antistofferne arbejdede cellelinjer dyrket i monolag blev også immunofarvede for de samme polaritet markører og filmede med konfokal Z-sektionering (figur S2). Som forventet, laminin 5 og α6-integrin plette den basale overflade af alle celletyper dyrkes i monolag, med nogle cytoplasmatisk farvning (Figur S2B sorte pile). og E-Cad og β-catenin overvejende udtrykkes ved celle til celle vejkryds (Figur S2B hvide pile). Polar 3D mikroaggregater eller sfæroider er defineret af en apikale overflade, der omgiver et hult lumen og en basal overflade, som ville vedhæfte til den omgivende matrix [18]. Den mikrobrønd system er blottet for matrix, bortset fra enhver celle secerneret opløseligt matrixproteiner og der er ingen stillads til fastgørelse og dermed manglen på en klar basal overflade. Det er derfor forudsigeligt, at mikroaggregaterne mangler et hult lumen og dermed en apikale overflade som matrix spænding bidrager til væv organisation [31], men en vis grad af celle organisation og den står. For eksempel, LNCaP, RWPE-1 og 2 celler udtrykker Laminin-5 på den ydre samlede overflade, men udtrykker ikke α6-integrin. Desuden blev der fundet E-cadherin og β-catenin udtrykt mellem celleadhæsioner af LNCaP og RWPE-2 mikroaggregater (figur 4), men der er ingen luminale overflade og dermed er der ingen ekspression af disse markører ved en apikale overflade. Således kan celler at udtrykke disse fænotypiske markører men kræver andre signaler, sandsynligvis fra en ekstracellulær matrix eller omgivende celler, såsom ville være til stede i tumormikromiljøet, til dannelse organiseret væv acini [32]. Selv om der ikke er klare forskelle mellem cancer og ikke-cancerceller linjer, den observerede fænotype er mere betegnende for den de-differentierede cancercelle observeret højkvalitets prostatacancer indikerer, at assayet er stadig er egnet til high throughput drug test af prostatacancer celler. Men dette system ikke er levedygtig til dyrkning af ikke neoplastiske cellelinier grund af fraværet af matrixen. Men med tilsætning af Matrigel til PDMS mikrobrønd systemet, den normale prostata-cellelinien, RWPE-1, dannede aggregater, viste polaritet (fig S3A og S3B). Med tilsætning af 8% Matrigel de RWPE-1 aggregater vises polær organisation med den basale ekspression af α6-integrin (fig S3B), og denne polaritet blev opretholdt med 1% Matrigel (fig S3A). Men mikroaggregaterne dyrkes i PDMS indsætter med Matrigel var større end dem, der dyrkes på indstik alene (Figur S3C) eller i 8% Matrigel alene (Figur S3D). Derfor er tilsætning af Matrigel tilvejebringer en matrix til at inducere α6-integrin polaritet, som blev tabt i RWPE-1-celler dyrket på alene modificerede PDMS. Alpha-6-integrin har vist sig at være vigtigt for acinus dannelse i RWPE-1-celler [33], derfra manglende α6-integrin kan bidrage til dårlig microaggregate formation vises af normale RWPE-1-celler.

mikroaggregater blev fastsat på dag 7 og immunfarvet for apikale og basale polaritet markører (grøn). E-cadherin (E-Cad) og β-catenin blev anvendt som apikale markører og de basale markører var α6-integrin (α6-INT) og laminin 5-(LM5). Kerner blev farvet med DAPI (magenta) og målestokken er 100 pm.

The PDMS mikrobrønd systemet kan bruges til at styre apoptotisk kerne Salg

LNCaP-celler dyrket i mikrobrønde systemet ( 360 × 360 um), der nå en maksimal størrelse på 120 um ikke danner en apoptotisk kerne som identificeret ved kløvet caspase-3 farvning på dag 7 (figur 5A). Imidlertid kan apoptotisk kerne styres for ved at øge størrelsen af ​​mikro-brønd til 800 um og øge seeding celleantal til 2000 celler pr aggregat. Dette skabte aggregater af ~300 um i diameter over 7 dage med en central kerne af spaltet caspase-3-farvning (figur 5B). En apoptotisk kerne sædvanligvis observeres i 3D kulturer af større end 500 til 600 um diameter [34] – [36] dog apoptotiske kerner er observeret selv i LNCaP celleaggregater på 200 um diameter [37]. Variationen i observationer afspejler, at effektiv levering oxygen er en funktion af mange variabler, herunder samlede kultur celleantal, og højden af ​​mediet samt aggregatdiameter [38]. I vores undersøgelser inokuleret vi med større diameter aggregater med 6 fold større celleantal end de mindre aggregater, og på grund af den kubiske forhold i radius volumen ligning (V = 4 /3πr

3) resulterede dette i blot mindre end en fordobling af det samlede diameter (figur 5C). Prolifererende celler har tidligere vist sig at være koncentreret ved periferien af ​​LNCaP aggregater af 200 um dyrkes under anvendelse af agar flydende overlay teknik [36]. I vores undersøgelse anvendte vi Ki67-farvning at afsløre, at prolifererende celler kunne findes jævnt i aggregatet og at disse celler blev ikke koncentreret i et bestemt område (figur 5D), måske på grund af fraværet af basal overflade forsynet med en matrix overflade . Derfor har vi vist, at vi kan styre for apoptotisk kerne under anvendelse af forskellig størrelse mikrobrønde og at spredningen er jævnt fordelt i hele mikroaggregaterne

(A) spaltet caspase-3. (CASP3, grøn), en apoptose markering, var anvendt til at farve sektioner af RWPE-1, RWPE-2 og LNCaP mikroaggregater. (B) På grund af fraværet af spaltede caspase-3 i de små LNCaP aggregater, et stort mikrobrønd (800 um x 800 um x 800 um) blev anvendt til at skabe store LNCaP mikroaggregater med en apoptotisk kerne (CASP3 Lge). (C) Diameteren af ​​LNCaP mikroaggregater (SMG) blev sammenlignet med LNCaP mikroaggregater dyrkes i de store mikrobrønde (LGE). Et minimum af 50 aggregater blev målt per tilstand. (D) Ki67 (grøn) blev også anvendt til at farve prolifererende celler i den store LNCaP aggregat. Kerner blev farvet med DAPI (magenta); skala bar er 100 um.

Kultur af prostata cancer celler som 3D mikroaggregater øger resistens, hvilket skyldes forskelle i spredning

LNCaP celler blev dyrket i 2D eller PDMS mikrobrønde i 2 dage før lægemiddelbehandlingen. Op til 1000 nM af docetaxel blev tilsat og sammenlignet med en DMSO-vehikelkontrol. Docetaxel blev anvendt som en repræsentativ cancer lægemiddel i denne undersøgelse på grund af dets rutinemæssig anvendelse i prostatakræft behandling [39]. Det forhindrer mitosespindelen samling og mitotisk celledeling, hvilket fører til apoptose, ved at nedsætte mængden af ​​frit tubulin nødvendig for mikrotubulusdannelse [39]. Celler dyrket i 3D var mere resistente over for alle doser af docetaxel end dem dyrket i 2D efter 48 timer (figur 6A). Ved 72 timer forskelle blev kun observeret ved de høje drug doser på 10 og 100 nM docetaxel (figur 6B). Med en længere stof inkubationstid øgede IC50 for både 2D og 3D. For eksempel i 2D på 48 timer var IC50 11 nM og dette steg til 51,3 nM over 72 timer. I 3D blev IC50 usædvanligt høje indikerer, at 3D-mikroaggregaterne er meget modstandsdygtige over for docetaxel, den beregnede IC50 på 48 timer var 4,3 × 10

8 og 426 nm ved 72 timer. Med stigende doser af docetaxel cellerne i 3D beholdt deres sammenlægning, men blev mere løst forbundet, men i 2D fritliggende cellerne (figur 6C). Det er blevet rapporteret for flere typer af kræft, 3D kulturer viser mere modstand til kemoterapeutika [9], [40], og at i 3D, LNCaP celler er mere modstandsdygtige over for docetaxel end deres monolag modstykker [9]. Desuden har vi vist, at LNCaP-celler dyrket i 3D har lavere replikation i forhold til deres 2D modstykker (figur 3B) og er således mere modstandsdygtige over for docetaxel, som er rettet mod prolifererende celler [41]. Vi har vist, at disse virkninger er midlertidige og at når 7 dage gamle mikroaggregater returneres til et 2D plastsubstrat som en enkelt cellesuspension de udviser den samme dosis respons profil som celler dyrket i 2D (fig S4). Dette stof indtrængen i 3D-systemer er langsommere sammenlignet med en enkelt monolag af celler, hvilket gør det mere sammenlignelig med faste tumorer [42]. Faktisk drug indtrængen i faste tumorer er typisk 5- til 10-fold lavere end i monolagskulturer [43].

LNCaP-celler (50.000 celler /brønd) blev behandlet med docetaxel i løbet af 48 timer (A) eller 72 timer (B) på dag 2 i vækst, enten i 2D og 3D. Alamar blue blev anvendt til at vurdere cellernes levedygtighed. Gennemsnit +/- SE, n = 4 biologiske replikater * P 0,05; De viste data repræsenterer tre uafhængige forsøg. (C) fasekontrast billeder viser effekten af ​​docetaxel efter 72 timer på morfologi mikroaggregaterne (3D) sammenlignet med celler dyrket i monolag (2D).

Resume

I sammenfattende kan det PDMS systemet, anvendes til at regulere dimensionerne af cancercellelinjer mikroaggregater at replikere forskellige stadier af tumorvækst. Det mikrobrønd system producerer prostatakræft mikroaggregater strengt kontrollerede dimensioner ved hjælp af en PDMS mikro-overflade består af 600 mikro-brønde /cm

2, som hver er 360 um med 360 um. Surface modifikation med enten 5% pluronic eller multi-lagdeling blokke proteinadsorption og cellebinding onto PDMS, og dette fremmer microaggregate formation. LNCaP aggregater var levedygtig og celletallet i aggregaterne steget over tid. Apoptotisk kerne i LNCaP-celler aggregater kan styres ved hjælp af enten små (360 × 360 um) eller store (800 × 800 um) dimension mikrobrønde. Kræft mikroaggregater, dannet ud fra LNCaP og RWPE-2 celler mangler polaritet som ville blive observeret i en tumor, mens de normale RWPE-1-celler danner en basal overflade som identificeret ved α6-integrin ekspression efter tilsætning af Matrigel matrix til mikrobrøndsplader.