PLoS ONE: Den desmosom Armadillo Protein plakoglobin Regulerer prostatakræft Cell Adhesion og motilitet gennem vitronectin-Dependent Src Signaling

Abstrakt

plakoglobin (PG) er et bæltedyr protein, der forbinder med både klassiske og desmosom cadheriner, men er primært koncentreret i modne desmosomer i epithel. Mens reducerede niveauer af PG er blevet rapporteret i lokaliserede og hormon ildfaste prostata tumorer, den funktionelle betydning af disse ændringer er ukendt. Her rapporterer vi, at PG ekspression reduceres i prøver af en prostata tumorvæv array og omvendt korreleret med stigende tumor potentiale i 7 PCA cellelinier. Ektopisk udtrykte PG forbedret intercellulære klæbekraft, og svækkede motilitet og invasion af aggressive cellelinjer, mens tavshed PG i mindre tumorigene celler havde den modsatte effekt. PG også reguleret celle-substrat vedhæftning og motilitet gennem ekstracellulære matrix (ECM) -afhængig hæmning af Src kinase, hvilket tyder på, at PG virkninger ikke var alene skyldes øget intercellulær adhæsion. PG nedregulering resulterede i forhøjede niveauer af ECM protein vitronectin (VN), og udsætter PG-udtrykkende celler til VN induceret Src-aktivitet. Endvidere steg VN-niveauer og Src aktivering korrelerede med formindsket ekspression af PG i patientens væv. Således kan PG inhibere Src ved at holde VN lav. Vores resultater antyder, at tab af intercellulær adhæsion på grund af reduceret PG ekspression kan blive forværret ved aktivering af Src gennem en PG-afhængig mekanisme. Endvidere kunne PG nedregulering under PCa progression bidrage til den kendte VN-afhængige fremme af PCa invasion og metastase, hvilket viser en hidtil ukendt funktionel interaktion mellem desmosomer celle-celle-adhæsion og celle-substrat-adhæsion signalering akser i prostatacancer.

Henvisning: Franzen CA, Todorović V, Desai BV, Mirzoeva S, Yang XJ, Green KJ, et al. (2012) Den desmosom Armadillo Protein plakoglobin Regulerer prostatakræft Cell Adhesion og motilitet gennem vitronectin-Dependent Src Signaling. PLoS ONE 7 (7): e42132. doi: 10,1371 /journal.pone.0042132

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Januar 21, 2012; Accepteret: 3 jul 2012; Udgivet: 30 Jul 2012

Copyright: © Franzen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute (NCI) Prostata SPORE tilskud P50 CA90386, Zell Foundation, støtte fra Rosenberg Seed Grant (til JCP), R01s CA122151, AR041836 og JL Mayberry begavelse (til KJG), National Institutes of Health (NIH) uddannelse tilskud T32 CA070085 (til CAF og VT) og F32 AR055444 (til VT) og en amerikansk Cancer Society (ACS) postdocstipendium PF-10-235-01-CSM (CAF). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den anden hyppigste årsag til kræft dødelighed i USA [1], primært som følge af metastatisk form af sygdommen [2]. De indledende stadier af tumorcellemetastase involverer modulering af celle-celle- og celle-substrat klæbende egenskaber for at lette celle løsrivelse fra vævet af oprindelse og invasion af lokale og distale væv [3]. Nedreguleringen af ​​celle-celle adhæsionsmolekyler er en af ​​de vigtigste trin i processen med lokale og distal prostata tumor invasion. Især har ændringer i ekspression og funktion af cadheriner og deres associerede proteiner vundet opmærksomhed som kritiske regulatorer af tumorprogression [4], [5]. Tab af adherens junction molekyle, P-cadherin, er en tidlig begivenhed i de fleste prostatakræft [6], [7], og den reducerede ekspression af E-cadherin er forbundet med en mere avanceret og aggressiv form for sygdom [8]. Men på trods af deres ekspression i prostatavæv [9] – [11], lidt om den rolle, desmosom cadheriner i initieringen og progressionen af ​​PCa

Ændringer i ekspression af cadherin-associerede proteiner i. bæltedyret familie har også været forbundet med tumorprogression og /eller undertrykkelse [12] – [14]. Et sådant protein er en nær slægtning til β-catenin kaldet plakoglobin (PG, også kendt som γ-catenin), der kan binde til både klassiske og desmosom cadheriner, men findes primært i desmosomer og er kritisk vigtigt i morfogenese af huden og hjerte [10]. PG er blevet rapporteret som en undertrykker af tumorigenese i cervikal [15], blære [16] og brystkræft [17], og kliniske data indikerer, at PG nedreguleres i lokaliserede og mest hormon ildfaste tumorer i patienter med prostatacancer [18] . Interessant nok i nogle hormon ildfaste tumorer, en muteret version af PG er blevet observeret i kerner korrelerer med øget Bcl2 ekspression og forøget celleoverlevelse [18]. Hvorvidt disse observerede ændringer i PG spiller en kausal rolle i PCa progression er ikke fastlagt.

I tidligere arbejde, viste vi, at PG hæmmer keratinocyt motilitet, dels gennem regulering af celle-celle og celle-substrat vedhæftning komponent udtryk [19], [20]. Gennem analyse af PCA patients vævsprøver og en række in vitro gain-og-tab af funktionsundersøgelser, vore data indikerer en model, hvorved PG regulerer både celle-substrat-interaktioner og celle-celle adhæsion ved at dæmpe vitronectin (VN) -afhængig aktivering af Src. Dette er den første rapport, der desmosom molekyler kan regulere prostatacancer interaktioner med ekstracellulære mikromiljø. Desuden er vores data hæve den mulighed, at PG nedregulering under PCa progression kunne bidrage til den kendte VN-afhængige fremme af PCa invasion og metastase til knogle [21].

Materialer og metoder Salg

cellelinier og Kultur

LNCaP-celler er funktionelt differentierede, androgensensitive humane prostata-adenocarcinom celler afledt fra en lymfeknude-metastase [22]. C4-2B celler er en androgen-uafhængig, knogle metastatisk derivat af LNCaP-celler [23]. DU145-celler er moderat differentieret, androgen-inedpendent humane prostata-adenocarcinom celler afledt fra en hjernemetastaser [24]. PC-3-celler er dårligt differentieret, androgen-uafhængige humane prostata-adenocarcinom celler afledt fra en vertebral metastase [25]. PC3-M er en meget metastatisk variant af PC-3-cellelinjen [26]. ARCaP celler er androgen-undertrykte celler, som udtrykker funktionelle androgen receptor [27]. ARCaP

E-celler er en epitelial variant af de parentale ARCaP celler med lav tumorigenicitet og ARCaP

M-celler er en meget metastatisk mesenkymale variant af de parentale ARCaP celler [28]. PC3-M-celler, LNCaP celler, PC-3-celler (alle gaver fra Dr. Raymond C. Bergan, Northwestern University, Chicago, IL), DU145 celler (en gave fra Dr. Lester F. Lau, University of Illinois, Chicago, IL) og C4-2B celler (en gave fra Dr. RS Taichman, University of Michigan, Ann Arbor, MI) blev dyrket i RPMI 1640 medium (Mediatech) indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad , CA), 100 enheder /ml penicillin og 100 pg /ml streptomycin (Mediatech). ARCaP

E og ARCaP

M-celler (Novicure) blev dyrket i MCAP medier (Novicure) indeholdende 5% varmeinaktiveret FBS, 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin (Mediatech).

Reagenser og antistoffer

pSrc (Y416) polyklonale antistoffer og Src monoklonale antistoffer (for western blotting og immunofluorescens studier i cellelinjer) var fra cellesignalering Technologies (Danvers, MA). pSrc polyklonale antistoffer (for TMA-farvning), collagen I polyklonale antistoffer var fra ABCAM (Cambridge, MA). PG kylling polyklonale antistoffer var fra Aves Labs (Eugene, OR). GAPDH monoklonalt antistof var fra Millipore (Temecula, CA). HRP-konjugeret ged anti-mus og gede-anti-kanin sekundære antistoffer var fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). HRP-konjugeret gede-anti-kylling sekundært antistof var fra Kirkegaard mindst 30% af re-belagte celler stadig bevaret GFP udtryk.

siRNA transfektioner

ARCaP

E, LNCaP, og C4-2B celler blev dyrket til 30% sammenflydning, og derefter blev transficeret med enten individuelle eller en pulje af 4 små interfererende ON-TARGETplus RNA (siRNA) for human PG eller med # 2 kontrol ikke-målsekvens (Dharmacon, Lafayette, CO) ved en slutkoncentration på 20 nM ved hjælp Dharmafect 1 transfektionsreagens (Dharmacon) i henhold til producentens anbefalinger. PG siRNA sekvenser anvendt var som følger: 5′-AGACAUACACCUACGACUC-3 ‘; 5’-UGAGUGUGGAUGACGUCAA-3 ‘; 5′-CCACCAACCUGCAGCGACU; 5’-UGUACUCGUCGGUGGAGAA-3 ‘.

Scratch Wound Assay

PC3-M og ARCaP

M-celler blev udpladet i plader med 24 brønde og fik lov til at vedhæfte og spredning. Celler blev transduceret med GFP- eller PG-indeholdende adenovirus. 24 timer efter transduktion, blev en ridse sår fremstillet ved at skrabe den konfluent monolag med en 20 pi pipettespids. For Src inhiberingsundersøgelser blev celler behandlet med medium indeholdende Src inhibitor PP2 eller DMSO opløsningsmiddel kontrol i 24 timer forud for ridse såret gøres. Celler blev afbildet umiddelbart efter sårdannelse og 24 timer efter sårdannelse. 24 timer efter sårdannelse blev celler lyseret med Urea prøvebuffer (USB) og lysater blev anvendt til at teste for ekspression af PG. ARCaP

E og C4-2B celler blev udpladet i plader med 24 brønde og fik lov til at vedhæfte og spredning. Celler blev transficeret med kontrol eller PG siRNA. En ridse sår blev foretaget 96 timer efter transfektion. For Src aktivering undersøgelser blev ARCaP

E-celler transduceret med GFP-adenovirus eller konstitutivt aktiv Src (caSrc) -adenovirus i 24 timer før ridse såret gøres. Celler blev afbildet umiddelbart efter sårdannelse og 18 timer (C4-2B celler) eller 24 timer (ARCaP

E-celler) efter sårdannelse. 24 timer efter sårdannelse blev celler lyseret med USB og lysater blev analyseret ved western blotting for at teste for ekspression af PG. Procentdelen af ​​sårlukning blev bestemt under anvendelse ImageJ software.

Matrigel Invasion Assay

Matrigel invasion assay blev udført som tidligere beskrevet [31] med følgende modifikationer. Den indre brønd af transwell inserts (0,8 um, BD Biosciences) blev overtrukket med 100 pi Matrigel basalmembranmatrix (BD Biosciences) og fik lov til at permeabilisere ved stuetemperatur i 1 time. Den resterende væske blev fjernet, og filtre blev vasket med serum-frit medium og fik lov til at lufttørre. PCA celler blev løsrevet efter cellelinje specifikke protokoller (ARCaP

E, ARCaP

M, C4-2B, DU145 og PC-3-celler blev løsrevet ved hjælp af trypsin, mens LNCaP og PC3-M-celler blev løsrevet hjælp calcium optag) og vasket med serum-frit medium, og 5 × 10

5-celler blev tilsat til den indre invasion kammeret. Cellerne fik lov til at invadere i 24 timer; ikke-invaderende celler blev fjernet fra indre brønde med en vatpind, og invaderende celler adhærente til bunden af ​​membranen blev fikseret og farvet under anvendelse af Diff-Quik-farvning kit (DADE AG). De invaderende celler blev optalt ved opretstående stereomikroskop ved hjælp af en 10x objektiv (Nikon).

Immunoblotting

ARCaP

M, C4-2B, og PC3-M-celler blev udsået i 6- brønds plader og fik lov at fæstne og sprede sig. Celler blev transduceret med GFP-holdige adenovirus eller PG-indeholdende adenovirus, høstet 24 timer senere med USB og underkastet SDS-PAGE. Efter overførsel til en nitrocellulosemembran, blev immunoblotanalyse udført med antistoffer mod PG, pSrc, Src, LN, FN, VN og GAPDH. ARCaP

E og C4-2B celler blev udpladet i plader med 6 brønde og fik lov til at vedhæfte og spredning. Celler blev transficeret med PG siRNA eller # 2 kontrol sekvens siRNA. Efter 96 timer blev cellerne lyseret med USB og underkastet SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran, og derefter underkastet immunoblotanalyse med antistoffer mod PG, VN, FN, Col IV, og GAPDH. Quantitations af band intensiteter blev udført ved hjælp Analyser Gels værktøj af ImageJ software.

mekanisk styrke (Dispase) Indhold

LNCaP, C4-2B, og PC3-M-celler blev udsået i 6- brønds plader og fik lov at vedhæfte og spredning. Kulturer blev transduceret med GFP-holdige adenovirus eller PG-indeholdende adenovirus, og efter 24 timer blev dispase assayet blev udført. For Src inhiberingsundersøgelser blev celler behandlet med medium indeholdende PP2 (10 uM) eller DMSO (kontrol opløsningsmiddel) i 24 timer før udførelse af dispase assay som beskrevet [32]. Kort fortalt blev konfluerende cellekulturer vasket med PBS og inkuberet med 2,4 U /ml dispase i 30 min ved 37 ° C. Frigivne monolag blev underkastet mild mekanisk spænding, og derefter fikseret med formalin. Fragmenter blev talt med en dissekere anvendelsesområde (Leica, MZ6) som beskrevet [32] eller afbildet med en Hamamatsu Orca digitalkamera (model C4742-95) og analyseret ved hjælp MetaVue imaging software (Molecular Devices). Data er udtrykt som gennemsnitligt antal fragmenter ± SEM. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en Students

t

test.

Hængende Drop Aggregation Assay

hængende dråbe blev udført som beskrevet tidligere [32], med følgende modifikationer. Kulturer af PCA-cellelinier blev frigjort som beskrevet ovenfor, centrifugeret og resuspenderet i passende dyrkningsmedium. Dråber (20-pi) af cellesuspensioner blev podet på den indre overflade af en dyrkningsskål låg 35 mm og dyrkes i 20 timer. For at begrænse fordampning blev 2 ml PBS tilsat til bunden af ​​dyrkningsskålene. At sammenligne lignende tætheder af celler suspenderet i drop, 4 × 10

3 celler blev undersøgt. For at undersøge cellernes evne til at danne aggregater efter 24 timer blev dyrkningsskålen låg inverteret, og de hængende dråber blev fladtrykt med et dækglas til billeddannelse. For at undersøge klæbestyrken af ​​de cellulære aggregater, blev parallelle kulturer findelt 10 gange gennem en 20-pi pipettespids (præ-skyllet med 0,1% Triton X-100 /PBS) derefter skyllet 3 gange i PBS forud for billeddannelse. Fem tilfældige områder af fase-kontrast fra hver hængende dråbe blev erhvervet ved hjælp af en Zeiss Axiovert 200 inverteret mikroskop med en Zeiss Axiocam kamera og Zeiss Axiovision software. Det samlede antal celleklynger blev talt fra tredobbelte hængende dråber.

Immunofluorescens

ARCaP

E, ARCaP

M, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3, og PC3-M-celler blev dyrket på dækglas, skyllet i phosphatpufret saltvand (PBS) og fikseret i vandfri methanol i 2 minutter ved -20 ° C. De blev derefter inkuberet med kylling anti-PG (1407) (1:1000) og muse-anti-E-cadherin (HeCd-1) antistoffer (1:100) natten over ved 4 ° C. Primære antistoffer blev visualiseret under anvendelse Alexa Fluor 350-, 488- og 568-konjugeret gede sekundære antistoffer mod mus, kanin og kylling IgG (1:400) hhv. Dækglas blev undersøgt med et Leica opretstående mikroskop model DMR (Deerfield, IL), og billeder blev taget med et Hamamatsu Orca digitalt kamera model C4742-95 (Bridgewater, NJ) og Metamorph 7,6 (Molecular Devices) imaging software.

tissue microarray farvning, Imaging, og fluorescensintensitet Analyse

paraffinindstøbt prostata væv microarray (BC19021), der indeholder 72 kerner fra 20 sager blev købt fra US Biomax (Rockville, MD), og blev behandlet til immunhistokemisk farvning som beskrevet [33]. Antigen genfinding blev udført ved opvarmning af objektglasset til 95 ° C i 0,01 M citratpuffer. Mikroarrayet blev blokeret i 2% normalt gedeserum (Jackson ImmunoResearch Laboratories) og 1% BSA i 60 minutter ved 37 ° C, derefter inkuberet med primære antistoffer mod PG, VN og pSrc natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Mikroarrayet blev inkuberet i AlexaFluor-konjugeret sekundært anti-kylling (633), mus (488) og kanin (568) antistoffer i 60 minutter ved 37 ° C, og dækglasset blev monteret i polyvinylalkohol. PG, VN, og pSrc blev visualiseret ved hjælp af konfokal mikroskopi (Cell Imaging Facility, Northwestern University), inden for 3 dage for behandling. Identiske indstillinger erhvervelse blev brugt til alle billeder for at sikre, at billedet pixel intensitet kan sammenlignes. Billeder blev taget ved 40X forstørrelse, med mindst 4 billeder pr væv kerne taget. Relative fluorescensintensiteter blev bestemt ved anvendelse MetaMorph 7.6 software (Molecular Devices) som beskrevet tidligere [34] med følgende modifikationer. Hver rå, umættet billede blev sat til en 16 bit interval (skala fra 0 til lav- og 255 for høj) og blev inklusivt tærskelværdi. Foranstaltningen Grid funktion blev anvendt til at vælge regioner af tumoren, der skal analyseres. Hvert gitter var 40 × 40 firkanter (30,86 um

2 /firkant). Den gennemsnitlige intensitet tærskelværdisammenlignede områder blev automatisk beregnet af MetaMorph for hver tavle. Grid firkanter med intensitet på 0 blev udelukket fra den gennemsnitlige beregning intensitet for hele nettet. Tumor staging er blevet karakteriseret i US Biomax ifølge TNM skala anvendt af UICC [35]. Primær tumor (T) mellemstationer kriterier for prostatakræft blev anvendt som følger: T1, Klinisk unapparent tumor; T2, Tumor begrænset inden prostata; T3, Tumor strækker sig gennem prostata kapsel; T4, Tumor invaderer andre end sædblærer tilstødende strukturer. Detaljeret beskrivelse af væv, der anvendes til microarray kan findes på selskabets hjemmeside https://www.biomax.us/tissue-arrays/Prostate/BC19021. Desuden blev prostataadenocarcinom sorteres af en ekspert genitourinær patolog (Ximing J. Yang) ved hjælp af Gleason klassificeringssystem, som udelukkende er baseret på de arkitektoniske elementer i tumorcellerne.

statistiske metoder

Cellekultur blev udført med 3 eller flere replikater. Værdier er angivet som middelværdier med fejlsøjler angiver SEM. Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism software-version 5.02 til Windows (San Diego, USA). Alle statistiske tests var 2-sidet. T-test for bar graf sammenligninger blev udført. Lineær regression blev udført for line grafer, der sammenligner ekspression af VN og PG eller pSrc og PG, med R kvadreret værdi repræsenterer godhed pasningen af ​​linjen. p 0,1 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

PG er Mislocalized og dens Udtryk reduceres i Prostata Cancer vævsprøver og cellelinier

Flere rapporter i litteraturen har foreslået. at PG ekspression er reduceret i kliniske PCA prøver sammenlignet med normalt væv [18], [36], [37]. Men om modulation af PG-ekspression er ansvarlig for nogen af ​​de fysiologiske og molekylære begivenheder i PCa tumorigenese er endnu ikke mekanistisk undersøgt. For at løse dette problem og få en bedre forståelse af forholdet mellem PG udtryk og omfanget af primær prostata tumor invasion blev en PCa væv microarray med 72 kerner fra 20 kræftpatienter prostata analyseret for PG udtryk. Vi observerede et fald i den samlede PG-ekspression i alle maligne prøver sammenlignet med normalt væv, såvel som en forsvinden af ​​PG fra celle-celle grænser, hvor det normalt er lokaliseret (fig. 1a). Analyse af PG fluorescensintensiteten viste i gennemsnit -50% mindre PG i primære tumor prøver af alle Gleason kvaliteter og iscenesat T1 gennem T3 sammenlignet med normalt væv (fig. 1B-C). Desuden er der i invasive T4 tumorer der var en yderligere -30% fald i PG (fig. 1C). Disse resultater viste, at PG ekspression blev reduceret og mislocalized i primær prostatacancer væv sammenlignet med normalt prostatavæv. Desuden yderligere tab af PG i invasive (T4) tumorprøver rejser muligheden for, at PG spiller en rolle i at undertrykke PCa invasion.

A-C. En prostatavæv mikroarray blev farvet med et antistof mod PG. A, repræsentant immunofluorescens billede, der viser PG-ekspression i normale prostatavæv (øverst) og T3 (nederst) prostatavæv. Bar repræsenterer 50 um. B. Kvantificering af PG-ekspression i normale prostatavæv sammenlignet med væv fra prostatatumorer med Gleason Grade mindre end eller lig med 6 (6 tumorer), 7 (5), eller større end eller lig med 8 (33). PG-ekspression er høj i normalt væv (sort) og reduceres med -50% i tumorvæv hos alle Gleason kvaliteter. Gleason Grading blev udført ved kirurgisk patolog Ximing Yang. C. Kvantificering af PG-ekspression i normale prostatavæv sammenlignet med stadium T prostata tumorvæv. PG er højt udtrykt i normalt væv (sort) og ekspression mindskes ved ~ 40% i trin T1-T3 prostata tumorvæv og med næsten 70% i T4 prostata tumorvæv. Tumor staging er blevet karakteriseret ifølge TNM skala anvendt af UICC [35]. Primær tumor (T) mellemstationer kriterier for prostatakræft blev anvendt som følger: T1, Klinisk unapparent tumor (3 tumorer); T2, Tumor begrænset inden prostata (33); T3, Tumor strækker sig gennem prostata kapsel (9); T4, Tumor invaderer andre end sædblærer (3) tilstødende strukturer. Desuden var der 8 normale prostata vævsprøver i opstillingen. Grafer repræsenterer gennemsnit +/- SEM. * P 0,05; ** P 0,002; *** P 0,0005; **** P. 0,0001, ved parret t-test

Næste, PG ekspressionsniveauerne og fordeling blev vurderet i et panel af syv PCA cellelinjer varierer i deres tumorigene egenskaber. Generelt cellelinierne beskrevet i litteraturen som havende mere metastatisk potentiale (ARCaP

M, C4-2B, og PC3-M) udviste adskillige gange lavere PG-ekspression end gjorde mindre aggressive linjer (LNCaP og ARCaP

E). Mens moderat differentierede DU145 celler udtrykte mere PG end de andre cellelinier, PG udviste en mere diffus cytoplasmatisk og kernelokalisering stedet for at blive koncentreret ved celle-celle-grænseflader (fig. 2A, B). Tilsvarende de aggressive ARCaP

M og C4-2B linjer udstillet dim og diffus farvning for PG. Endelig den metastatiske variant af PC-3-cellelinjen, PC3-M-celler, udtrykte mindre PG end PC-3-celler (fig. 2A, B). Interessant, selv om de udviste generelt lavere PG niveauer end PC3-M-celler, C42B celler viser stadig nogle nuklear farvning (fig. 2B). Samlet indikerer disse data, en tendens til reduceret PG udtryk og et tab af celle-celle grænsen lokalisering af PG i de aggressive PCA-cellelinjer.

A. Prostatacancercellelinjer blev lyseret og underkastet SDS-PAGE, efterfulgt af immunblotting med antistoffer mod PG og GAPDH. PG-niveauer blev bestemt ved at normalisere til GAPDH niveauer for hver cellelinje hjælp af Image J. immunblot viser at ekspressionen af ​​PG i prostata cancercellelinier omvendt korrelerer med graden af ​​aggressivitet cellelinien. B. Prostatakræft cellelinjer blev udsået på dækglas og tilladt at vedhæfte og spredning. Immunofluorescens blev udført under anvendelse af antistoffer mod PG at demonstrere lokalisering af PG i ARCaP

E, ARCaP

M, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3, og PC3-M-cellelinier. Immunofluorescens viser svagere farvning og tab af celle-celle-grænserne lokalisering af PG i de mere aggressive cellelinier (ARCaP

M, C4-2B, og PC3-M). Repræsentanter for mindst tre uafhængige immunblots vises, med tal, der repræsenterer GAPDH normaliserede PG protein niveauer for blottet vist. Alle PG protein niveauer blev normaliseret til ARCaP

E niveauer i hver blot. Det gennemsnitlige niveau og standardafvigelse af PG protein niveauer i panel A er som følger: ARCaP

E 1.0, ARCaP

M 0,3 +/- 0,2, LNCaP 1.5 +/- 0,5, C4-2B 0,5 +/- 0,2 , DU145 3,4 +/- 1,2, PC-3 1.0 +/- 0.4, PC3-M 0,5 +/- 0,2.

PG Fremmer celle-celle Adhæsion af PCA Celler

i betragtning af den kendsgerning, at et kendetegn for invasiv cancer er evnen af ​​maligne celler til at koordinere en svækkelse af deres celle-celle sammenvoksninger med ændringer i de funktionelle interaktioner med det underliggende substrat [3], Derefter undersøgte vi, hvorvidt eksperimentel manipulation af PG-niveauer (fig. S1 og S2) påvirkede celle-celleadhæsion i PCA-celler. PC3-M-celler, C4-2B celler og LNCaP-celler blev transduceret med PG-udtrykkende adenovirus og en dispase assay blev udført for at måle intercellulær adhæsion styrke (fig. 3A). Celle-celle adhæsion var signifikant forøget i alle celler transduceret med PG-udtrykkende adenovirus (PG OE) sammenlignet med celler transduceret med kontrol (GFP) adenovirus (fig. 3A-B).

A. Repræsentativt billede af en dispase assay PC3-M-celler efter transduktion med PG OE adenovirus eller kontrol GFP adenovirus. B. Quantitations af dispase assays udført i tre eksemplarer; LNCaP, C4-2B eller PC3-M-celler blev udpladet i plader med 6 brønde og fik lov at vedhæfte og spredning. Kulturer blev transduceret med GFP-indeholdende adenovirus (GFP) eller PG-indeholdende adenovirus (PG OE), og efter 24 timer blev dispase assayet blev udført. Overekspression af PG i alle 3 cellelinjer styrker celle-celle adhæsion. C. LNCaP-celler blev udpladet i plader med 6 brønde og fik lov til at vedhæfte og spredning. Cellerne blev derefter transficeret med kontrol siRNA eller PG siRNA pool. Den dispase assayet blev udført 96 timer efter transfektion. Undertrykkelse af PG ekspression resulterer i en svækkelse af celle-celle-adhæsion i LNCaP-celler. D. repræsentant billede af en hængende dråbe assay i DU145 celler efter transfektion med kontrol eller PG siRNA pool. E-F. Kvantificering af hængende dråbe assays udført i tre eksemplarer; C4-2B og PC3-M-celler blev transduceret med GFP- eller PG-indeholdende adenovirus (E), ARCaP E, LNCaP, DU145 og PC3-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller PG siRNA pool (F). Sammenlægning assays blev udført 24 timer (E), eller 96 timer (F) efter behandlingen. Grafer repræsenterer gennemsnit +/- SEM. * P 0,06; ** P 0,005; *** P. 0,0007, ved parret Student t-test

Interessant overekspression af PG i LNCaP celler, som allerede udtrykker betydelige niveauer af PG, førte til en yderligere stigning i intercellulære vedhæftningsstyrke og celle -celle junction farvning af E-cadherin (fig. 3B og fig. S3), hvilket antyder, at tilstedeværelsen af ​​yderligere PG yderligere kan stabilisere adherensovergange i PSA. Derudover er der i ARCaP

M-celler, overekspression af PG resulterede i en opregulering af desmosomer komponent desmoplakin (fig. S3), hvilket indikerer et potentiale stabiliserende virkning af PG på desmosom-junctions i PCa samt. På den anden side, vælte PG-ekspression i LNCaP-celler førte til en betydelig svækkelse af celle-celle adhæsion (fig. 3C). Desuden nedregulering af PG førte til et fald i både E-cadherin og desmosomer cadherin desmoglein 2 i ARCaP

E-celler (fig. S3), fremhæver igen betydningen af ​​PG for stabiliteten i adherens og desmosom vejkryds i PCa . Disse resultater tilsammen understøtter den antagelse, at PG ekspression styrker celle-celleadhæsion i PCA-celler.

For yderligere at bekræfte virkningen af ​​PG på PCa celle-celle adhæsion, udførte vi aggregering (hængende dråbe) assays af celler i suspension (fig. 3D). Dette assay er tidligere blevet anvendt til at kvantificere adhæsionsstyrken af ​​en række epitelceller, herunder A431, MDCK og SCC68 [38] – [40]. For at teste celle-celle adhæsionsstyrke vi udsat aggregater for forskydning kraft. Antallet af fragmenter fremstillet ved forskydning af aggregater blev signifikant reduceret i cellelinierne overudtrykker PG sammenlignet med kontrol (fig. 3E). Desuden banke-down PG ført til en betydelig stigning i antallet af fragmenter, hvilket tyder svækkelsen af ​​celle-celle-adhæsion modstand mod forskydningskraft (fig. 3D, F).

PG Hæmmer motilitet og invasion i PCA cellelinier

Som svækkelse af celle-celle sammenvoksninger er blevet rapporteret at øge cellemotilitet [41], Derefter undersøgte vi, om PG status i celler korrelerede med deres relative motilitet. Til dette formål har vi udført en ridse sår assay at sammenligne motilitet PC3-M, ARCaP

M, ARCaP

E, og C4-2B celler. Assayet viste, at PC3-M og ARCaP

M-celler, var meget motile (med over 50% af såret lukket i 24 timer), hvorimod ArCaP

E og C4-2B celler var mindre motile (ca. 20% lukket i 24 timer) (fig. 4A, B). Vi derefter overudtrykt PG i PC3-M og ARCaP

M-celler, der faldt deres motilitet med 2 gange sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 4A). Samtidig, knockdown af PG i ARCaP

E og C4-2B celler resulterede i en ca. 50% og over 2 gange stigning i deres motilitet, (fig. 4B). Disse resultater kollektivt støtter konceptet, at ektopisk udtrykker PG hæmmer motilitet af PCA celler, mens tavshed PG øger deres motilitet.

A. PC3-M og ARCaP

M blev udpladet i plader med 24 brønde og fik lov til at vedhæfte og spredning. Cellerne blev derefter transduceret med GFP-holdige adenovirus eller PG-indeholdende adenovirus, og efter 24 timer en ridse sår blev foretaget. Billeder blev taget ved 0 og 24 timer og% sårlukning blev beregnet ved at sammenligne størrelsen af ​​såret ved 24 timer til 0-timers tidspunktet for hver tilstand. Overekspression af PG undertrykker motilitet i disse to cellelinier. B. ARCaP

E og C4-2B celler blev udpladet i plader med 24 brønde og fik lov til at vedhæfte og spredning. Cellerne blev derefter transficeret med kontrol siRNA eller PG siRNA pool, og 72 timer efter transfektion blev scratch sår foretaget. Undertrykkelse af PG fører til en stigning i motilitet i ARCaP

E og C4-2B celler. Ridse sår assay udført tre gange i prostata cancercellelinier efter overekspression eller knockdown af PG. C. ARCaP

M, C4-2B, DU145 og PC3-M-celler blev transduceret med GFP-holdige adenovirus eller PG-indeholdende adenovirus, og efter 24 timer udpladet på Matrigel overtrukne transwell membraner til en invasion assay. Overekspression af PG undertrykker invasion i disse fire cellelinjer. D. ARCaPE, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3 og PC3-M-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller PG siRNA pool, og 72 timer efter transfektion, udpladet på Matrigel coatede transwell membraner til en invasion assay. Undertrykkelse af PG fører til en stigning i invasion i disse seks cellelinier. Invasion assays blev udført tre gange.