PLoS ONE: Hæmning af glycogensyntasekinase-3β Modvirker ligand-uafhængig aktivitet af Androgen receptor i kastrationsresistent Prostata Cancer

Abstrakt

For at generere genomiske signaler, androgen receptor (AR) skal være transporteres ind i kernen ved androgene stimuli. Men der er beviser fra

in vitro

eksperimenter, i kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) -celler AR er i stand til at translokere ind i kernen i en ligand-uafhængig måde. Den nylige fund, at hæmning af glykogen-syntase-kinase 3β (GSK-3p) inducerer en hurtig nuklear eksport af AR i androgen-stimuleret prostatacancerceller fik os til at analysere virkningerne af en GSK-3β hæmning i kastrationsresistent LNCaP underlinjer c4-2 og LNCaP-SSR. Begge cellelinier udviser højt niveau af nuklear AR i fravær af androgene stimuli. Eksponering af disse celler til maleimid SB216763, en potent GSK-3β-inhibitor, resulterede i en hurtig nuklear eksport af AR selv under androgen-berøvet betingelser. Desuden blev evne c4-2 og LNCaP-SSR celler til at vokse i fravær af androgener formindsket efter farmakologisk hæmning af GSK-3β

in vitro

. Evne SB216763 at modulere AR signalering og funktion i CRPC

in vivo

blev desuden påvist i en modificeret kyllingechorioallantoinmembranen xenograft assay efter systemisk levering af SB216763. Vores data tyder på, at hæmning af GSK-3β hjælper målrette AR til eksport fra kernen og derved mindske virkningerne af mislocated AR i CRPC celler. Derfor hæmning af GSK-3β kunne være en interessant ny strategi til behandling af CRPC

Henvisning:. Schütz SV, Schrader AJ, Zengerling F, Genze F, Cronauer MV, Schrader M (2011) Hæmning af glykogen synthase kinase-3β Modvirker ligand-uafhængig aktivitet af Androgen receptor i kastrationsresistent prostatakræft. PLoS ONE 6 (9): e25341. doi: 10,1371 /journal.pone.0025341

Redaktør: Vladislav V. Glinsky, University of Missouri-Columbia, USA

Modtaget: 2. marts, 2011; Accepteret: September 1, 2011; Udgivet: 29 September, 2011

Copyright: © 2011 Schütz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var leveres af Action Lions vaincre le Cancer, Luxembourg (til MVC). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Transkriptionel regulering af nukleare receptorer spiller en central rolle i udviklingen og væksten af ​​prostatakræft (PC) celler. Dette er godt eksemplificeret ved den rolle, androgen receptor (AR), en ligand-aktiveret transkriptionsfaktor tilhører steroid receptor superfamilien. I fravær af androgener, er AR fortrinsvis placeret i cytoplasmaet stabiliseret af et multichaperone kompleks [1]. Ved binding af androgener, er AR menes at gennemgå en konformationel ændring, der fører til en homodimerisering med en anden AR protein efter dissociation fra dele af multichaperone-komplekset [2]. Efterfølgende AR transporteres aktivt ind i kernen, hvor det binder til specifikke DNA-sekvenser betegnet androgen responselementer (ER) inden promotor eller enhancer regioner af AR målgener [3] derved den generelle transskription apparat aktiverende [4].

den indledende androgen afhængighed af prostatacancerceller er grunden mest PC reagere på androgen ablation terapi. Desværre, fordelen ved androgen ablation er kun forbigående. Efter en periode på omkring to år PC næsten uvægerligt videre til en tilstand af sygdommen betegnes kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) hvor tumorceller kan vokse og overleve under kastrationsniveauer af cirkulerende androgener. Selv om

in vitro

udvikling af en androgen-uafhængig fænotype er hovedsageligt baseret på tabet af AR i tumorceller, der er tegn fra flere kliniske studier, at AR sjældent er tabt i CRPC celler

i vivo

[5], [6]. Endvidere har disse undersøgelser antyder, at modstand mod konventionel hormonbehandling ikke skyldes et tab af androgen følsomhed, men snarere kan være en konsekvens af en dereguleret AR-signalering akse [7].

For at generere genomiske signaler i hormonafhængige PC celler AR skal transporteres ind i kernen ved androgene stimuli. Der er overbevisende beviser fra

in vitro

eksperimenter, i en undergruppe af CRPC celler, AR erhverver evnen til at undergå ligand-uafhængig shuttling fra cytoplasmaet til cellekernen [8]. Mest interessant, i disse celler AR viser et højt niveau af konstitutiv, androgen-uafhængig aktivitet [9]. Som det nukleare tilstedeværelse af receptoren er en forudsætning for AR signalering, kan regulering af nuklear translokation afsløre nye strategier til behandling af både androgen-afhængige PC samt CRPC.

Forskellige undersøgelser har tilbudt indsigt i det nukleære import af AR. En todelt kernelokaliseringssekvens (NLS) er blevet identificeret i det DNA-bindende domæne (DBD) og hængsel område af AR [10]. Dette NLS udnytter den klassiske importin vej for transport gennem den nukleare pore kompleks [11], [12]. Desuden en mindre defineret NLS er til stede i ligandbindingsdomænet (LBD) i AR [13], [14]. I modsætning til kerneimporten af ​​AR, er de involveret i AR nuklear eksport mekanismer dårligt forstået. Det DNA-bindende domæner (DBD) af forskellige steroid receptorer er blevet foreslået at fungere som nukleare eksportlicenser signaler (NES) for en calreticulin medieret nuklear eksport [15]. Men for AR disse data er blevet diskuteret kontroversielt [16], [17]. For nylig Saporita et al. rapporterede identifikationen af ​​et nyt NES (aminosyrerne 743-817) beliggende i LBD’et af AR [18]. Identifikationen af ​​en NES i LBD af AR er i overensstemmelse med tidligere resultater af vores gruppe studere nukleare eksport af AR i androgen-stimulerede PC celler efter hæmning af glykogen-syntase-kinase 3β (GSK-3β) [19 ].

fund, at hæmning af GSK-3β inducerer en hurtig nuklear eksport af AR i androgen-stimulerede PC celler fik os til at analysere virkningerne af GSK-3β hæmning i kastrationsresistent LNCaP underlinjer c4-2 og LNCaP-SSR [20], [21], begge kendt for at udvise et højt niveau af nuklear AR i fravær af androgene stimuli. Begge

in vitro

samt

in vivo

data præsenteret i denne undersøgelse tyder på, at induktion af nucleocytoplasmic AR eksport kan være en nyttig strategi til at mindske AR signalering, især i avanceret CRPC.

Resultater

AR og GSK-3β er opreguleret i CRPC cellelinjer

for at analysere virkningerne af GSK-3p inhibitorer på AR-aktivitet i CRPC celler vi først bestemmes endogene AR eller GSK-3p niveauer i hele celleekstrakter af PC celler dyrket i fravær af DHT. AR-positive LNCaP underlinjer c4-2 og LNCaP-SSR, der er kendt for at formere sig i fravær af androgener, tjente som modeller for CRPC [20], [21]. Androgen-sensitive LNCaP samt AR-negative PC3-celler tjente som kontroller. Som det ses i figur 1A, AR var påviselig i alle LNCaP linjer dyrket i fravær af AR-stabiliserende androgen DHT. Intracellulær AR niveauer blev øget markant i de AR-positive CRPC celler (c4-2 + 177%, LNCaP-SSR + 126%) (tabel 1). Stigningen af ​​AR-protein i kastrationsresistent LNCaP underlinjer blev modsvaret af en stigning i PSA (c4-2 + 337% og LNCaP-SSR + 110%, henholdsvis), sidstnævnte tyder på, at AR er særlig aktiv i disse celler ( Figur 1A, B; tabel 1). Western blot analyse af intracellulær GSK-3β-protein afslørede væsentligt højere intracellulære GSK-3p-niveauer i c4-2 (+ 361%) og LNCaP-SSR (+ 150%) celler i sammenligning med de parentale LNCaP-celler (figur 1A, tabel 1) .

(A) Intracellulær AR og GSK-3β-protein niveauer i PC-cellelinjer dyrket i fravær af androgener. AR-positive LNCaP, LNCaP-SSR og c4-2 celler såvel som AR-negative PC3-celler blev dyrket i 48 timer under androgen-berøvet betingelser. Efterfølgende blev cellerne lyseret, og cellelysater blev analyseret ved Western blotting for AR og GSK-3β. p-actin bands tjente som lastning kontrol. (B) Intracellulær PSA niveauer i CpRC celler dyrket under androgen-berøvet betingelser. AR-positive LNCaP, LNCaP-SSR og c4-2 celler blev dyrket og behandlet som beskrevet. Relative PSA niveauer blev bestemt i de tilsvarende cellelysater ved Western blotting som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. β-actin bands tjente som lastning kontrol.

Den maleimid SB216763 reducerer GSK-3β-aktiverende phosphorylering på tyrosin 216

Flere undersøgelser rapporteret, at størstedelen af ​​GSK- 3p-molekyler er inaktive i LNCaP-celler som følge af en phosphorylering ved serin 9 (S9) [26], [27]. Men der er eksperimentelle beviser, at GSK-3β-aktivitet er det ikke fuldt inhiberet i LNCaP-celler [28], [29], [30], [31], [32]. Efter DHT behandling, phosphorylering af GSK-3β på tyrosin 216 (GSK-3β

Y216), et GSK-3β-aktiverende phosphorylering site, blev øget i LNCaP og c4-2 celler (Fig. 2). For at inhibere resterende GSK-3β aktivitet i LNCaP og c4-2 celler blev celler behandlet med maleimid SB216763, et GSK-3β-inhibitor nylig vist at inhibere phosphoryleringen af ​​GSK-3β

Y216 [33]. Desuden blev evnen hos SB216763 at inhibere GSK-3β-aktivitet i c4-2 celler verificeret ved ændringer i phosphorylering status β-catenin, et prototypisk nedstrømsmål af GSK-3β (figur S1).

LNCaP celler og c4-2 celler blev podet i T25-flasker og fik lov at adhærere natten over. Derefter blev mediet erstattet af steroid-frit medium, og cellerne blev dyrket i yderligere 24 timer. Efterfølgende SB216763 (slutkoncentration 5 uM) blev tilsat 30 min før DHT (10 nM) behandling. Efter 4 timer blev cellelysater analyseret for GSK-3β

Y216 og GSK-3β

S9 fosforylering, som beskrevet i Materialer og Metoder.

Som forventet, inkubation med SB216763 hæmmede fosforylering af GSK-3β

Y216 i begge cellelinier, er mest udtalt i androgen-uafhængige c4-2 celler (fig. 2). Mest interessant, en SB216763 inducerede formindskelse af GSK-3

Y216 phosphorylering i DHT-behandlede c4-2-celler blev parallelt med en stigning i S9 phosphorylering (fig. 2).

ligandholdigt AR er lokaliseret til kerne i CRPC LNCaP-underlinjer

Nuclear lokalisering af AR er en forudsætning for genomisk signalering. Som det ses i figur 3, de CRPC underlinjer LNCaP-SSR og c4-2 udviser høj nukleart AR i fravær af androgene stimuli. Ved behandling med DHT, blev nukleare AR dramatisk forøget i de hormonafhængige LNCaP celler, mens stigningen i nukleare AR i LNCaP-SSR og c4-2 forblev marginal (fig. 3, tabel 2). For yderligere at analysere ligand-uafhængig kerneimport af AR i LNCaP og kastrationsresistent c4-2 blev celler transficeret med et ekspressionskonstrukt, der koder for grønt fluorescerende AR vildtype-Eos fusionsprotein (AR-EosFP) [19]. I modsætning til LNCaP-celler, hvor AR-EosFP var kun kerneenergi i nærvær af DHT, AR-EosFP var påviselig i kernerne i c4-2 celler i fravær af androgener (fig. 4). Dette fund tyder på, at den fremherskende kernelokalisering af AR i c4-2 celler ikke skyldes en autonom funktion af receptormolekylet men afhænger af en deregulering af cellulære faktorer i c4-2 celler.

Celler blev dyrket under steroid-fri betingelser i 24 timer. Celler blev derefter behandlet med 10 nM DHT og inkuberet i yderligere 30 minutter. Efterfølgende SB216763 blev tilsat (slutkoncentration 5 uM), og celler lodes vokse i yderligere 210 min. Efter denne behandling blev kerneekstrakter fremstillet og analyseret for AR og lamin A som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. AR og Lamin A-niveauer blev kvantificeret ved densitometri. AR niveauer blev udtrykt i fold-change AR /Lamin af celler dyrket i fravær af DHT og SB216763, som blev fastsat til 1.

LNCaP celler og c4-2 celler blev transficeret med par-t1EosFP og dyrket i 24 timer i fravær af androgener. Derefter blev celler behandlet med /uden DHT (slutkoncentration 10 nM). Efter 4 timers nukleare eller cytoplasmatisk lokalisering af AR-EosFP blev overvåget ved fluorescens mikroskopi.

Behandling af kastrationsresistent LNCaP underlinjer med SB216763 udløser en CRM1-medieret nuklear eksport af AR i fravær af androgener

i androgen-stimuleret PC celler, kortvarig hæmning af GSK-3β aktivitet med forskellige små molekyleinhibitorer viste sig at fremkalde en hurtig CRM1-afhængig nucleocytoplasmic shuttling af AR. Det nukleare eksport var uafhængig af virkningsmekanismen af ​​inhibitor, der anvendes i forskellige undersøgelser [32], [19]. For at analysere virkningerne af en GSK-3β-hæmning på androgen-uafhængige nukleare akkumulering af AR blev CRPC cellelinjer LNCaP-SSR og c4-2 behandlet med GSK-3β inhibitor SB216763. Parentale androgenafhængige LNCaP-celler tjente som kontroller (figur 3). Behandling af c4-2 celler med SB216763 inducerede en hurtig nuklear eksport af AR i fravær /tilstedeværelse af androgener, som vist ved densitometri af tre uafhængige Western blots (AR-eksport sats i fravær af DHT = 64%; i nærvær af DHT = 75%) (tabel 2). Androgen-uafhængig cellekerneakkumulering af AR i kastrationsresistent LNCaP-SSR sublinie blev også formindsket efter SB216763 behandling: Virkningerne var mindre udtalt end i c4-2 celler (41% i fravær af DHT, 46% i nærvær af DHT) (tabel 2). Den nukleare eksport af AR i LNCaP-celler dyrket i fravær af androgener forblev marginal men var stadig påviselig (17% i fravær af DHT; 7% i tilstedeværelse af DHT) (tabel 3). Interessant nok kunne det nukleare eksport af AR-proteinet i c4-2 celler dyrket i fravær af DHT efter SB216763 behandling inhiberes ved leptomycin B bekræfter en CRM1-afhængig eksport mekanisme (fig. 5).

C4- 2-celler dyrket i fravær af androgener blev inkuberet med /uden CRM1 inhibitoren leptomycin B (LMB) 30 min før SB216763 behandling. Efter 4 timer blev kerneekstrakter forberedt og analyseres for AR og lamin A som beskrevet i Materialer og Metoder.

Silencing og lang sigt hæmning af GSK-3β i c4-2 celler

Brug en kommerciel valideret shRNA rettet mod GSK-3β (32), var vi i stand til dramatisk at reducere intracellulære GSK-3p niveauer i c4-2 celler (fig. 6A). Denne nedregulering blev parallelt med en udtynding af nuklear AR protein i c4-2 celler. Nuklear udtømning af AR-protein var mindre udtalt, når c4-2 celler blev dyrket i nærvær af AR-stabiliserende hormon DHT (fig. 6A). Langvarig behandling af androgen-stimuleret LNCaP og 22Rv1 celler med forskellige farmakologiske GSK-3p-hæmmere har gentagne gange vist, at GSK-3β er involveret i AR stabilitet [27], [32]. Det faktum, at c4-2 celler udtrykker høje niveauer af cytoplasmatisk samt nuklear AR i mangel af androgener fik os til at analysere virkningerne af SB216763 på intracellulære AR niveauer. Som det ses i fig. 6B, langtidsbehandling med SB216763 fører til en nedregulering af AR protein i c4-2 celler dyrket i fravær af androgener.

(A) Silencing af GSK-3β i c4-2 celler. C4-2-celler blev transient transficeret med pKD-GSK-3β-v1 eller pKD-NegCon-v1. 48 timer efter transfektion blev 10 nM DHT tilsat hvor det er angivet. Efter yderligere 24 timer blev kerneekstrakter fremstillet som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. (B) Langsigtet hæmning af GSK-3β hjælp SB216763. AR-positive c4-2 celler blev behandlet med stigende mængder af SB216763 i 48 timer i fravær af androgener. Cellerne blev lyseret og cellelysater blev analyseret ved Western blotting for AR. p-actin bands tjente som lastning kontrol.

AR-positive CRPC celler c4-2 og LNCaP-SSR er mere modtagelige for væksthæmmende virkninger af GSK-3β inhibitor SB21676 end LNCaP celler eller AR -negative PC3 celler

Inhibering af GSK-3β er blevet vist at inhibere proliferation af AR-positive celler dyrket i nærvær af fysiologiske niveauer af androgener [27], [32]. Med fokus på CRPC celler, vi undersøgt virkningerne af SB216763 om spredning af PC cellelinjer dyrket under androgen-berøvet betingelser. Som det ses i figur 7A, AR-positive CRPC celler dyrket i fravær af androgener var mere modtagelige for de vækstinhiberende virkninger af SB216763 (c4-2 LNCaP-SSR LNCaP). I et tidsforløbseksperiment (fig. 7B), proliferation af AR-positive CRPC cellelinjer LNCaP-SSR og c4-2 dyrket i 96 timer i nærvær af 1 uM SB216763 blev inhiberet med 26% og 35%. I modsætning hertil blev spredning sats af forældremyndigheden LNCaP og AR-negative PC3 kun reduceret med 19% og 8%, når de dyrkes under de samme betingelser. Sammenfattende AR-positive LNCaP-celler var mere modtagelige for SB216763 behandling end de AR-negative PC3-celler. Effekten af ​​SB216763 på cellulær proliferation af PC celler dyrket under androgen-berøvet betingelser var den mest udtalt i AR-positive CRPC celler (c4-2 LNCaP-SSR LNCaP PC3). (. Figur 7A, B)

AR-positive LNCaP, LNCaP-SSR og c4-2 celler såvel som AR-negative PC3-celler, blev behandlet med stigende mængder af SB216763 i 48 timer (A) eller med /uden 1 pM SB216763 i 0, 24 og 96 timer (B). Proliferation blev målt ved anvendelse af et MTT-assay som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. De viste resultater under (A) er udtrykt som% af ubehandlede kontroller ± standardafvigelse. Resultater vist under (B) er udtrykt i procent af SB216763-behandlet /ubehandlet kontrol, som blev fastsat til 100% for tiden nulpunkt ± standardafvigelse.

Hæmning af GSK-3β regulerer AR-signalering ved at modulere intracellulær lokalisering af AR

in vivo

for at simulere virkningerne af en GSK-3β hæmning

in vivo

, vi brugte en modificeret kyllingechorioallantoinmembranen ( CAM) model [25]. SB216763 blev indsprøjtet i en CAM-vene tillader systemisk spredning af forbindelsen i kyllingefosteret-CAM system. Virkningerne af SB216763 på de indpodede tumorknuder blev monitoreret efter 48 timer ved immunhistokemi. I modsætning til de

in vitro

observationer ikke kun c4-2 men også LNCaP udtrykte høje nukleare AR

in vivo

(nuklear AR: LNCaP: 74,6 ± 25,8%, c4-2: 63,4 ± 10%). Efter SB216763 behandling nukleare AR niveauer i c4-2 celler blev reduceret med 57% fra 63,3 til 27,1% efter 48 timer (fig. 8, tabel 1). Nuclear AR niveauer i LNCaP forblev næsten upåvirket af SB216763 (LNCaP: ubehandlet 74,6 ± 25,8%; SB216763-behandlede 76,5 ± 18%) (tabel 3). Procentdelen af ​​PSA-positive celler var højere i c4-2 cellelinien sammenlignet med den parentale LNCaP-cellelinien (% celler Farvning for PSA: LNCaP 3 ± 3,3% versus c4-2 16,8 ± 10,6%), hvilket antyder, at AR i c4-2 er aktiv. Efter SB216763 behandling faldet i nukleare AR i c4-2 blev parallelt med et fald i PSA-positive celler (ubehandlet c4-2: 16,8 ± 10,6% versus 3,8 ± 4,7% i SB216763-behandlede c4-2). (Fig 8, tabel 3).

CAM assay blev udført med c4-2 celler. Efterfølgende blev kernelokalisering af AR og intracellulære PSA fordeling i ubehandlede og SB216763-behandlede tumor-knuder (forstørrelse 400x) udført som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. AR-positive celler er markeret med stjerner.

Diskussion

I de vestlige industrilande, PC udgør et alvorligt sundhedsproblem og er den næststørste årsag til kræftdødsfald hos ældre mænd. Selvom PC er meget heterogen i sin ætiologi androgen signalering er et centralt element i udviklingen og progressionen af ​​PC. Indledningsvis PC celler i høj grad afhænger androgener for vækst og overlevelse. Som følge heraf endokrin terapi involverer androgen depletering ved kirurgisk eller medicinsk kastration, samt blokaden af ​​androgenreceptoren med antiandrogener, er blevet en standard behandling for fremskreden eller metastatisk sygdom. Men fordelen fra endokrine behandlinger af avanceret PC er kun forbigående. Inden for en periode på omkring to år, næsten alle prostatakræft videre til en kastrationsresistent tilstand af sygdom, hvor de ikke længere reagerer på standard endokrine behandlinger. Før i tiden har det været antaget, at tilstanden af ​​CRPC skyldtes en klonselektion af AR-negative celler. Denne antagelse var hovedsagelig baseret på Dunning rottetumormodellen hvor udviklingen af ​​et androgen-ufølsom tilstand er forbundet med tabet af AR i tumorceller under androgenfjernelse. viste imidlertid, kliniske undersøgelser, at AR sjældent er tabt, men er ofte steget i CRPC tumor prøver og deres metastaser [5], [6], [34], [35]. Det faktum, at i mangel af androgene stimuli mange af de samme gener, der er steget med androgener i androgen-afhængige PC bliver forhøjet i CRPC understøtter begrebet konstitutivt aktive AR proteiner i CRPC celler [36]. Denne hypotese understøttes også af den observation, at en afbrydelse af AR funktion hæmmer proliferation af CRPC celler dyrket i fravær af androgener [37].

I denne rapport har vi brugt de AR-positive LNCaP underlinjer c4-2 og LNCaP-SSR som begge er kendt for at vokse og overleve under androgen-berøvet betingelser som en

in vitro

tumor model for CRPC [21], [20]. Vi var i stand til at vise, at i modsætning til de androgenafhængige forældrenes LNCaP celler, kastrationsresistent LNCaP underlinjer c4-2 og LNCaR-SSR udstillet høje niveauer af AR og PSA, når der dyrkes i fravær af androgener. Mest interessant, var stigningen i intracellulær AR proteinniveauer parallelt med en stigning i GSK-3β, et allestedsnærværende serinthreoninkinasedomæne vist at være en vigtig modulator af AR stabilitet

in vitro

[32], [27]. Selv i det øjeblik vi ikke kan sige, at dysregulering af GSK-3p niveauer er ansvarlig for tendens PC celler til at øge intracellulære AR-niveauer samtidig blive kastrationsresistent, vores

in vitro

observationer er i overensstemmelse med en nylig klinisk undersøgelse, der viser en ophobning af GSK-3β i celler af kastrationsresistent tumorer [38]. Påvisningen af ​​høje intracellulære PSA niveauer i c4-2 og LNCaP-SSR blottet for androgen stimuli antyder, at AR er funktionelt aktivt i disse celler selv under androgen- belastede betingelser.

For at generere genomiske signaler, de AR skal transporteres ind i kernen. I denne undersøgelse blev AR fundet at være overvejende nukleare i LNCaP-SSR celler og c4-2 celler i fravær af androgener. Årsagen til den androgen-uafhængige nukleare akkumulering af fuld-længde AR i CRPC celler forbliver stort set ukendt. Under normale forhold den nukleare translokation af AR er steget voldsomt på hormon binding som demonstreret for LNCaP. Nylige resultater antyder, at, AR for at trænge ind i kernen, skal underkastes en intramolekylær konformationsændring, der bringer de N- og C-terminale ender af molekylet i tæt nærhed. Denne konformationsændring intramolekylær tillader aktivering og nuklear translokation af en AR monomer, forud for AR dimerisering, sædvanligvis induceret af ligandbinding og kun forekommer i levende celler, ikke i cellelysater [39], [40], hvilket antyder, at dette intra-molekylær reorganisering af AR ikke er protein-autonom, men afhænger af cellulære faktorer. For at teste denne hypotese, vi efterfølgende transficeret c4-2 og LNCaP-celler med en ekspressionskonstruktion der koder for et vildtype AR typen fusioneret til et grønne Eos fluorescerende protein (EosFP) [41]. I nærvær af DHT AR-EosFP var påviselig i kerner af både LNCaP og c4-2. Når der dyrkes i fravær af DHT, AR-EosFP var kun detekterbar i kerner af kastrationsresistent c4-2 celler, men ikke i kerner af androgenafhængige LNCaP-celler. Denne observation er i overensstemmelse med et lignende eksperiment demonstrerer en robust kernelokalisering af en GFP-mærket AR transficeret ind c4-2 celler [42]. Tilsammen tyder disse resultater på, at den nukleare lokalisering af fuld længde AR i CRPC ikke nødvendigvis kræver hormon bindende, og kan i stedet reguleres af andre faktorer.

Så sent fremgår af vores gruppe, kortvarig hæmning af serin /threonin-kinase GSK-3β af småmolekylære inhibitorer inducerede en hurtig, CRM1-afhængig nucleocytoplasmic shuttling af AR i androgen-behandlede celler [19]. Som GSK-3β overudtrykkes i CRPC celler

in vivo og in vitro

, vi hypotese, at enzymet også kan være en del af en formodet protein-kompleks er involveret i den nukleare akkumulering af AR. Denne hypotese understøttes af en tidligere konklusion, der viser, at GSK-3β er stærkt phosphoryleret i tyrosin 216 (Y216), aktivering funktion af enzymet, i c4-2 celler [30]. Stigningen i GSK-3β

Y216 fosforylering i LNCaP celler efter DHT behandling (fig. 2) foreslår endvidere en vigtig rolle for GSK-3β i AR signalering under normale forhold. I et forsøg på at forstyrre den fremherskende kernelokalisering af AR i CRPC celler behandlede vi kastrationsresistent c4-2 og LNCaP-SSR samt det parentale LNCaP med maleimid SB216763. Denne yderst potent forbindelse er kendt for at inhibere intramolekylær tyrosinkinaseaktivitet af GSK-3β-molekyle, hvor sidstnævnte er ansvarlig for dens autophosphorylering på Y216 [33]. Som det ses i figur 2, GSK-3β-inhibitor SB216763 er i stand til at reducere Y216-phosphorylering af GSK-3β i LNCaP samt i c4-2 celler. Efter behandling med SB216763, den nukleare ophobning af AR i castration- resistente LNCaP underlinjer c4-2 og LNCaP-SSR blev dramatisk reduceret ved tilstedeværelse, og vigtigst i fravær af DHT, bliver mest udtalt i c4-2 celler (tabel 2). Nucleocytoplasmic shuttling af AR efter GSK-3β-inhibering i c4-2 celler dyrket i fravær af DHT kunne vendes ved leptomycin B (LMB), hvilket antyder en CRM1-afhængig eksport mekanisme (fig. 5). I en tidligere undersøgelse identificerede vi et CRM1 bindingssted i C-terminalen af ​​AR [19]. På grund af dens nærhed til ligandbindingsdomænet, vi den hypotese, at hormon binding kan regulere adgangen til CRM1 bindingsstedet, hvorved modulering af nukleare eksport af AR. Observationen, at AR kan eksporteres fra kerner af CRPC celler, der vokser i fravær af androgener er en vigtig roman fund, klart viser, at den nukleare eksport af AR følgende GSK-3β hæmning ikke skyldes en modulering af hormon bindende egenskaber af receptoren.

det faktum, at kortvarig inhibering af GSK-3β (max. 4 timer) fører til en hurtig eksport af AR fået os til at analysere virkningerne af en langsigtet inhibering af enzymet i AR -positive CRPC-celler. Silencing af GSK-3β via bestemte shRNA førte til en udtømning af nuklear AR i c4-2 celler. Nuklear udtømning af AR-protein var mindre markant i c4-2 celler dyrket i nærvær af AR-stabiliserende hormon DHT. Selv om disse resultater støtter den antagelse, at hæmning af GSK-3β udløser nucleocytoplasmic shuttling af AR, skal data fra de langsigtede shRNA-eksperimenter fortolkes forsigtigt. Kort sigt inhibering af GSK-3β-aktivitet ved små molekyler som SB216763 blev gentagne gange vist sig at inducere en hurtig, CRM1-afhængig nuklear eksport af AR i PC celler [19], [32]. I modsætning til disse resultater på lang sigt inhibering af GSK-3β forårsagede en proteasomalaktivitet nedbrydning af AR protein [32]. Fordi GSK-3β udløser AR lokalisering samt AR stabilitet, vi hypotesen, at den dramatiske udtømning af nuklear AR i c4-2 celler efter GSK-3β silencing skyldes en kombination af nuklear eksport og proteasomalaktivitet nedbrydning af receptormolekylet.

det faktum, at hæmning af GSK-3β påvirker AR funktion samt AR stabilitet fik os til at analysere virkningerne af en GSK-3β hæmning om spredning af PC celler

in vitro

. Reaktion på behandling af PC celler med SB216763 var mest udtalt i AR-positive CRPC celler (hæmning af cellevækst: c4-2 LNCaP-SSR LNCaP PC3). Evnen af ​​SB216763 til at inhibere cellulær proliferation blev parallelt med dets evne til at inducere en CRM1-afhængig eksport af AR i PC celler.

For at teste effektiviteten af ​​GSK-3p-inhibitorer som potentielle terapeutiske midler, vi udvidet vores studier til et CAM-xenograftmodel. Til vores overraskelse var AR overvejende nuklear i LNCaP-xenografter samt i c4-2 xenotransplantater. En mulig forklaring på dette kunne være produktionen af ​​androgener af værtsorganismen. Desuden er AR af LNCaP og dets derivater, der bærer en punktmutation (T877A), der fører til en promiskuøs AR kan, i det mindste delvis, aktiveres ved forskellige ikke-androgene steroider [43], [44]. Ikke desto mindre er AR af c4-2 sammenlignet med AR af forældremyndigheden LNCaP er mere aktive i CAM-xenograft model, som dokumenteret af intracellulære PSA niveauer (celler positive for PSA: LNCaP 3,1% og c4-2 16,8% ). Efter en 48 timers behandling med SB216763 blev nukleare AR niveauer af c4-2 celler betydeligt reduceret, hvilket blev modsvaret af en betydelig reduktion i intracellulære PSA niveauer. I modsætning til resultaterne i c4-2 celler virkningerne på AR og PSA i LNCaP-celler forblev ubetydelig.

Samlet vores undersøgelse viser, at (1) overekspression af AR i CpRC celler der parallelt med en stigning i intracellulær GSK-3β, (2) virkningerne af GSK-3β på AR signalering ikke skyldes en modulering af DHT binding til AR, (3) nuklear ophobning af AR i CRPC celler er ikke en selvstændig funktion af en muteret AR receptor men medieres af deregulerede cellulære faktorer, såsom GSK-3β, (4) GSK-3β og CRM1 er en del af en formodet kompleks styrer kernelokalisering af AR i CRPC celler, og (5) inhibering af GSK-3β-aktivitet ved småmolekyleinhibitorer inducerer en hurtig nuklear eksport af AR i CRPC celler

in vitro

in vivo

derved modulerende AR signalering.

afhængighed CRPC på transkriptionelt aktiv AR har resurged interessen i at udvikle inhibitorer rettet mod AR eller androgen akse. Næste generation hormonterapier erkende, at AR i CRPC kan aktiveres af iboende produktion af væv androgener samt ved peptid-vækstfaktorer. Blandt hormonelle agenter øjeblikket testes er CYP17 hæmmere som abiraterone, TAK-700 og TOK-001 eller den anden generation anti-androgen MDV-3100 [45]. Småmolekylære inhibitorer som EPI-001 og sintokamide rettet mod transaktiveringsdomænet ved N-terminalen af ​​AR har vist lovende resultater in vitro såvel som i eksperimentelle dyremodeller [46], [47].