PLoS ONE: A Novel strategi for påvisning og tælling af cirkulerende Sjælden Cell Befolkninger i metastatisk Kræftpatienter Brug Automated Mikrofluid Filtrering og Multiplex Immunoassay

Abstrakt

Størrelse valg via filtrering giver et antigen-uafhængig tilgang til berigelse af sjældne cellepopulationer i blod af cancerpatienter. Vi evaluerede effektiviteten af ​​en ny tilgang til multipleks sjældne celle detektion i blodprøver fra metastatisk brystkræft (n = 19) og lungecancer patienter (n = 21), og raske kontroller (n = 30) under anvendelse af en automatiseret mikrofluid filtrering og multiplex immunoassay strategi. Captured celler blev optalt efter sekventiel farvning for specifikke markører for at identificere cirkulerende tumorceller (CTCs), cirkulerende mesenkymale celler (CMCs), formodede cirkulerende stamceller (CSCS) og cirkulerende endotelceller (de central- og østeuropæiske). Prækliniske validering forsøg under anvendelse cancerceller tilsat til sund blod demonstreret høj genvindingsgrad (middelværdi = 85%) og reproducerbarhed af assayet. I kliniske undersøgelser blev CTCs og CMCs påvist i 35% og 58% af kræftpatienter, henholdsvis og var stort set fraværende fra raske kontroller (3%,

s

= 0,001). De gennemsnitlige niveauer af CTCs var signifikant højere i bryst end i patienter med lungecancer (

s

= 0,03). Fifty-tre procent (53%) af kræftpatienter nærede putative CSCS, mens ingen var påviselig i raske kontroller (

s Restaurant 0,0001). I modsætning hertil blev CØE observeret i både cancer og kontrolgrupper. Direkte sammenligning af CellSearch

® vs. vores mikrofluid filter metode afslørede moderat korrelation (R

2 = 0,46, kappa = 0,47). Seriel blodanalyse i brystkræftpatienter demonstreret gennemførligheden af ​​overvågning cirkulerende sjældne cellepopulationer over tid. Samtidig vurdering af CTCs, CMCs, CSCS og centraleuropæiske lande kan give nye værktøjer til at studere mekanismer sygdomsprogression og behandlingsrespons /modstand

Henvisning:. Magbanua MJM, Pugia M, Lee JS, Jabon M, Wang V, Gubens M, et al. (2015) A Novel strategi for påvisning og tælling af cirkulerende Sjældne Cell Befolkninger i metastatisk cancer Patienter Brug Automated Mikrofluid Filtrering og Multiplex Immunoassay. PLoS ONE 10 (10): e0141166. doi: 10,1371 /journal.pone.0141166

Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: 15 juli, 2015; Accepteret: 4 okt 2015; Udgivet: 23. oktober 2015

Copyright: © 2015 Magbanua et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Siemens Healthcare Diagnostics (SHD). Yderligere finansiering blev opnået fra Breast Cancer Research Foundation (BCRF). BCRF havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. SHD var involveret i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, og forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. JWP modtaget forskningsmidler fra Siemens Healthcare Diagnostics. MP, KM, JP, HS, og AU er medarbejdere i Siemens Healthcare Diagnostics. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Den seneste teknologiske fremskridt har gjort det muligt for pålidelig påvisning og karakterisering af cirkulerende tumorceller (CTCs) i blodet hos cancerpatienter [1, 2]. For at kvantificere niveauet af CTCs har assays blevet udviklet for at lette påvisning af epiteliale celler i blodet ved hjælp af cellulære markører, såsom EPCAM og cytokeratiner [3]. Følgelig har den kliniske betydning af disse celler blevet påvist i talrige undersøgelser, der viser, at forhøjede CTC numre er forbundet med reduceret overlevelse og dårlig respons på terapi [4-7]. Imidlertid har nyere undersøgelser identificeret CTCs med lav ekspression af epitel markører, for eksempel dem, der gennemgår epitel-mesenkymale overgang (EMT), som ikke kan opdages af epitel-assays [8, 9]. Antigen-uafhængige berigelse, såsom filtrering systemer, tilbyder et alternativ tilgang, der potentielt kan fjerne selektionsbias på grund af afhængighed af antigen udtryk [10-14]. Filter-baserede metoder letter berigelse af ikke-hæmatologiske sjældne celler (herunder CTCs) ved at udnytte størrelsesforskelle mellem disse celler og celler i perifert blod [10-14]. Mens leukocytter og erythrocytter typisk måler omkring 6 til 8 pm i diameter, kan CTCs variere i størrelse, med diametre på 10 pM eller mere [15, 16]. Endelig kan celler, som er fanget på filteret underkastes yderligere analyse til påvisning og tælling af CTCs [17-19].

I denne undersøgelse evalueres vi udførelsen af ​​en hidtil ukendt fremgangsmåde til påvisning og tælling af multiple sjældne cellepopulationer i blodet af metastatiske bryst- og lungecancer patienter ved hjælp af en automatiseret mikrofluid filtrering og multiplex immunoassay strategi. Forskellige cirkulerende sjældne cellepopulationer blev påvist og optalt, herunder cirkulerende tumorceller (CTCs), cirkulerende mesenkymale celler (CMCs), cirkulerende endotelceller (de central- og østeuropæiske) og putative cirkulerende stamceller (CSCS). CTC Tællingerne blev sammenlignet med resultaterne fra CellSearch

® systemet, en USA Food and Drug Administration (FDA) -cleared assay til tælling af CTCs. Vi testede også muligheden for seriel blodanalyse i en delmængde af brystkræftpatienter.

Metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Boards på universitetet of California San Francisco (UCSF, Udvalget om menneskelige Research) og Siemens Healthcare Diagnostics (Elkhart, IN, Schulman Associates IRB). Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra hver kræftpatient og raske frivillige, der deltog i denne undersøgelse. Kræftpatienter blev inkluderet mellem januar og august 2014 UCSF. Sunde donorer blev ansat i Siemens.

Patient og Sund Blood Prøvetagning

Ca. 6-9mL blod blev opsamlet i rør indeholdende kalium ethylendiamintetraeddikesyre (K

3EDTA) og 0,45 ml spidde

® (Vacutest Kima). Prøver fra UCSF blev sendt til Siemens Healthcare Diagnostics i isolerede kasser er udstyret med kontrolleret stuetemperatur packs (Saf-T-Pak ™ Inc.) og en digital temperatur optager (Track-It ™, Monarch Instrument). Blodprøver blev opbevaret ved omgivelsestemperatur laboratorium afventer yderligere behandling.

Kontrol Forberedelse

Positive og negative kontroller blev fremstillet ved anvendelse blodprøver fra raske donorer. Ca. 8 ml blod blev trukket ind i rør, der indeholder K

3EDTA og 0,045% spidde

®. For positive kontroller, 10 pi af faste dyrkede celler (ved 10

5 celler /ml) -enten SKBR3 (a brystcancer linje, American Type Culture Collection ATCC

® HTB-30

TM) eller NCI H226 ( en lungekræft linje, ATCC

® CRL-5826

TM) -were tilsat til sund blod. En positiv kontrol indeholdende cirka 1000 celler og en negativ kontrol (ikke-spidse blod fra rask donor) blev inkluderet i hver kørsel.

Cirkulerende Cell Isolation og Immuncytokemi Farvning

Alle blodprøver blev behandlet på Siemens Healthcare Diagnostics. Bearbejdningstrin, der omfattede filtrering, celleisolering og immuncytokemi (ICC) farvning blev udført under anvendelse af en Hamilton starlet ™ robot (Hamilton Company, Reno Nevada). Instrumentet blev specielt udstyret med en filtreringsanordning og software til at styre robotic automatisering af downstream-processer. En filtermembran med overfladeareal på 3,8 cm

2 med en porestørrelse på 8 pm (Whatman ™ Nuclepore ™, GE Healthcare) blev monteret på indretningen. Den 8 um porestørrelse blev valgt baseret på optimal celleindvinding som rapporteret i litteraturen [15, 20, 21]. Nærmere oplysninger om filtrering og celle isolation procedurer er beskrevet i S1 File og S1 Fig. Kort fortalt blev fuldblodsprøver fortyndet med phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,083% fibrinogen. De fortyndede prøver blev derefter filtreret gennem mikrofluid filteranordningen. Denne proces beriger til cirkulering sjældne celler, men også bevarer ca. 50.000-100.000 hvide blodlegemer (WBCs). Cellerne fanget på filtermembranen blev fikseret, og automatiseret ICC-farvning blev udført for at identificere specifikke cellepopulationer. Optimering af assayparametre er diskuteret i S2 File.

S1-tabellen angiver antistoffer og fluorescerende prober anvendt i denne undersøgelse. Nærmere oplysninger om ICC procedure, der er beskrevet i S1 File. Kort fortalt blev cellerne permeabiliseret, og en blokerende opløsning blev tilsat for at forhindre ikke-specifik binding af antistoffer. Celler blev inkuberet i et passende antistof løsning til farvning af målantigener. En rutediagram, der illustrerer farvningen processen vises med S1 Fig Optimering af assay parametre diskuteres i S2 File

Følgende cellelinier blev anvendt som kontroller til bestemmelse tærskler for positive Immunofarvning signaler:. (1) SKBR3, en brystkræft cellelinje, der er CK +, VIM-, CD144-, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; (2) NCI-H2228, en lungekræft cellelinje, der er CK +, VIM +, CD144-, TPBG /5T4 +, PIWIL2-, CD144-; (3) NCI-H266, en lungekræft linje, der er CK +, VIM +, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; (4) MDA-MB-231, en brystcancer cellelinje, der er CK +, VIM-, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; og (5) en transficeret MDA-MB-231 udtrykker PIWIL2 og derfor er CK +, VIM-, TPBG /5T4-, PIWIL2 +, CD144 (gave fra Dr. Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, Kina ). Normale leukocytter og endotelceller blev anvendt som positive kontroller for CD45 og CD144 farvning, henholdsvis og som negative kontroller for alle andre markører.

Mikroskopisk Analyse og optælling af cirkulerende sjældne celler

Detection og billedbehandling af celler blev udført ved anvendelse af et fluorescensmikroskop (Leica DM5000, Leica Microsystems GmbH) (S1 File). Forskellige celletyper blev optalt baseret på farvningsmønstre observeret.

Tærsklen for indledende detektion blev defineret som det punkt, hvor fluorescenssignalet var påviselig at være højere end ikke-specifik fluorescens fra filtreringsmembranen. Analytiske cut-offs blev yderligere defineret på basis af fluorescens niveauer af kendte cancerceller (SKBR-3 eller H226) og WBCs fra raske kontroller anvendes som kontroller til positive og negative signaler, henholdsvis. For konsistens, kun én investigator (KM) talte cellerne, mens en anden investigator (MP) bekræftede celletal.

Statistisk analyse

Vi analyserede tælling resultater (celler /ml) ved hjælp af t- tests. Fishers eksakte test blev anvendt til sammenligning detektionsraten mellem grupperne. En

s

-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Assay Design

Vi evaluerede en ny strategi for multiplex sjældne celle tælling bruger. en automatiseret filtrering-instrument (Siemens Healthcare Diagnostics) og farvning med flere immunofluorescens cocktails. Anordningen består af en filtermembran monteret på en mikromaskine støtte, så isolation af sjældne celler, efterfulgt af automatiske farvningsanordning og mikroskopisk påvisning. Denne engangsemballage integreret celle opsamling og karakterisering enhed ætset med mikrofluide strukturer muliggør kontrolleret filtrering over et trykområde på 10-30 mbar (Fig 1A). Detaljeret design af mikrofluidapparatet er vist i S3 Fig.

A. Design af mikrofluid filter enheden og skematisk oversigt over de behandlingstrin for indfangning og påvisning af cirkulerende sjældne celler, B. Biomarkører og immuno-fænotyper af cirkulerende sjældne celler identificeret ved den sekventielle farvning procedure, C. Gennemsnitlig procent bedring efter spiking kendte numre af H226 lungekræft celler i sundt blod, D. Scatter plot, der viser antallet af H226 spiked celler og antallet af celler inddrives.

CTC farvning cocktail inkluderet 4 ‘, 6-diamidino-2- phenylindol (DAPI), en pan-cytokeratin (pan-CK) antistof, og antistoffer mod Ck8 /18, CK19, og CD45 (S1 tabel). DAPI fluorescens blev detekteret i den blå kanal og blev anvendt til at identificere kerneholdige celler. Fluorescerende Pan-CK, Ck8 /18, og CK19 antistoffer blev anvendt til at mærke celler af epitelial oprindelse og blev påvist i den røde kanal, mens fluorescerende antistoffer mod CD45 blev anvendt til at mærke celler af hæmatopoietisk oprindelse og blev påvist i den fjerne røde kanal . CTCs blev defineret som nukleeret, CK-positive, og CD45-negative, mens WBCs blev defineret som nukleeret men var CK-negative og CD45-positive (Fig 1B).

CMC /CEC farvning cocktail inkluderet antistoffer til vimentin (VIM) og CD144. Den VIM markør blev anvendt til at identificere celler, der undergår EMT. Celler mærket med fluorescerende antistoffer til VIM blev påvist i den røde kanal. Antistoffer mod CD144, blev anvendt til at identificere celler af endotel oprindelse. Mærkede celler blev påvist i den grønne kanal. Også den karakteristiske farvning mønster for CD144 demonstrerer lokalisering på cellemembranen lettet identifikationen af ​​centraleuropæiske lande. Resultaterne af denne farvning proces blev kombineret med dem fra den oprindelige plet, som DAPI og CD45- signaler var stadig synlige. CMCs blev defineret som nukleeret, VIM-positive, CK-negative, CD144-negative, og CD45-negative. CØE blev defineret som nukleeret, CD144-positive, VIM-positive, CK-negativ, og CD45-negative.

CSC farvning proces udnyttet en høj følsomhed immunoassay-metoden ved hjælp Tyramide Signal Amplification (TSA ™, Life Technologies) at detektere ekspressionen af ​​kandidat stamcellemarkører, PIWIL2 og TPBG /5T4, som er udtrykt ved lave niveauer. Forstærkede signaler blev påvist i den grønne kanal og blev brugt til at identificere formodede CSCS defineret som nukleeret, stamceller markør-positive, CK-positiv /negativ, VIM-positiv /negativ, CD144-negative, og CD45-negative. TPBG /5T4 udtryk blev anvendt til at identificere formodede lungekræft CSCS mens PIWIL2 udtryk blev anvendt til at påvise formodede brystkræft CSCS.

meget kontrolleret filtreringsproces og multi-step farvende parametre blev optimeret for at minimere detektering af falske positive i rask donor blod. Anvendelse af en proprietær blodindsamling rør indeholdende en optimeret fiksativ formulering (spidde

®), sammen med kontrollerede forsendelse og opbevaringsbetingelser bidrog til den høje indberetningspligtige resultater (98%).

Analytisk ydeevne

først evalueres vi ydeevne mikrofluid filter enhed ved hjælp af spyd-in model involverer H226 lunge cancerceller. En række 5-160 celler blev tilsat til sundt donorblod og isoleret under anvendelse af indretningen. ICC farvning og mikroskopiske analyser blev udført for at opdage og opregne nukleeret, CK-positive, og CD45-negative celler. Ensartethed af celletællinger observeres blandt tredobbelte prøver angivet høj reproducerbarhed (Fig 1C). Desuden observerede vi en høj korrelation mellem observerede og forventede udbytte (R

2 = 0,99). Isolering af spidse celler var meget effektiv, med en samlet tilbagebetaling på 85% (Fig 1D). Med 5 spiked celler, blev observeret lavere genvinding på 40%, og kan henføres til rør tilslutning og celletab. Disse resultater er helt sammenlignelige med dem i CellSearch [22, 23]. For eksempel CellSearch opregning af spiked prøver var 80% og 82% [22]. Allard og kolleger [23] rapporterede opsving med en 4 celle spike viste standardafvigelse på 2 og 95% konfidensinterval på 1-11, som er statistisk skelnes fra vores resultater med 5 celle spike.

Klinisk Test

Klinisk validering af mikrofluid filter enhed blev udført på hele blodprøver fra metastatiske bryst og lungekræftpatienter. For at bestemme baggrundsniveauer i raske personer blev blodprøver fra 30 kontroller også vurderet. Prøver blev behandlet via mikrofluid filterindretningen, og celler fanget på membranen blev farvet for markører til at identificere cirkulerende celler af interesse. Repræsentative billeder af forskellige celletyper er illustreret i figur 2.

Repræsentative billeder af cirkulerende tumorceller (CTC), hvide blodlegemer (WBC), cirkulerende mesenkymceller (CMC), cirkulerende endotelceller (CEC), og putative cirkulerende stamceller (CSC) i metastatisk brystkræft (B) og lunge (L) kræftpatienter. Skalaen søjle repræsenterer 8 pm.

Patient karakteristika er præsenteret i tabel 1. Af de 43 patienter, der deltog, 40 var evaluerbare (S2 Fig). Den endelige kohorte bestod af 19 brystkræftpatienter og 21 lungekræftpatienter. Af kræftpatienter de 19 bryst, 95% var ER-positive og 26% var HER2-positive, mens 81% og 19% af patienterne lungekræft blev diagnosticeret med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og småcellet carcinom ( SCLC), hhv. Klinisk relevante driver mutationer, f.eks i

EGFR

,

KRAS

, og

ELM4-ALK

fusion, var til stede i 40% af patienterne i lungekræft.

Forkortelser: ER-østrogen receptor, NSCLC- ikke-småcellet lungekræft, SCLC- småcellet lungekræft

påvisning og tælling af sjældne cirkulerende cell typer

Vi. analyserede farvede mønstre på indfangede celler ved hjælp af fluorescens mikroskopi at opregne CTCs, CMCs, central- og østeuropæiske lande og formodede CSCS i blodet hos kræftpatienter og raske kontrolpersoner. Tælling Resultaterne er sammenfattet i tabel 2. Salg

Forkortelser: Cirkulerende tumorceller (CTC), cirkulerende mesenkymale celler (CMC), cirkulerende endotelceller (CEC) og formodede cirkulerende stamceller (CSC)

CTCs blev fundet i 35% af kræftpatienter, herunder 47% af patienterne i brystkræft og 24% af patienterne lungekræft (fig 3A). CTCs var stort set fraværende fra kontroller, med undtagelse af en enkelt celle påvist i en rask donor (3%). CTC påvisning hos kræftpatienter var signifikant højere end hos raske kontroller (

s

0,001). Det gennemsnitlige CTC niveau i brystkræftpatienter (0,41 CTC /ml) var signifikant højere end i lungekræft patienter (0,04 CTC /mL,

s

= 0,03) (tabel 2, figur 4A).

Procentdel af prøver med påviselige sjældne celler: A. cirkulerende tumorceller (CTC), B. cirkulerende mesenkymale celler (CMC), C. CTC og CMC, B. cirkulerende mesenkymale celler (CMC), D. formodede cirkulerende stamceller ( CSC), og E. cirkulerende endothelceller (CEC) i metastatisk bryst- og lungekræft patienter og raske kontrolpersoner. F. Procentdel af patienter med påviselige celleklynger. Procent detektion mellem grupper blev sammenlignet ved hjælp af Fisher eksakte test og blev betragtet som signifikant (*), når

s

-værdi WAS. 0,05, ellers ikke signifikante (NS)

Mean celler pr ml for A. cirkulerende tumorceller (CTC), B. cirkulerende mesenkymceller (CMC), C. CTC og CMC, D. formodede cirkulerende stamceller (CSC), og E. cirkulerende endotelceller (CEC) i metastatisk brystkræft og lungekræft patienter og raske kontroller. En enkelt prøve t-test blev anvendt til at sammenligne middelværdier celler per ml til befolkningen betyder på 0. En stjerne (*) angiver en

s

-værdi 0,05, F. Sammenligning af tælling resultater mellem CellSearch

® og mikrofluid filter assay, G. aftale i positive og negative opkald mellem CellSearch

® og mikrofluid filter assay i 16 blodprøver. Prøver med ≥5 cirkulerende tumorceller (CTC) pr 7,5 ml blod blev betragtet som positive ved hjælp af CellSearch

® assay mens prøver med påviselig CTC ( 0). Ansås positive ved anvendelse af mikrofluid filter-baserede assay

CMCs blev påvist i 58% af kræftpatienter, herunder 58% i brystcancer og 57% i lungekræft (fig 3B). CMC afsløring var signifikant højere hos kræftpatienter end hos raske kontroller, i hvem der ikke er konstateret CMCs (

s

0,001). Mean CMC niveauer var 0,34 CMC /ml i brystkræftpatienter og 2,37 CMC /ml i lungekræftpatienter, som ikke var en signifikant forskel (

s

= 0,23) (tabel 2, fig 4B).

Når påvisning af både epitel (CTCs) og mesenkymale (CMCs) celletyper blev kombineret, CTC + CMC frekvens hos kræftpatienter var 70%, herunder 79% af brystkræft og 62% af lungekræftpatienter henholdsvis (fig 3C ). Dette var betydeligt højere end opdagelse sats på 3% hos raske kontroller (

s

= 0,001). Mean CTC + CMC niveauer hos brystkræftpatienter (0,75 celler /ml) var ikke signifikant forskellig fra den af ​​lungekræftpatienter (2,41 celler /ml,

s

= 0,32) (tabel 2, fig 4C).

Formodede CSCS blev påvist i 54% af kræftpatienter, herunder 58% af brystkræftpatienter og 50% af patienter med lungecancer (fig 3D). CSC detektion i kræftpatienter var signifikant større (

s

0,001) end hos raske kontroller, som ikke udviste påviselige CSCS (Fig 4D)

I skærende kontrast til CTCs, CMCs. og CSCS, CØE var til stede i 43% af raske kontroller. CØE blev påvist i 55% af kræftpatienter globalt herunder 53% af brystcancer og 57% af patienterne lungekræft (Fig 3e). CEC afsløring frekvens var ikke signifikant forskellig mellem kræftpatienter og kontroller. Samlet CØE var den mest udbredte af cellepopulationen undersøgt hos cancerpatienter (gennemsnit, 3,61 CEC /ml). Desuden dette betyde CEC niveau hos kræftpatienter var signifikant højere end hos raske kontroller (0,47 CEC /ml,

s

= 0,007), tabel 2, figur 4E).

De gennemsnitlige cellestørrelser for CMC, CEC og CSCS blev alle omtrent 10 uM i diameter (interval, 5 til 15 uM). Vi iagttog indvundne celler, der var mindre end porestørrelsen. Vi tilskriver evnen til at fælde mindre celler til tværbindingen virkning af paraformaldehydfiksering. Desuden observerede vi, at filtrering opsving var den samme for alle celletyper af samme størrelse. Andre filtrering systemer har rapporteret den samme opsving for dyrkede celler af samme størrelse, og reduceret genvinding for celler med mindre størrelser [11, 13, 24, 25].

Andre undersøgelser har rapporteret tilstedeværelsen af ​​CK-positive og CD45-positive celler i blodet hos cancerpatienter [26, 27]; Imidlertid blev disse celler ikke påvist i vores prøver. Vi registrerer lejlighedsvise klynger af celler i forskellige cellepopulationer, især for CØE (Fig 3F). Formodede CSCS blev dog kun påvist som enkelte celler. blev ikke observeret nogen signifikant forskel i forekomsten af ​​celleklynger mellem lunge og brystkræftpatienter.

Sammenligning med CellSearch

® Assay

I 16 dobbelte blodprøver, CTCs blev analyseret ved hjælp af både mikrofluid filter-baserede assay og CellSearch

® system. Direkte sammenligning af CTC afsløring afslørede moderat aftale mellem de to analyser (Fig 4F, R

2 = 0,46, Fig 4G, kappa = 0,47).

Serial Blood Analysis

I 3 bryst cancerpatienter blev blodprøver serielle analyseret for at evaluere muligheden for at overvåge cirkulerende cellepopulationer over tid.

Patient a var en 49-årig kvinde diagnosticeret med eR-positive, HER2-negativ metastatisk brystcancer. Blodprøver blev opsamlet på dag 0, 28, og 84 af et klinisk forsøg (Fig 5A). Mikrofluid filter-baseret analyse afslørede en markant stigning i alle sjældne cellepopulationer (CTCs, CMCs, CSCS, og de central- og østeuropæiske) mellem tidspunkter 2 og 3. I modsætning hertil parallel test via CellSearch

® systemet ikke afsløre eventuelle CTCs. Klinisk test for serum tumormarkør CA 15-3 på matchende tidspunkter viste en tilsvarende stigning mellem tidspunkter 2 og 3 (CA 15-3 niveauer: 84, 88, 124 U /ml). Efterfølgende klinisk vurdering bekræftede, at patienten oplevede sygdomsprogression.

Cirkulerende tumorceller (CTC), cirkulerende mesenkymale celler (CMC), cirkulerende endotelceller (CEC), og formodede cirkulerende stamceller (CSC) blev optalt i blodet udtaget på forskellige tidspunkter (TP) under behandling. Y-aksen til venstre repræsenterer skalaen for CTC, CMC, og CSC pr ml blod, mens y-aksen til højre viser skalaen for CEC pr ml blod. Klinisk respons blev vurderet ved hjælp af svar evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) kriterier måling.

Patient B var en 54-årig kvinde diagnosticeret med ER-positive, HER2-negativ metastatisk brystkræft. Blodprøver blev opsamlet på dag 0 og 14. Mikrofluid filter-baseret analyse viste ingen påviselige CTCs ved hver tidspunkt. CellSearch

® blev udført på en uafhængig prøve cirka tre uger før den første mikrofluidsystem filter-baseret testning (dag -21), samt på en parallel prøve på tidspunkt 2; disse ligeledes viste ingen påviselige CTCs. Men niveauet af CSCS var lave og forblev uændret. CMCs og CØE blev også opdaget og niveauer syntes at falde over tid (figur 5B). Serum CA 15-3 niveauer vurderede 26 dage før og 2 dage efter den første mikrofluid filter-baserede test viste et mindre fald (50 og 47 U /ml). Klinisk vurdering viste, at patienten havde et delvist svar på kræftbehandling.

Patient C var en 68-årig kvinde diagnosticeret med ER-positive, HER2-negativ metastatisk brystkræft. Blodprøver blev opsamlet på dag 0 og 30. Mikrofluid filter-baseret analyse viste forhøjede niveauer af alle cirkulerende sjældne cellepopulationer på dag 30 (figur 5C). CellSearch

® test af blodprøver på identiske tidspunkter også vist en stigning i CTC niveauer (7 og 17 CTCs pr 7,5ml af blod). Klinisk vurdering afslørede sygdomsprogression.

Diskussion

Vi udviklede en ny analyse til berigelse, påvisning og tælling af cirkulerende sjældne cellepopulationer hos kræftpatienter. Protokollen består af to faktorer: berigelse ved filtrering under anvendelse af en mikrofluidanordning og sekventiel multiplex immunfarvning at identificere sjældne celletyper. Efter omfattende præklinisk afprøvning evaluerede vi den kliniske ydeevne vores assay at opdage og optælle CTCs, CMCs, CSCS, og CØE i blodet af metastatisk bryst- og lungekræft patienter.

En række mikrofluide metoder til isolering af CTCs er blevet rapporteret [28-32]. For eksempel har CTC-iCHIP, et automatiseret mikrofluid separationssystem blevet anvendt med succes isolere og analysere CTCs [28, 32]. Så vidt vi ved, har ingen af ​​de eksisterende platforme blevet anvendt til multipleks påvisning af cirkulerende sjældne celler.

CTCs hyppigt blev fundet i bryst- og lungecancer patienter, men var stort set fraværende i raske kontroller. Det gennemsnitlige niveau af CTCs var signifikant højere i bryst i forhold til patienter med lungecancer, i overensstemmelse med tidligere observationer ved hjælp af CellSearch

® assay [10]. Head-to-head sammenligning af vores mikrofluid filter metode vs. FDA-ryddet CellSearch

® systemet afslørede moderat aftale.

Vi har tidligere rapporteret muligheden for optælling og isolering af CTCs ved fluorescens-aktiveret celle (FACS) efter immunomagnetisk berigelse [33-35]. både immunomagnetisk berigelse og FACS farvning, var imidlertid baseret på EPCAM udtryk. Filtreringen-baserede metode, der anvendes i den aktuelle undersøgelse eliminerer afhængighed af overflademarkører til identifikation af CTCs. Derfor, i tillæg til CTCs med epitelial markør ekspression vores assay også detekteret cirkulerende sjældne celler med mesenchymale markør ekspression. Faktisk blev påvist CMCs i 58% af kræftpatienter, og ingen blev påvist i raske kontrolpersoner. Kombineret afsløring af epitelial (CTCs) og mesenkymale (CMCs) sjældne celletyper (dvs. CTC + CMC) var 79% og 62% i bryst og lungekræftpatienter henholdsvis repræsenterer en potentiel stigning i sensitivitet i forhold CTC eller CMC alene.

kræft stamceller hypotese postulerer, at en sjælden delpopulation af tumorceller i stand til selv-fornyelse og multipotency er ansvarlige for tumor initiering og vækst [36, 37]. Adskillige markører, herunder CD44, CD24, og ALDH1, er blevet anvendt til at detektere og berige for formodede CSCS fra solide tumorer [38-40]. I denne undersøgelse anvendte vi to hidtil ukendte kandidat stamcellemarkører, PIWIL2 [41, 42] og TPGB /5T4 [43, 44], for at opdage formodede CSCS hos cancerpatienter. PIWIL2 er medlem af P-element-induceret wimpy testis /Argonaute (PIWI /AGO) familie og spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kønsceller [45]. Undersøgelser har for nylig vist, at PIWIL2 udtrykkes i præcancerøse og cancer stamceller [41, 42, 46, 47]. Derudover er dette gen udtrykkes i forskellige stadier af brystkræft, men ikke i normalt brystvæv [48]. Den anden formodede stamceller markering, trophoblast glycoprotein (TPBG /5T4), er en onkoføtalt protein, som udtrykkes i føtale trofoblaster, det yderste lag af celler i en mammal embryo [49]. Nylige undersøgelser har vist, at TPBG /5T4 udtrykkes i tumor-initierende celler i lungekræft [43, 44], og høj ekspression i flere cancertyper har været forbundet med ringere kliniske resultater [43, 50-52]. I denne undersøgelse blev putative CSCS detekteret i et flertal af bryst- og lungecancer patienter, men var helt fraværende i raske kontroller.

endotelceller i omløb kan opstå i tumorangiogenese-relaterede processer hos cancerpatienter, samt som fra skade af den normale kar [53-55]. Ændringer i CEC niveauer er blevet observeret i en række indstillinger sygdom, herunder kræft, infektioner og hjertekarsygdomme [56-60]. CØE imidlertid ofte observeres i sygdomsfrie individer såvel [54, 55]. I vores undersøgelse CØE var den mest udbredte af cellepopulationerne undersøgt i begge cancerpatienter og hos raske forsøgspersoner; imidlertid havde kræftpatienter synes at vise noget højere niveauer. Dette fund er i overensstemmelse med resultaterne fra en tidligere undersøgelse, der viser, at størstedelen af ​​de cirkulerende sjældne celler fanget af størrelse udvælgelse var endotelceller [19].

For at demonstrere muligheden for seriel analyse, cirkulerende sjældne celler i udvalgte bryst kræftpatienter blev analyseret på forskellige tidspunkter i løbet af behandlingen. Sammenligning af antallet af cirkulerende sjældne celler med niveauerne af etablerede kliniske markører, såsom CA 15-3 og CTC-analysen af ​​Cellsearch

®, viste lignende tendenser. Derudover indledende bemærkninger i dette lille antal patienter viste, at niveauer af cirkulerende sjældne celler kan korrelere med respons resultat.

Selvom vores sekventielle immunfarvning tilgang i sidste ende giver meget rene cellepopulationer, celle opsving kan yderligere forbedres ved at evaluere forskellige filtrer og filtreringsparametre [13, 15]. Også parallel test med forskellige isolation teknikker, herunder flowcytometri, kan udføres for at sammenligne udnytte effektiviteten.

Vores tilgang står over for lignende begrænsninger som med andre size-baserede metoder.