PLoS ONE: ErbB3 Positivt korrelerer med Intestinal Stem Cell Markers men Markerer en Distinct Non proliferativ Cell Befolkning i kolorektal Cancer

Abstrakt

Flere undersøgelser har antydet ErbB3 /HER3 kan være en nyttig prognostisk markør for colorectal cancer. Tumorer med en intestinal stamcelle signatur har også vist sig at være mere aggressiv. Her vil vi undersøge, om ErbB3 er forbundet med intestinale stamcelle markører i kolorektal cancer og hvis cancer stamceller inden tumorer er markeret ved ekspression af ErbB3. Angivelse af ErbB3 og tarm stamcellemarkører (LGR5, EPHB2, CD44s og CD44v6) blev vurderet ved QRT-PCR i primære kolorektale tumorer (faser 0 til IV) og matchede normale væv fra 53 patienter. Lokaliseringen af ​​ErbB3, EPHB2 og KI-67 inden tumorer blev undersøgt ved anvendelse af co-immunofluorescens. Ekspression af ErbB3 og tarm stamcellemarkører var signifikant forhøjet i adenomer og kolorektale tumorer i forhold til normalt væv. Positive korrelationer blev fundet mellem ErbB3 og intestinale stamcellemarkører. viste imidlertid, co-immunfluorescens analyse, ErbB3 og EPHB2 markeret specifikke cellepopulationer, der var gensidigt udelukkende inden for tumorer med forskellige proliferative potentialer, de fleste af ErbB3 + ve celler bliver non-proliferativ. Dette mønster ligner cellulære organisation inden normal colon epitel hvor EPHB2 mærkede proliferative celler bor på krypten base og ErbB3 + ve celler markerer differentierede celler i toppen af ​​krypter. Vores resultater viser, at ErbB3 og intestinal stamcellemarkører korrelerer i kolorektale cancere. ErbB3 lokaliseres til differentierede cellepopulationer inden tumorer, der er ikke-proliferative og forskellige fra cancer stamceller. Disse data understøtter det koncept, at tumorer indeholder diskrete stamceller, proliferative og differentiering segmenter, svarende til den foreliggende i normale krypter

Henvisning:. Jarde T, Kass L, Hæfteklammer M, Lescesen H, Carne P, Oliva K, et al. (2015) ErbB3 Positivt korrelerer med Intestinal Stem Cell Markers men Markerer en Distinct Non proliferativ Cell Befolkning i kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (9): e0138336. doi: 10,1371 /journal.pone.0138336

Redaktør: Michelina Plateroti, University Claude Bernard Lyon 1, FRANCE

Modtaget: December 23, 2014 Accepteret: August 28, 2015; Udgivet: 14 September, 2015

Copyright: © 2015 Jarde et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. forfatterne anerkender støtte til dette arbejde fra National Health og Medical Research Council (Australien) projekttilskud 1010429 til HA og PJM, og 1011187 til HA. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er en af ​​de mest almindeligt diagnosticerede og dødelige kræftformer hele verden, med mere end 1,2 millioner nye tilfælde og 0,6 millioner dødsfald anslået i 2008 [1]. Terapeutiske strategier, der omfatter kirurgisk resektion koblet til kemoterapi er relativt effektiv i behandling af hele tumormasse. Imidlertid vil mange kræftformer igen ske inden måneder eller år. Sygdomstilbagefald er blevet foreslået at skyldes kemoresistente cancerstamceller som formidler før tumorresektion. Disse multipotente celler er derefter i stand til at give anledning til en ny tumor, der fører til cancer tilbagefald og metastaser. Nylige fremskridt i kolorektal cancer har ført til karakterisering af intestinale stamcelle markører, herunder LGR5, EPHB2, og CD44 [2-4]. I normal tyktarmsepitelet er disse markører begrænset til bunden af ​​krypterne hvor stamcellerne bor. Højere ekspressionsniveauer af disse markører er fundet i colorektal cancer sammenlignet med tilstødende normale væv og LGR5 ekspression positivt korrelerer med antallet af lymfeknudemetastaser [4-7]. Kolorektal cancer patienter med høj ekspression af en intestinal stamcelle gen signatur, herunder LGR5 og EPHB2, har en 10 gange højere risiko for tilbagefald sammenlignet med patienter med lave niveauer [8]. Forståelse af de signalveje og molekyler, der regulerer cancer stamceller er nødvendig for at udvikle robuste prognostiske metoder og nye terapeutiske strategier.

ErbB-familien af ​​receptortyrosinkinaser, også kendt som HER receptorer, består af fire medlemmer-ErbB1 /HER1 ErbB2 /HER2, ErbB3 /HER3 og ErbB4 /HER4. Disse receptorer er vigtige modulatorer af normal vækst og udvikling og deres fejlregulering har været impliceret i initiering og progression af cancere [9, 10]. Antistof-baserede terapier rettet mod ErbB1 eller ERBB2, der tager sigte på at mindske deres signal transduktion kapaciteter, har vist kliniske fordele i behandlingen af ​​flere tumorer [11]. På grund af fraværet af et aktivt intracellulært tyrosinkinasedomæne, blev ErbB3 bort i flere år som et target cancer [12]. Men ErbB3 er for nylig blevet foreslået at være involveret i erhvervet resistens over for terapier og har vist sig som et potentielt terapeutisk mål fører til udvikling af flere anti-ErbB3 antistoffer [13]. Selvom den præcise funktion af ErbB3 i colorektal cancer ikke er helt forstået, flere undersøgelser tyder på, at ErbB3 afbrydes i tumorer. For eksempel har ErbB3 somatiske mutationer blevet identificeret i 11% af coloncancere og flere undersøgelser har vist, at ErbB3 udtrykkes i 36-89% af colorektale cancere [14-20]. Nogle undersøgelser har antydet, at øget ErbB3 protein ekspression i colon cancer også er forbundet med nedsat patientoverlevelse [20, 21].

In vitro

, ErbB3 knockdown nedsat celleproliferation, induceret apoptose og blokerede migration af tyktarmskræft celler [21]. En lignende mekanisme blev observeret

in vivo

hvor ErbB3 knockdown forsinket tumorvækst [14]. Selv om disse data er helt klart tegn på en onkogent potentiale for ErbB3, det er i øjeblikket uvist, om ErbB3 regulerer kolorektal cancer stamceller pulje, der er foreslået til at drive tumor initiering og tumor tilbagefald [8, 22].

Materialer og Metoder

Patient rekruttering og væv samling

Halvtreds tre patienter med primære adenomer (n = 4) eller adenokarcinomer (n = 49) blev opereret i 2012/2013 på Cabrini Hospital (Malvern, Victoria) . Undersøgelsen blev godkendt af Cabrini menneskelige forskningspotentiale etiske komité. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke. Tumor prøver og matchede normale colon væv var frisk opbevaret i RNAlater (Qiagen) for RNA ekstraktion og fikseret i 4% paraformaldehyd i væv ekspressionsanalyse.

Cell kultur

LIM1215, LIM1899, LIM2405, LIM2550 blev Caco2 og SW480 humane kolorektale kræft cellelinjer anvendt i denne undersøgelse (blev leveret som en gave fra The Ludwig Institute for cancer Research, Parkville, Australien) [23-26]. Celler, undtagen Caco2-celler, blev rutinemæssigt passeret i RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt kalveserum (Gibco), penicillin /streptomycin (Gibco) og glutamax (Gibco). Caco2-celler blev holdt i DMEM indeholdende 20% føtalt kalveserum (Gibco), penicillin /streptomycin (Gibco) og glutamax (Gibco). Celler blev dyrket i en fugtig atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C.

RNA-ekstraktion, cDNA forberedelse og kvantitativ RT-PCR Salg

væv fra reseceret colorektale cancere og matches normalt væv blev homogeniseret og total RNA ekstraheret ved anvendelse TRlzol-reagens (Life Technologies) og RNeasy mini kit (Qiagen). Totalt RNA blev ekstraheret fra colorektale cancerceller fra de 6 cellelinjer under anvendelse af RNeasy mini kit (Qiagen). RNA blev revers transkriberet under anvendelse af QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (QRT-PCR) blev udført under anvendelse Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Tredobbelte prøver blev analyseret på en LightCycler 480 maskine (Roche Diagnostics). Genekspressionsniveauer blev beregnet under anvendelse af 2

-DDCt metode under anvendelse af geometriske gennemsnit af 2 husholdningsgener. p-actin og β-2-mikroglobulin som normalisers fordi de genererede den bedste score ved sammenligning carcinomer med normal slimhinde [27, 28]. Primere er opført i S1 tabel.

Immunofluorescens

Faste væv blev paraffinindstøbte og skåret i 4 um sektioner. Objektglas blev deparaffinised i xylen, rehydreret i graduerede alkoholer og inkuberet i citratbufferopløsning (pH = 6) i 10 minutter i en trykkoger.

tyktarms cancerceller fra 6 forskellige cellelinjer blev dyrket i 4 dage på poly-L-lysin overtrukne objektglas, vasket med PBS og fikseret med iskold acetone i 10 minutter.

Både vævssektioner og kolorektal cancer cellelinie objektglas blev blokeret med CAS blok (Life Technologies) i 1 time ved stuetemperatur før inkubation natten over ved 4 grader med primære antistoffer, EPHB2 (R 2 gange) sammenlignet med matchede normale væv (Fig 1). Den mediane niveau af ErbB3 udtryk i adenokarcinomer (0,141) var signifikant højere end i normale væv (0,079) (Wilcoxon matchede-par test, p 0,0005) (figur 1). Lignende resultater blev opnået i adenomer sammenlignet med normale væv, selvom forskellen ikke nåede statistisk signifikans (parret Students t-test, p = 0,061) sandsynligvis på grund af det lave antal adenom prøver i denne patient kohorte (n = 4) (Fig 2A ). Middelværdien af ​​logaritmen af ​​folden ændring (0,587) var signifikant forskellig fra 0 (p = 0,009, one-sample t-test). Lineær regression modellering viste, at ErbB3 ekspressionsniveauerne var også signifikant højere i fase IV tumorer sammenlignet med iscenesætte jeg tumorer (Koefficient = 1,36, (95% konfidensinterval (CI) 0,07, 2,64), p = 0,039, data ikke vist). Der var ingen andre væsentlige relationer mellem ErbB3 ekspressionsniveauerne og kliniske markører såsom sygdom stadie, grad og TNM etaper. Forøget ekspression af ErbB3 i adenomer og adenocarcinomer i forhold til normale væv blev bekræftet ved immunhistokemi (figur 2B). ErbB3 blev overvejende lokaliseret til det apikale og basolaterale celleoverfladen af ​​normale intestinale epitelceller og blev påvist på celleoverfladen i de fleste tumorer med nogle diffus cytoplasmatisk farvning tilsyneladende i nogle få tilfælde (S1 Fig).

Kvantitativ real-time PCR resultater er udtrykt i forhold til matchede normalt væv for hver adenocarcinom (n = 50). Inserter viser boxplots sammenligner de absolutte værdier af genekspression i normal (N) og tumor (T) væv. * Signifikant forskel i forhold til kontrol væv (Wilcoxon sign rank test, p 0,001)

(A):. De gennemsnitlige ekspressionsniveauer (2

-ΔΔCt) hvor hvert gen blev beregnet i forhold til beta-2-mikroglobulin og p-actin ekspressionsniveauer ved QRT-PCR i normale colon væv (n = 54), kolorektale adenomer (n = 4) og colorectale adenocarcinomer (n = 54) (gennemsnit ± SEM). Der blev observeret signifikante forskelle (*) i forhold til kontrol væv (parret Students t-test, p 0,001). (B): Immunhistokemisk påvisning af ErbB3 og EPHB2 i normal colon væv, adenom og adenocarcinom. Scale bar, 50 um.

udtryk for multiple intestinale stamcellemarkører blev undersøgt (LGR5, EPHB2, CD44s og CD44v6). CD44s er en isoform fælles for alle CD44-varianter og er blevet anvendt til at identificere formodede stamceller i flere vævstyper. En nylig undersøgelse antydede, at CD44v6, som indbefatter variant exon 6, var en vigtig regulator af intestinale stamceller og kræft dannelse så vi også har analyseret dette i vore undersøgelser [29, 30]. LGR5, EPHB2, CD44s og CD44v6 var alle signifikant opreguleret i cancer væv sammenlignet med normale væv (gennemsnitlig stigning 9,4 gange, 3,5 gange, 3,0 gange og 6,4 gange henholdsvis alle p-værdier 0,0005; en- sample t-test af loggede værdier = 1) (fig 1). Lignende resultater blev opnået i adenomer sammenlignet med normale væv (Fig 2A). Ekspressionsniveauerne af LGR5, EPHB2, CD44s og CD44v6 blev forhøjet mindst 2 gange i 70,8% (34/48), 72,0% (36/50), 66,0% (33/50) og 86,0% (43/50) af tumorvæv sammenlignet med matchede normale væv (Fig 1). Forøget ekspression af EPHB2 i adenomer og adenocarcinomer i forhold til normale væv blev bekræftet ved immunhistokemi og er klart lokaliseret til epitel tumorvæv (figur 2B). EPHB2 ekspressionsniveauerne var signifikant højere i fase III, men ikke iscenesætte IV, tumorer i forhold til fase I tumorer (Koefficient = 1,47 (95% CI 0,30, 2,64), p = 0,015). Der var ingen andre væsentlige sammenhænge mellem ekspression af stamceller og kliniske markører.

ErbB3 positivt korrelerer med tarm stamcelle markører i kolorektal cancer og kolorektale kræft cellelinjer

Korrelationer mellem mRNA fold ændringer ( adenocarcinom

vs

normal) af markører beskrevet i tabel 1, blev vurderet ved anvendelse Spearman rank korrelation test. Intestinal stamcellemarkør fold ændringer (LGR5, EPHB2, CD44s og CD44v6) var positivt indbyrdes korrelerede (tabel 1). Interessant blev positive korrelationer findes mellem ErbB3 og stamcellemarkører LGR5, EPHB2 og CD44v6 (tabel 1). Lignende resultater blev opnået, når adenom og adenocarcinom blev kombineret (S3 tabel).

A QRT-PCR-analyse af EPHB2 og ErbB3 ekspressionsniveauer blev også udført under anvendelse af 6 kolorektale carcinom-cellelinier. Både ErbB3 og EPHB2 blev påvist på forskellige ekspressionsniveauer i disse cellelinier (fig 3A). Vigtigst, og som observeret i de primære tumorer, ekspressionen af ​​ErbB3 og EPHB2 var positivt korreleret (Fig 3B, Pearson korrelation test, rho = 0,999, p 0,0001)

(A):. Den gennemsnitlige ekspression niveauer (2

-ΔΔCt) af ErbB3 og EPHB2 blev beregnet i forhold til beta-2-mikroglobulin og p-actin ekspressionsniveauerne ved QRT-PCR i 6 forskellige kolorektal cancer cellelinier (n = 3, gennemsnit ± SEM). (B):. Positiv lineær korrelation mellem ErbB3 og EPHB2 ekspressionsniveauerne (Pearson korrelation test, rho = 0,999, p 0,0001)

Tyktarmskræft ligner normal colon væv

Den positive korrelationer fundet på RNA-niveau mellem ErbB3 og tarm stamcellemarkører fik os til at undersøge potentialet co-lokalisering af ErbB3 og tarm stamcelle markører i tumorer. Flere antistoffer rettet mod LGR5 (Sigma-Aldrich, HPA012530, Abgent, AP2745, ABCAM, ab75850), CD44 (Abcam, ab41478) og EPHB2 (R EPHB2 + /ERBB3-; EPHB2- /ErbB3 +; EPHB2- /ERBB3-) blev kvantificeret (100-200 P -H3 + -celler pr tumor). 70,0% (fra 57,5% til 81,8%) af P-H3 + -celler blev placeret i EPHB2 + /ERBB3- population, mens i modsætning kun 8,8% (2,5 til 14,0%) p-H3 + -celler blev placeret i EPHB2- /ErbB3 + cellepopulationen (fig 6C). P-H3 + -celler var sjældent dobbelt positive for EPHB2 og ErbB3 (5,6%) (fig 6C). Repræsentative billeder, der viser lokalisering af P-H3 + celler i EPHB2 + /ERBB3- cellepopulationen i 2 forskellige tumorer er vist i figur 6D og 6E.

For at undersøge den differentierede status EPHB2- /ErbB3 + celler i kolorektal cancer, væv blev tredobbelt farvet for MUC2, en markør for differentierede slimceller, ErbB3 og EPHB2. Interessant fleste MUC2 + kolorektal cancerceller var også EPHB2- /ErbB3 + (Fig 7A). Lignende observationer blev fundet i flere tumorer (Fig 7B og S6 Fig). Men en undergruppe af EPHB2- /ErbB3 + kræftceller var ikke positive for MUC2 i disse tumorer (Fig 7A og 7B, hvide pile). Desuden kolorektale tumorer, som ikke indeholdt nogen MUC2 + celler stadig havde en EPHB2- /ErbB3 + cellepopulation (data ikke vist).

Påvisning af EPHB2 (grøn), ErbB3 (rød) og MUC2 (grå) med co-immunfluorescens i to repræsentative kolorektale cancer prøver (DAPI, blå). Bemærk tilstedeværelsen af ​​EPHB2- /ErbB3 + celler (hvid pil), der er MUC2-. Scale bar, 50 um.

Samlet set viser disse data, at ErbB3 + kolorektal cancer celler er overvejende non proliferativ og differentieret, i modsætning til EPHB2 + celler.

Diskussion

for at definere, om ErbB3 signalering spiller en rolle i reguleringen af ​​kolorektal cancer stamceller, blev udtryk for ErbB3 og tarm stamceller markører undersøgt i flere kolorektale tumorer, herunder trin-adenomer tidlige og carcinomer (fase i-IV). Vi fandt signifikant forhøjelse af ErbB3 mRNA-niveauer i adenomer og tarmkræft sammenlignet med normale væv. Lignende resultater blev opnået for LGR5, EPHB2, CD44s og CD44v6 i overensstemmelse med tidligere undersøgelser. [4, 5, 8] Taget sammen antyder disse data, at ekspression af ErbB3 og stamcellemarkører er forhøjede gennem de progressive faser af carcinogenese. Mest interessant, vi bestemt, at ErbB3 og flere molekyler, som markerer stamceller populationer positivt korrelere på RNA-niveau i kolorektal cancer.

Dette fund fik os til at undersøge om ErbB3 var til stede i stamceller befolkning inden tumorer. Vi analyserede, om EPHB2, en defineret stamcelle markør, co-lokaliseret med ErbB3 udtryk i kolorektale kræft væv. Dette afslørede tre forskellige cancer delmængder baseret på i) berigelse af EPHB2 + -celler og manglende ErbB3 + celler, ii) fravær af EPHB2 + -celler eller iii) tilstedeværelsen af ​​både ErbB3 + og EPHB2 + cancer cellepopulationer. I senere delmængde, ErbB3 og EPHB2 markeret forskellige gensidigt udelukkende cellepopulationer med forskellige proliferative potentiale, at størstedelen af ​​ErbB3 + celler er ikke-proliferativ. Overraskende disse resultater viste, at selv om der var en positiv korrelation mellem ekspression af ErbB3 og EPHB2 på RNA-niveau, ikke disse to markører var til stede i de samme celler. Interessant ekspression af ErbB3 og EPHB2 i adskilte domæner blev detekteret i normale tyktarmsepitelet hvor EPHB2 mærkede stamceller og proliferative progenitorer ved krypten bunden og ErbB3 markerede non-proliferativ differentieret celle rum i toppen af ​​intestinale krypter. Vores resultater viser, at de fleste kolorektale cancere vi undersøgte ligner normalt væv med forskellige cellerum og proliferativ status og at et dobbelt EPHB2 /ErbB3 signatur kunne identificere tumorer med denne morfologi. Et lignende mønster af udtryk er blevet observeret i tarmkræft hjælp EPHB2 og cytokeratin 20 som en differentiering markør [8, 31]. Interessant, cytokeratin 20 ekspressionsniveauerne blev nedreguleret i kolorektale kræft væv i forhold til normale væv, i modsætning til ErbB3 i vores studier, der tyder på en mere kompleks rolle for ErbB3 [8]. Overensstemmelse med ekspressionen profilen af ​​ErbB3, ekspressionsniveauerne af PMEPA1, som er en markør for terminalt differentierede celler udelukkende findes på overfladen af ​​colon epithelial krypter, forøges i kolorektale tumorer sammenlignet med normale væv [32], hvilket antyder, at molekyler, der markerer differentieret cellepopulation kan også være forhøjet i nogle tilfælde under kolorektal carcinogenese.

Vores resultater viser, at målrette ErbB3 i kolorektal cancer ved hjælp af monoklonale antistoffer, der i øjeblikket er under udvikling [13], kan målrette differentierede celler og bidrage til eliminering af tumormasse, men kan ikke påvirke den proliferative cancer stamceller-lignende cellepopulation. Dette er endnu ikke eksperimentelt afprøvet. Ødelæggelsen af ​​differentierede colorektale cancerceller kan være gavnligt, da disse celler er for nylig blevet beskrevet som vigtig mediator af resistens over for behandling [33] og kan beskytte tumorfremkaldende celler fra kemoterapimidlet irinotecan grundet deres stof-udstødende kapacitet [33]. Det ville være interessant at definere, om differentieret cellepopulation beskrevet af Emmink

et al

. overlapper med ErbB3 + differentieret befolkning. Desuden kan disse ikke-proliferativ ErbB3 + celler stadig har en rolle at spille i løbet tumortilbagevenden da det er blevet rapporteret, at post-mitotiske tarmcellerne kan de-differentiere erhverve stamcelle lignende egenskaber og initiere tumorigenese i visse tilfælde [34].

Forhøjede niveauer af ErbB3 ekspression er blevet forbundet med nedsat patientoverlevelse i kolorektal cancer [20, 21]. Det synes afgørende at definere, om disse ErbB3 + celler er vigtige drivkræfter for carcinogenese, og om de virker ved at støtte den tilhørende stamcelle population eller direkte bidrager til et fald i patient overlevelse.

Sammenfattende vores resultater viser, at forhøjede udtryk af ErbB3 og tarm stamcelle markører er fælles træk ved tarmkræft og identificere tumorer, der indeholder differentierede ikke-proliferative cellepopulationer distinkte fra proliferative regioner, hvor cancerstamceller bor. Baseret på ekspressionen af ​​EPHB2 stamcellemarkør og ErbB3 differentiering markering, vi forsøgsvis foreslå, at kolorektale cancere er organiseret i i) stamceller-lignende celle beriget tumorer, ii) differentierede tumorer med en stilk-lignende cellekammer eller iii) mangler en EPHB2 stamceller rum.

Støtte Information

S1 fig. ErbB3 er overvejende placeret på membranen i adenokarcinomer.

Immunhistokemisk påvisning af ErbB3 i 7 kolorektal cancer prøver viser en overvejende stærk membran farvning (A-D) eller begge diffundere cytoplasmatisk og membran-farvning (E-G). Scale bar, 50 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0138336.s001

(TIF)

S2 Fig. ErbB3 er heterogent udtrykkes i kolorektale cancercellelinjer

(A):. Immunfluorescerende påvisning af ErbB3 (rød) i 6 forskellige cancercellelinjer modfarvet med DAPI (blå). (B): Ekspression af ErbB3 (grøn) og EPHB2 (rød) i LIM1215 og LIM1899 cancercellelinjer modfarvet med DAPI (blå). Scale bar, 50 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0138336.s002

(TIF)

S3 Fig. ErbB3 positive kolorektal cancer celler er overvejende ikke-proliferativ.

Co-immunfluorescent påvisning af KI-67 (grøn) og ErbB3 (rød) i to forskellige kolorektale cancer prøver modfarvet med DAPI (blå). Scale bar, 50 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0138336.s003

(TIF)

S4 Fig. ErbB3 positive colorektale cancerceller er hovedsageligt ikke proliferative i modsætning til EPHB2 positive celler.

Co-immunofluorescens påvisning af KI-67 (grøn), ErbB3 (rød, A, C, E) og EPHB2 (rød, B, D, F) i tre forskellige kolorektale cancer prøver, DAPI (blå). Scale bar, 50 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0138336.s004

(TIF)

S5 Fig. EPHB2 positive celler er KI-67 positive i normal human colon.

Co-immunofluorescens påvisning af EPHB2 (grøn) og KI-67 (rød) i normal colon væv (DAPI, blue). Bemærk fraværet af Ki-67 positive celler i differentierede rum (hvid pil). Scale bar, 50 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0138336.s005

(TIF)

S6 Fig.