PLoS ONE: Wogonin induceret Calreticulin /Annexin A1 Eksponering dikterer immunogenicitet af kræftceller i en PERK /AKT Dependent Manner

Abstrakt

Som reaktion på ioniserende stråling og visse kemoterapeutiske stoffer, døende tumorceller fremkalde en potent anticancer immunrespons. Imidlertid har den potentielle effekt af wogonin (5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone) om kræft immunogenicitet ikke undersøgt. Her demonstrerede vi for første gang, at wogonin fremkalder en potent antitumor immunitet effekt ved at inducere translokation af calreticulin (CRT) og Annexin A1 til celle plasmamembranen samt frigivelse af høj mobilitet gruppe protein 1 (HMGB1) og ATP. Signalveje, der er involveret i denne proces blev undersøgt. Vi fandt, at wogonin-induceret reaktive oxygenarter (ROS) produktion forårsager en endoplasmatisk reticulum (ER) stressrespons, herunder phosphorylering af PERK (PKR-lignende endoplasmatisk reticulum kinase) /PKR (protein kinase R) og eIF2α (eukaryot initieringsfaktor 2α ), der tjente som opstrøms signal til aktivering af phosphoinositid 3-kinase (PI3K) /AKT, overtalelse calreticulin (CRT) /Annexin A1 cellemembranen translokation. P22 /CHP, en Ca

2 + -bindende protein, var forbundet med CRT og var nødvendig for CRT translokation til cellemembranen. Udslip af HMGB1 og ATP fra wogonin behandlede MFC celler, alene eller sammen med andre mulige faktorer, aktiverede dendritiske celler og induceret cytokin udgivelser. In vivo bekræftede studiet, at immunisering med wogonin-forbehandlet tumorceller vaccination signifikant inhiberede homoplastic podet gastrisk tumorvækst i mus og en eventuel inflammatorisk reaktion var involveret. Konklusionen er, at aktiveringen af ​​PI3K pathway fremkaldt af ER stress induceret CRT /Annexin A1 translokation ( “spis mig” signal) og HMGB1 frigivelse, mægle wogonin-induceret immunitet tumor celle vaccine. Dette indikerede, at wogonin er en hidtil ukendt effektiv kandidat for immunterapi mod gastrisk tumor

Henvisning:. Yang Y, Li X-J, Chen Z, Zhu X-X, Wang J, Zhang L-b, et al. (2012) Wogonin induceret Calreticulin /Annexin A1 Eksponering dikterer immunogenicitet af kræftceller i en PERK /AKT måde. PLoS ONE 7 (12): e50811. doi: 10,1371 /journal.pone.0050811

Redaktør: Marc Tjwa, University of Frankfurt – University Hospital Frankfurt, Tyskland

Modtaget: Januar 20, 2011; Accepteret: 29 Okt 2012; Udgivet: 12. december, 2012 |

Copyright: © 2012 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 91.129.731 og 81.072.661), Project Program of State Key Laboratory of Natural Medicines, Kina Farmaceutiske Universitet (nr JKGZ201102) New Century Fremragende Talents Program for Dr. Yong Yang understøttes af Undervisningsministeriet Kina (NCET-09-0771), grundforskning Midler til de centraleuropæiske universiteter (No. JKZ2009006), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (nr BK2012025 og BK2011632), og “Major Drug Discovery” videnskab og teknologi større projekter i Kina (nr 2011ZX09102-001-20). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

traditionelle kræftbehandling metoder omfatter kirurgi, strålebehandling, kemoterapi, og for nogle kræftformer, hormonbehandling. Selvom fordelene opnås ved mange patienter, er de sjældent helbredende for de meget få tilbageværende disseminerede tumorceller, den primære dødsårsag blandt kræftpatienter. En vigtig grund til, at tumorerne ikke kontrolleres af immunsystemet er at den lave immunogenicitet. Anvendelsen af ​​cancervacciner at fremkalde et terapeutisk antitumor immunrespons mod velovervejet udvalgte tumorantigener udtrykt i tumorcellerne kan opsøge og dræbe disseminerede tumorceller. En mulig strategi for at opnå dette indebærer immunisering med tumorceller, der er blevet behandlet med en særlig klasse af kemoterapeutiske lægemidler.

mere tyder, at flere kemoterapeutiske stoffer (herunder antracykliner og oxaliplatin), og ioniserende stråling (f.eks γ -stråler og ultraviolet C (UVC) lys) inducerer immunogene cancercelledød [1], [2]. Det blev foreslået, at de har kapacitet til at drive calreticulin (CRT) translokation til tumorcelleoverfladen, der fungerer som en “spise mig” signal, identificeres ved dendritiske celler (DC’er), hvilket resulterer i antitumor T-celle respons [3]. Elementerne i vejen medierende pre-apoptotisk CRT eksponering indebærer en pulje af CRT, der passeres Golgi apparat og udskilles af SNARE-afhængig exocytose [4].

HMGB1 (høj mobilitet gruppe protein 1), en nuklear protein, der frigives fra døende celle, er liganden af ​​Toll-lignende receptor 4 (TLR4) [1]. Udtømning af HMGB1 fra døende tumorceller afskaffer TLR4-afhængige, DC-medieret præsentation af antigener fra døende tumorceller in vitro og in vivo [1]. Så er HMGB1 frigivelse kræves til immunogeniciteten af ​​celledød via sin virkning på TLR4. hverken HMGB1 eller CRT (eller en kombination af begge), kan imidlertid fremme fuldstændig DC’er modning, hvilket indikerer, at søgningen efter immunstimulerende molekyler produceret af døende celler skal fortsættes [5].

Wogonin (5,7 dihydroxy-8-methoxyflavone), en aktiv komponent isoleret fra

Scutellaria baicalensis

radix, blev rapporteret at have signifikante anticancer aktiviteter ved at inducere celledifferentiering, apoptose og cellecyklusstop [6] – [8]. I denne undersøgelse testede vi, om wogonin, ligesom nogle kemoterapeutiske lægemidler nævnt ovenfor, er i stand til at inducere immunogen cancercelledød, og hvis ja, blev de mulige signalveje, der er involveret i denne proces evalueret. Vi fandt for første gang, at wogonin fremkalder en potent antitumor immunitet virkning ved at inducere translokation af CRT og Annexin A1 til celle plasmamembran, samt frigivelse af HMGB1 og ATP. Vi fandt, at endoplasmatisk reticulum (ER) stressrespons, herunder PERK (PKR-lignende endoplasmatisk reticulum kinase) /PKR (protein kinase R) og eIF2α (eukaryot initieringsfaktor 2α underenhed) phosphorylering og efterfølgende aktivering af PI3K /AKT signalvej er involvere i denne proces.

Materialer og metoder

Etik Statement

alle dyr blev holdt i specifikke patogenfrie betingelser, og alle forsøg blev udført i overensstemmelse med Federation of European Laboratory Animal Science Association retningslinjer. Den etiske komité i Kina Farmaceutiske Universitet godkendt alle de dyreforsøg (tilladelse tal: SYXK2007-0025).

Kemikalier og reagenser

Wogonin blev anvendt i DMSO til 10 mM og opbevaret ved -20 ° C. Doxorubicin, Rapamycin, LY294002, AKT-inhibitor X (akti) blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA). EGFR, ERK1 /2, Akt1 /2, Ku 80, gede anti-kanin IgG-HRP og gede-anti-muse-IgG-HRP-antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). N-acetyl-cystein (NAC) og monoklonalt muse-anti-β-actin blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO). p-PERK (Thr980), PERK, p-eIF2-α (Ser51), eIF2-α, p-PKR (Thr446 /451), PKR, p-AKT (Ser 473), p-AKT (Thr 308), Annexin A1, s-S6K (Thr389), p-4E-BP1 (Ser 65), S6K, 4E-BP1, p-GSK3p (Ser 9), p-S6 (S235 /236), p-ERK (Thr202 /Tyr204) , p-JNK (Thr183 /Tyr185) og p-p38 (Thr 180 /Tyr182) antistoffer blev købt fra Cell Signaling Technology (bevery, MA).

Celler kultur

primære dyrkede mus monocyt -afledt dendritiske celler (MoDCs) var fra B6 mus knoglemarv, som opbevares i et MEM-medium (Sigma, St. Louis, MO) suppleret med 10% FBS plus GM-CSF (50 ng /ml). Til Western blot-analyse blev celler podet i 6-brønds plader ved en densitet på 2 x 10

5 celler /ml med frisk komplet dyrkningsmedium. Den menneskelige gastrisk karcinom MKN-45 celler, mus gastrisk karcinom MFC celler afledt fra 615 mus (Militære Medical Sciences, Beijing), WT og Akt1 /2 Dobbelt Knockout MEF’er (købt fra Shanghai celle bank, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) blev holdt i et DMEM-medium (Sigma, St. Louis, MO) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA), penicillin /streptomycin (1:100, Sigma, St. Louis, MO) og 4 mM L-glutamin (Sigma, St. Louis, MO), i en CO

2 inkubator ved 37 ° C.

todimensional gelelektroforese og protein identifikation ved massespektrometri

metoderne blev refereret til den tidligere undersøgelse [9]. Kort fortalt Isoelektrisk fokusering (IEF) blev udført på en Ettan IPGphor II (Amersham Bioscience) med 24-cm immobiliserede pH gradient strimler (pH 3-10; Amersham Bioscience). Geler (tre gentagelser af hver) blev sølvfarvet ifølge publicerede procedurer og scannet under anvendelse af et Atrix scanning 1010 plus (Microtek, Taiwan, Kina), og resulterende billeder blev analyseret under anvendelse af Image Master 2D Platinum software (Amersham Bioscience) for spot påvisning, kvantificering, og sammenligningstal og statistiske analyser. Fundne pletter og fire kontrol pletter i nonstained gel områder blev fjernet (ca. 1 mm

3 terninger) fra geler farvet med Coomassie Brilliant Blue. Prøve forberedelse til matrix-assisteret laser desorption /ionisering tid-of-flight (MALDI-TOF).

dobbelt eller tredobbelt-Label Immunofluorescens konfokalmikroskopi

MFC celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd og forarbejdet til immunofluorescens, som tidligere beskrevet [10], bortset fra at Cy5-, fluorescein isothiocyanate- og /eller tetramethylrhodamin B isothiocyanat-mærket sekundære antistoffer (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) blev anvendt. Derefter blev cellerne vasket kortvarigt i PBS og monteret på objektglas ved anvendelse forlænge antifade kit monterings reagens (Molecular Probes). Celler blev visualiseret med et Axiovert S100 inverteret mikroskop (Carl Zeiss) koblet til en udskå konfokal enhed (Atto Bioscience, Rockville, MD) og Hg damp lyskilde. Billeder blev indsamlet ved hjælp Openlab softwareversion 3.0.9 (Improvision, Lexington, MA) med en ORCA-ER digitalkamera (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan) og filtersæt til fluoresceinisothiocyanat (484 nm), tetramethylrhodamin B isothiocyanat (555 nm ), og Cy5 (650). Billedanalyse af konfokale billeder blev udført ved hjælp af Adobe Photoshop 5.5. For at muliggøre sammenligninger intensitet, vi brugte lignende forhold til at indsamle og manipulere billeder i hvert forsøg.

Western blots

Som nævnt før [11], 30 ug protein fra hver angivne behandlinger blev adskilt af 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA). Efter blokering med 10% mælk i 30 minutter blev membraner inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Antistofbinding blev påvist med den forøget kemiluminescens (ECL) detektionssystem. Western blots resultater blev kvantificeret af Image J software.

Biotinylering af MFC celleoverfladeproteiner

Biotinylering og nyttiggørelse af celleoverfladeproteiner blev udført med en fremgangsmåde tilpasset fra reference [1]. Kort fortalt 15 × 10

6 MFC-celler blev anbragt på is og vasket tre gange med iskold PBS-Ca

2 + -Mg

2+ (PBS med 0,1 mM CaCl

2 og 1 mM MgCl

2). Membranproteiner blev derefter biotinyleret ved en 30-minutters inkubering ved 4 ° C med NHS-SS-biotin 1,5 mg /ml (Pierce) frisk fortyndet i biotinylering buffer (10 mM triethanolamin, 2 mM CaCl

2, 150 mM NaCl, pH 7,5) med forsigtig omrøring. MFC-celler blev skyllet med PBS-Ca

2 + -Mg

2+ + glycin (100 mM) og vasket i denne puffer i 20 min ved 4 ° C for at standse uomsat biotin. Cellerne blev derefter skyllet to gange med PBS-Ca

2 + -Mg

2+, skrabet i kold PBS, og pelleteret ved 3.000 rpm ved 4 ° C. Pelleterne blev solubiliseret i 45 minutter i 600 pi lysisbuffer (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7,5) indeholdende proteaseinhibitorer. Lysaterne blev klaret ved centrifugering ved 14.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanterne blev inkuberet natten over med pakkede streptavidin-agarose-perler til at inddrive biotinylerede proteiner. Perlerne blev derefter pelleteret ved centrifugering, og portioner af supernatanter blev taget til at repræsentere det ubundne, intracellulære pool af proteiner. Biotinylerede proteiner blev elueret fra perlerne ved opvarmning til 100 ° C i 5 minutter i SDS-PAGE-prøvebuffer før de anbringes på en 10% SDS-PAGE-gel. For at sikre fravær af lækage af biotin i cellerne, vi kontrolleres systematisk fravær af det intracellulære protein actin i biotinylerede ekstrakter.

Immunopræcipitation (IP)

Som nævnt før [11], celler behandlet efter passende stimuli blev lyseret med lyseringsbuffer, 200 mM NaCl (pH 7,4), 1% Triton X-100, 10% glycerol, 0,3 mM EDTA, 0,2 mM Na3VO4, og proteasehæmmere cocktails (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) . Alikvoter på 600 ug af proteiner fra hver prøve blev klaret ved inkubation med 20 pi protein A /G Sepharose (perler) (Amersham, IL) i 1 time ved 4 ° C. -Klaret prøverne blev inkuberet med anti-Calreticulin (CRT) Antibody (cs-2891, Cell Signaling Tech), eller anti-DNA-PKcs (sc-9051, Santa Cruz antistoffer) i lysepuffer natten over ved 4 ° C. 30 pi protein A /G-perler blev tilsat, og prøverne blev inkuberet i 2 timer ved 4 ° C. Perlerne blev vasket fem gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og en gang med lysepuffer, kogt, adskilt af 10% SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran efterfulgt af Western blotting-analyse som beskrevet ovenfor.

CRT-Konfokal immun-fluorescens

Cancer celler med indicerede behandling blev fikseret og blokeret med 10% BSA i PBS i 30 min ved stuetemperatur og derefter inkuberet med 1:100 kanin-anti-calreticulin (CRT) Antibody ( cs-2891, Cell Signaling Tech) i 1 time (afprøvning CRT translokation) efterfulgt af FITC-anti-kanin sekundært antistof (Cell Signaling Tech, MA) ved 1:100 i 30 minutter og CRT immun-fluorescens blev observeret i en konfokal mikroskopi (Leica TCS SMD FCS, Leica, Tyskland), Hoechst 33342 blev brugt til at farve den nukleare.

Små interfererende RNA (siRNA) knockdown undersøgelser

Som beskrevet før [11], siRNA for PERK (sc-36214) blev DNA-PKcs (sc-35200) eller p22 (sc-142.330) indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Cancerceller blev dyrket i et komplet medium, der ikke indeholdt antibiotika i 4 dage. Celler blev podet i en 6-brønds plade 1 dag før transfektion og dyrket til 60% konfluens den følgende dag. For RNAi eksperimenter, 6,25 pi Lipofectamine ™ LTX sammen 2,5 pi PLUS ™ Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) blev fortyndet i 90 pi DMEM i 5 minutter i stuetemperatur. Derefter blev 10 pi siRNA (20 uM) blandet med DMEM indeholdende Lipofectamine sammen med PLUS reagens og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur i kompleksdannelse. Endelig komplekset blev tilsat til brøndene indeholdende 2 ml medium med 100 nM endelig siRNA koncentration. P22 (ab56953, Abcam) eller PERK (sc-13073, Santa Cruz) proteinekspression blev bestemt ved Western blot 48 timer efter transfektion.

Reaktive Oxygen Species (ROS) afsløring

Som beskrevet før [11], cancerceller blev præinstalleret med 1 uM af fluorescerende farvestof dihydrorhodamin (DHR) (Invitrogen, Carlsbad, CA) to timer før angivne behandlinger, som reagerer med ROS i celler og resulterer i en ændring af fluorescens. Efter at være blevet behandlet med angivne behandlinger blev cancerceller trypsiniseret, suspenderet i iskold PBS og fikseret i 70% ethylalkohol i -20 ° C. Ændringerne i fluorescens i lægemiddelbehandlede celler blev kvantificeret ved FACS-analyse. Induktion af ROS-generering blev udtrykt i arbitrære enheder. ROS produktion blev også påvist ved at visualisere dihydrorhodamin (DHR) fluorescens under konfokal immun-fluorescens mikroskopi.

Måling af ekstracellulære ATP niveauer

ATP-syntese blev målt i MFC celler under de forskellige behandling af wogonin. I sextuplicates, 5 × 10

3-celler blev dyrket i hver brønd i en plade med 96 brønde. Efter inkubation ved 37 ° C i 24 timer blev mængden af ​​ATP i supernatanten målt ved anvendelse af Molecular Probes ‘ATP Bestemmelse Kit (Kaiji, Nanjing) ifølge producentens anvisninger. Dette kit er baseret på bioluminescens påvisning af ATP, ved anvendelse af rekombinant ildflueluciferase og dets substrat, luciferin. Samlede kemiluminescens blev opsamlet ved et luminometer. Mængden af ​​ATP fra en testopløsning blev kvantificeret ved sammenligning med en kalibreringskurve ved hjælp ATP som standard

Cytokine Kvantificering

MFC cancerceller blev behandlet med angivne behandlinger for 36 timer.; supernatant prøver blev indsamlet og vurderet for HMGB1 anvendelse af ELISA kits (Shino-Test Corporation, ST51011) i henhold til protokollen. For cytokinfrigivelse, blev MoDCs behandlet med supernatant af MFC-celler i 24 timer blev supernatanten af ​​MoDCs opsamlet og vurderet for IL-6 (Mouse IL-6 ELISA Kit, BD OptEIA, 550.950) og TNF-α (Mouse TNF-a-ELISA Kit, BD OptEIA, 560.478) i henhold til deres protokoller.

In vivo anti-tumor celle vaccination eksperiment

3 × 10

6 MFC celler, suspenderet i 200 ml PBS, enten til venstre ubehandlet eller behandlet med wogonin (100 uM) i 4 timer. Wogonin behandlede MFC-celler blev inokuleret subkutant i den nedre flanke af 6 uger gamle hun 615 mus (Military Medical Sciences, Beijing), hvorimod 5 × 10

5 ubehandlede celler blev inokuleret i den kontralaterale flanke 7 dage senere som beskrevet i tidligere undersøgelse [1].

fagocytose assay

fagocytose assay blev udført som tidligere beskrevet [12]. MoDCs blev indstillet til 2,5 × 10

4cells /ml i DMEM-medium og dyrket i plader med 24 brønde ved 37 ° C og 5% CO2. De fik lov til at klæbe i 24 timer, på hvilket tidspunkt cellerne blev mærket med 4 pM PKH26. Vi forberedt MFC-celler, der enten var ubehandlede eller behandlet med forskellige koncentrationer af wogonin (50, 100 og 200 uM) i 2 timer. Efter MoDCs vasket med koldt PBS i tre gange, blev MFC celler mærket med 0,5 pM CFSE tilsat til plader med 24 brønde for fagocytose assays. Efter 15 minutter ved 37 ° C blev fagocytose observeret af Leica DFC 450C software, ved hjælp af ImageJ1.38 billedbehandling og analysesoftware beregne procentdelen af ​​MoDCs der opslugte mindst en tumorcelle i mindst 100 celler.

Statistisk analyse

værdierne i figurerne er udtrykt som middel ± standardafvigelse (SD). Tallene i denne undersøgelse var repræsentanter for mere end 3 forskellige eksperimenter. Statistisk analyse af dataene mellem kontrol og behandlede grupper blev udført ved en Student t-test. Værdier af p. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Wogonin induceret calreticulin (CRT) translokation til celleoverfladen membran er afhængig af PERK og PI3K /AKT

tidligere undersøgelser har vist, at en ekstern forsyning af signaler, der inducerer eksponering calreticulin (CRT) plasmamembranen, der optræder som en “spise mig” signalering, som giver immunogenicitet til ellers ikke-immunogene celledød, der giver mulighed for en optimal kemoterapi mod cancer [1]. Næste vi testede, om wogonin også kunne opføre sig på samme måde i MFC cancerceller. Som du kan se i fig. 1A, wogonin (100 um) inducerede kraftig CRT celleoverfladen translokation i MFC kræftceller i som påvist ved Western blots test celleoverfladen CRT. Blandt de signalveje, der regulerer CRT translokation og tilsvarende immunogen celledød /apoptose, er det nu veletableret, at præ-apoptotisk ER stress og phosphoryleringen af ​​den eukaryote translationsinitiering faktor 2α (eIF2α) og opstrøms signal kinase protein kinase R-lignende endoplasmatiske reticulum kinase (PERK) er de vigtigste [13]. Den phosphorylering af eIF2α af PERK anterograd transport af CRT fra ER til Golgi-apparatet og exocytose af CRT-holdige vesikler, sidst resulterer i CRT translokation på plasmamembranen overflade, der tjener som nøgle “spise-me” signal [1 ], [4], [14] – [17]. Her fandt vi, at knockdown PERK af mål siRNA stort set hæmmet CRT translokation ved wogonin (fig. 1A), hvilket indikerer mulig inddragelse af PERK og ER stress i denne proces. Overraskende PI3K /AKT hæmning af enten farmakologisk inhibitor (LY 294002 og AKT-inhibitor X) eller genetisk knockdown (ved hjælp Akt1 /2 dobbelt knockout MEF) også i vid udstrækning hæmmet CRT translokation (fig. 1B-D), virkningen af ​​AKT hæmning på wogonin induceret CRT translokation blev også bekræftet ved immun-fluorescens konfokal assay som vist i fig. 1C. Tilsammen, fandt vi, at wogonin inducerer CRT translokation til celle plasma overflade, kan PERK og PI3K /AKT blive inddraget i denne proces.

Gastrisk karcinom cellelinje MFC celler blev transficeret med scramble siRNA (Ctrl, 200 nM) eller PERK siRNA (200 nM), efter 48 timer, ekspressionsniveauet af PERK blev detekteret ved Western blots for at verificere PERK niveau efter siRNA behandling. Succesfuld kvikke Knockdown celler og kontrolprøver celler (Ctrl siRNA behandlede celler) blev behandlet med wogonin (100 uM) for 2 og 4 timer. Celleoverfladeproteiner i fraktion plasmamembranen var end biotinyleret og testet for CRT, EGFR og actin. Samlede cellelysat blev også opnået at teste CRT, PERK og actin (A). MFC-celler blev forbehandlet med AKT specifik inhibitor X (AKTI 100 nM) eller PI3K /AKT-inhibitor LY294002 (100 nM) i 2 timer, efterfulgt af wogonin (100 uM) behandlet i 2 og 4 timer, CRT, EGFR og actin i plasmaet membranproteinfraktion blev påvist ved Western blots. CRT, p-AKT (Ser 473), Akt1 /2 og actin i alt cellelysat blev også detekteret ved Western blots (B) .crt translokation til celleoverfladen efter wogonin behandling blev også bekræftet ved konfokal immun-fluorescensmikroskopi translokationen var inhiberet af Akt inhibitor X (AKTI 100 nM), doxorubicin (Dox, 1 uM, 2 hrs behandling) blev anvendt her som positive kontroller. (C). WT og Akt1 /2 dobbelt knockout MEF’er blev behandlet med wogonin (100 uM) i 4 timer; CRT, EGFR og actin i proteinfraktionen plasmamembranen blev påvist ved Western blots. P-S6 (S235 /236), p-AKT (S473), Akt1 /2, CRT og actin i helcellelysat blev detekteret ved Western blots (D). Forsøg i denne figur blev gentaget mindst 3 gange og lignende resultater blev opnået. Bar = 10 um.

Wogonin inducerer ROS afhængig ER stress respons, overskæring som opstrøms signal til aktivering af PI3K /AKT-vejen

Som vi diskuterede ovenfor, vores nuværende data tyder på, at at wogonin induceret CRT translokation, og PERK og PI3K /AKT-vejen kan være involveret i denne proces. Næste vi forsøgte at dissekere denne signal vej. Som vist i fig. 2A, wogonin (100 uM) inducerede en indlysende PI3K /AKT-aktivering i MFC-celler på kort tid (op til 2 timer); interessant AKT-aktivering blev nedreguleret efter langvarig eksponering af wogonin (fig. 2A og B). Samtidig, eksponering af wogonin inducerede også en indlysende ER respons som vist ved den stærke phosphorylering af ER stressproteiner (PERK, PKR og eIF2α) i wogonin behandlet MFC-celler (fig. 2C). PERK siRNA knockdown, som har vist sig at inhibere CRT translokation (fig. 1A), stort set inhiberede wogonin induceret phosphorylering af eIF2α og PI3K /AKT aktivering i MFC-celler (fig. 2D og E), hvilket indikerer, at PERK tjener som opstrøms signal for wogonin inducerede PI3K /AKT-signalering. Ved at forsøge at identificere den opstrøms signal for wogonin induceret ER stress og PERK phosphorylering, fandt vi, at en betydelig ROS-produktion (fig. 2F og G), PERK /PKR-phosphorylering og PI3K /AKT /mTORC1 aktivering udløst af wogonin blev stort set inhiberet af anti oxidant N-acetyl-cystein (NAC) (fig. 2G-H). Baseret på dette, foreslår vi, at ROS modificerer ER proteiner og fremkalde ER stress respons, hvilket resulterer i PERK /PKR mægle eIF2α phosphorylering og efterfølgende PI3K /AKT aktivering, som dirigerer CRT translokation og en mulig “spise-mig” -signal.

Gastrisk carcinom cellelinje MFC-celler blev behandlet med wogonin (100 uM) for angivne tidspunkter blev AKT og nedstrøms mTORC1 aktivering detekteret ved Western blots ved anvendelse viste antistoffer, Akt1 /2, S6K, S6 og β-actin blev også testet som ligeværdige loadings (A). AKT phosphorylering blev kvantificeret ved hjælp af billede J softwaren efter normaliseret til Akt1 /2 (B). Bemærk at Wogonin inducerede en tidlig aktivering men senere inhibering af AKT. MFC-celler blev behandlet med wogonin (100 uM) for angivne tidspunkter, p-PERK (Thr980), p-eIF2-α (Ser51), p-PKR (Thr446 /451), deres tilsvarende ikke-phospho-proteiner og Akt1 /2 blev påvist ved Western blots (C). MFC-celler blev transficeret med PERK siRNA i 48 timer, lykkedes transficerede celler (bekræftet ved Western blot) behandlet med wogonin (100 uM) i 1 time, p-PERK (Thr980), p-eIF2-α (Ser51), p- AKT (Ser 473), p-4E-BP1 (Ser 65), PERK, deres tilsvarende ikke-phospho-proteiner og β-actin blev detekteret ved Western blots (D), AKT phosphorylering blev kvantificeret under anvendelse Billede J software efter normaliseret til Akt1 /2 (E). MFC Celler blev forbehandlet med anti-oxidant N-acetyl-cystein (NAC, 400 uM) i 2 timer, efterfulgt af wogonin (100 uM) behandling i 30 minutter, blev ROS produktion detekteret ved både fluorescens (F) og FACS ( G) assay henholdsvis som beskrevet ovenfor. MFC Celler blev forbehandlet med anti-oxidant N-acetyl-cystein (NAC, 400 uM) i 2 timer, efterfulgt af wogonin (100 uM) i 30 og 60 minutter, p-PERK (Thr980), p-PKR (Thr446 /451), p-4E-BP1 (Ser 65), p-AKT (Ser 473) og deres tilsvarende ikke-phospho-proteiner blev detekteret ved Western blots (H). Forsøg i denne figur blev gentaget mindst 3 gange og lignende resultater blev opnået.

#

P

0,05 vs. Kontrol siRNA gruppe. *

P

0,05 vs. gruppe uden NAC forbehandling. Bar = 10 um.

DNA-PKcs, danner et kompleks med PERK, medierer AKT aktivering af Wogonin

Vi næste forsøgt at identificere den mellemliggende spiller AKT aktivering ved PERK af fokus på DNA-PKcs, en nyligt opdaget PI3K medlem, der kan aktivere AKT [18] – [20]. DNA-PK er sammensat af en 470-kDa katalytisk subunit (DNA-PKcs) og Ku antigen-kompleks (Ku80 /Ku70) og involveret i V (D) J rekombination, reparation af DNA dobbelt-strengbrud ved ikke-homolog ende sammenføjning, apoptose, og transskription regulering [21] .Significantly, nu er det velkendt, at DNA-PKcs, som et medlem af PI3K familien, også regulerer AKT fosforylering [22]. Derudover er der etableret en rolle for DNA-PK i aktiveringen af ​​AKT af CpG-DNA under anvendelse knoglemarvafledte makrofager [23]. Desuden Bozulic et al. indikerede, at DNA-PK phosphorylerer AKT efter induktion af DNA dobbelt-strengbrud [19]. Også, at kravet om DNA-PK phosphorylerer AKT som reaktion på ioniserende stråling blev også etableret in vivo [19]. Så næste, vi testede den mulige involvering af DNA-PKcs i wogonin induceret AKT fosforylering. En lille molekylær hæmmer af DNA-PKcs, Nu7062, blev specifikt anvendes her til at hæmme DNA-PKcs aktivitet. I celler forbehandlet med Nu7026 blev wogonin-induceret AKT fosforylering næsten totalt afskaffet (fig. 3A). Disse resultater understøttes vores hypotese, at DNA-PKcs kan være nøglen indbyrdes medierer for wogonin induceret AKT aktivering. For at teste dette yderligere, blev specifikke siRNA mod DNA-PKcs anvendes her til at knockdown DNA-PKcs. I fuld støtte fra vores data fra NU7026 studier blev AKT fosforylering på både Ser473 og Thr308 stort set forringes wogonin behandlede celler forarmet af DNA-PKcs (fig. 3B). Vigtigt er det, fandt vi, at DNA-PKcs, AKT og PERK danner et kompleks i Wogonin behandlede celler, som er vendt ved forbehandling med DNA-PKcs korrosionsinhibitor Nu 7062 (fig. 3C), baseret på disse oplysninger, foreslår vi, at DNA- PKcs, danner et kompleks med PERK, medierer AKT aktivering ved wogonin. den detaljerede mekanisme, ved hvilken DNA-PKcs phosphorylerer dog AKT i wogonin behandlede celler kræver yderligere undersøgelse.

Gastrisk carcinom cellelinje MFC Celler blev forbehandlet med en DNA-PKcs inhibitor (Nu 7062, 10 uM) for 2 time efterfulgt af wogonin (100 uM) behandling for 1 og 2 timer blev AKT phosphorylering detekteret ved Western blot og DNA-PKcs og Akt1 /2 blev påvist som lige loadings (A). MCF-7 celler blev transficeret med scramble (Ctrl, 200 nM) eller DNA-PKcs (200 nM) i 48 timer ved anvendelse af transfektionsfremgangsmåder motioned ovenfor, blev vellykket transficerede celler anvendes til prøvning AKT signalering i wogonin behandlet MFC-celler (B). MFC Celler blev forbehandlet med en DNA-PKcs inhibitor (Nu 7062, 10 uM) i 2 timer, efterfulgt af wogonin (100 uM) behandling i 1 time blev de klaret 600-ug alikvoter af cellelysater inkuberet med anti-DNA -PKcs, efterfulgt af Western blotting-analyse med anti-DNA-PKcs, AKT, PERK, Ku80, IgG og β-actin henholdsvis (C). Forsøg i denne figur blev gentaget mindst 3 gange og lignende resultater blev opnået.

* P 0,05 vs. gruppe uden Nu7062,

* P. 0,05 vs. gruppe uden DNA-PKcs knockdown

identificere Annexin A1 og p22 som mulige mål for wogonin

for yderligere at identificere mulige mål af wogonin blev en todimensional (2D) gelelektroforese plus massespektrometri proteinanalyse anvendes her. Vi forberedt helcelleproteiner fra Gastrisk carcinomacellelinie MKN-45-celler, der enten var ubehandlede eller behandlet med forskellige koncentrationer af wogonin (50, 100 og 200 uM) i 24 timer. Sammenligning af todimensionale (2D) elektroforese, efterfulgt af massespektroskopisk analyse, førte til identifikation af HMGB1 (høj mobilitet gruppe protein 1), p22 og Annexin A1 som proteiner, der var stærkt induceret ved wogonin behandling på en dosisafhængig måde ( fig. 4A og B). Annexin A1 er den første karakteriserede medlem af annexin familie af proteiner i stand til at binde (dvs. at annektere) til cellulære membraner i en calcium-afhængig måde. Oprindeligt beskrevet som en phospholipase A2 (PLA2) -inhibitory protein, kan Annexin A1 påvirke mange komponenter af den inflammatoriske reaktion udover metabolismen af ​​arachidonsyre [24], [25]. Interessant nok har Annexin A1 nylig blevet impliceret i apoptotiske celle “æde mig” signal og efterfølgende fagocytose, og beviser at akkumulere til at støtte en rolle i løsningen fase af inflammation. En afhandling af Arur et al. elegant demonstreret, at Annexin A1 kunne tjene som en endogen phosphatidylserin (PS) ligand [26], der medierer engulfment af apoptotiske celler. Annexin A1 rekrutteres til PS-rige region celleoverfladen og medierer “spise-mig” signal og slip cellulære calcium [26]. Som vist i fig.