PLoS ONE: Overekspression af Kpnβ1 og Kpnα2 Importin Proteiner i Cancer stammer fra dereguleret E2F Activity

Abstrakt

Karyopherin omfatter overfamilien transportproteiner nukleare, der er involveret i shuttling af visse lastproteiner ind og ud af kernen. Karyopherin β1 (Kpnβ1) og Karyopherin α2 (Kpnα2) er importin proteiner, der arbejder sammen for at transportere deres gods ind i kernen. Vi har tidligere identificeret forøget ekspression af Kpnβ1 og Kpnα2 i cervikale tumorer sammenlignet med normale epitel og i transformerede celler i forhold til deres normale modstykker. Denne undersøgelse derfor til formål at identificere de reguleringsmekanismer transskription forbundet med høje Kpnβ1 og Kpnα2 niveauer i kræftceller. Kpnβ1 (-2013 til +100) og Kpnα2 (-1900 til 69) promoter fragmenter blev separat klonet ind i reporter vektor, pGL3, grundlæggende og luciferaseassays afslørede både som betydeligt mere aktive i kræft og transformerede celler i forhold til det normale. En række deletionskonstruktioner identificeret de -637 til -271 Kpnβ1 og -180 til -24 Kpnα2 promotorområder som ansvarlig for den differentierede promoter aktivitet og en række højt konserverede E2F bindingssteder blev identificeret inden for disse regioner. Mutation analyse bekræftede kravet om E2F sites for promotor-aktivitet, og chip analyse bekræftede E2F2 /DP1 binding til Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere

in vivo

. DP1 inhibering resulterede i reducerede niveauer af de respektive proteiner, hvilket bekræfter betydningen af ​​E2F i overekspression af Kpnβ1 og Kpnα2 proteiner i cancer. E2F virkning er kendt for deregulering i cervicale cancerceller skyldes hæmning af dens repressor, Rb, HPV E7. Hæmningen af ​​E7 hjælp siRNA resulterede i reducerede Kpnβ1 og Kpnα2 promoter aktiviteter, som gjorde overekspression af Rb. Afslutningsvis denne undersøgelse er en første til at vise, at forhøjede Kpnβ1 og Kpnα2 udtryk i cancerceller korrelerer med ændret transkriptionel regulering forbundet med deregulerede E2F /Rb aktiviteter

Henvisning: van der Watt PJ, Ngarande E, slankere VD ( 2011) Overekspression af Kpnβ1 og Kpnα2 Importin Proteiner i Cancer stammer fra dereguleret E2F aktivitet. PLoS ONE 6 (11): e27723. doi: 10,1371 /journal.pone.0027723

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 13. oktober 2011; Accepteret: 23. oktober 2011; Udgivet: November 18, 2011

Copyright: © 2011 van der Watt et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra University of Cape Town, Carnegie Corporation of New York, CANSA, og Medical Research Council (SA). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dette arbejde blev støttet af University of Cape Town /Carnegie Corporation i New York Development tilskud, CANSA, og Medical Research Council (SA). Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Karyopherin proteiner er opløselige nukleare transport receptorer, der fungerer i transport af fragt proteiner og visse RNA ind og ud af cellekernen, via kerneporen kompleks (NPC) [1]. Karyopherins kan fungere som importins af exportins, afhængigt af deres retning transport. Karyopherin beta 1 (Kpnβ1, også kendt som Importin β eller p97) er en importin protein, der spiller en central rolle i den nukleare proces import. Nuklear import via Kpnβ1 kan ske enten ved Kpnβ1 fungerer som en selvstændig nuklear transport receptor, eller gennem sit samarbejde med en adapter protein, ligesom Karyopherin alfa (Kpnα, også kendt som Importin α), i hvilket tilfælde importen er kendt som klassisk nukleare import [2]. I den klassiske kerneimportvej er kernelokaliseringssekvens (NLS) til stede i lasten genkendes og bindes af adapteren protein, Kpnα, som derefter danner en trimer kompleks med Kpnβ1. Lasten: Kpnα: Kpnβ1 komplekset transporteres over den nukleare pore kompleks til kernen, hvor over det dissocieres ved bindingen af ​​RanGTP. Der er seks Kpnα isoformer (Kpnα1-6), som er blevet bestemt til at have præferentiel binding til specifikke substrater [3]. Funktionen af ​​alle seks isoformer udvider dermed underlaget interval transporteres tværs over NPC.

Vi har for nylig vist, at ekspressionen af ​​Kpnβ1 og Kpnα protein, Kpnα2, er forhøjet i livmoderhalskræft og transformerede celler ved både mRNA og proteinniveauer [4]. Vi fandt også, at hæmning af Kpnβ1 udtryk i livmoderhalskræft celler fører til celledød via apoptose, hvilket tyder på, at livmoderhalskræft celler bliver funktionelt afhængige Kpnβ1 overekspression, fremhæver betydningen af ​​Kpnβ1 opregulering i at bevare kræft biologi. I vores undersøgelse havde Kpnα2 hæmning ingen effekt på livmoderhalskræft celle levedygtighed [4]; Det er muligt, at dets hæmning resulterede i funktionel erstatning af andre Kpnα familiemedlemmer. Noetzel et al. [5] viste, at brystkræftceller undergik apoptotisk celledød, når Kpnα2 blev hæmmet [5], hvilket tyder på, at det i nogle cellelinjer kan være funktionelt overflødige, mens det i andre er funktionelt relevant. Desuden har mange nylige studier identificeret høj Kpnα2 i tumorvæv, hvilket antyder, at opregulering af Kpnα2 associerede med udvikling af cancer. Sådanne cancere indbefatter melanom [6], brystcancer [7]; [8], spiserørscancer [9], ovariecancer [10], ikke-småcellet lungekræft [11], prostatacancer [12], blærecancer [13] og leverkræft [14]. Interessant, Wang et al. [11] viste, at Kpnα2 udskilles i serum, hvilket antyder det har potentielle kliniske anvendelighed som en cancer biomarkør. Desuden har flere undersøgelser rapporteret, at høje Kpnα2 udtrykket forbinder med dårlig patientoverlevelse [6] – [10]; [12]; [13], hvilket tyder på en potentiel prognostisk rolle for Kpnα2.

Mens overekspression af Kpnβ1 og Kpnα2 i cancerceller synes at være væsentlige begivenheder, er lidt kendt om deres transkriptionel regulering og de faktorer, der styrer deres udtryk og bly til deres opregulering i cancerceller. I denne undersøgelse, derfor, vi klonet og analyseret Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere, og identificeret en vigtig rolle for transskription faktor, E2F, i induktion af Kpnβ1 og Kpnα2 udtryk i kræftceller.

Resultater

øget Kpnβ1 og Kpnα2 proteinekspression i transformerede og cancerceller korrelerer med øget promotor aktivitet

Baseret på vores tidligere resultater, der viser forhøjet Kpnβ1 og Kpnα2 udtryk i livmoderhalskræft celler og transformerede celler i forhold til normal, vi undersøgte Kpnβ1 og Kpnα2 proteinekspression i en repræsentativ normal, transformerede og livmoderhalskræft cellelinie. Disse omfattede normal fibroblastcellelinie, WI38, SV40-transformerede fibroblast cellelinje, SVWI38, og den cervikale cancercellelinie, CaSki. Western Blot analyse viste forhøjede Kpnβ1 og Kpnα2 ekspression i de transformerede celler og cancerceller, sammenlignet med de normale WI38-celler (Fig. 1A). For at bestemme de transkriptionelle regulatoriske mekanismer, som associerer med forhøjet Kpnβ1 og Kpnα2 ekspression i cancer og transformerede celler, har en ca. 2 Kb region opstrøms for transkriptionsstartsitet af Kpnβ1 og Kpnα2 gener, sammen med ca. 100 bp af deres 5′-utranslaterede regioner ( nedstrøms for transkriptionsstartstedet), blev separat klonet ind pGL3-Basic for promoter analyse. Den -2013 til +100 Kpnβ1 og -1990 til 69 Kpnα2 promotor konstruerer både viste signifikant højere aktivitet i den transformerede og kræftceller i forhold til de normale WI38 celler (Fig. 1B og C).

A. Western blot analyse af Kpnβ1 og Kpnα2 proteinniveauer i normal WI38, transformeret SVWI38, og livmoderhalskræft CaSki-celler afslører forøget ekspression i cancer og transformerede celler. B, C. -2013 til +100 Kpnβ1 promotoraktivitet (B) og -1900 til +69 Kpnα2 promotoraktivitet (C) blev målt i cellelysater fremstillet fra transficerede WI38, SVWI38 og CaSki-celler, og blev observeret at være signifikant højere i de transformerede celler og cancerceller sammenlignet med normale celler (* p 0,05). TK-Renilla-Luc blev anvendt som en kontrol for transfektionseffektivitet og luciferaseaktivitet udtrykkes i forhold til Renilla luciferase. De viste resultater er middelværdien ± SD af eksperimenter udført i triplikat og gentaget mindst to gange.

Differential Kpnβ1 og Kpnα2 promotoraktiviteter i normal, transformeret og kræftceller stammer fra -637 til -271 og -180 til -24 regioner Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere, henholdsvis

for at bestemme de regioner, der er ansvarlige for den differentielle aktivitet Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere i normal og omdannede /kræftceller, en serie af deletionskonstruktioner var genereret og analyseret for aktivitet i WI38, SVWI38 og CaSki-celler. Alle deletionskonstruktioner i Kpnβ1 promotoren viste signifikant mere aktivitet i SVWI38 celler sammenlignet med WI38 celler (Fig. 2A). Især i SVWI38 celler sekventiel sletning af -2013 til -637 region ændrede ikke promotor-aktivitet, men sletning af -637 til -271 regionen betydeligt formindsket Kpnβ1 promotor-aktivitet (ca. fem gange) (Fig. 2A). I WI38 celler, sletning af denne region havde ringe effekt på promotor-aktivitet. I CaSki celler blev gjort lignende observationer til dem SVWI38 celler, hvor sletning af regionen fra -637 til -271 væsentligt ændret Kpnβ1 promotor-aktivitet (Fig. 2B). Disse resultater tyder på, at vigtige funktionelle elementer, der er nødvendige for høj Kpnβ1 promoter aktivitet i transformerede og livmoderhalskræft celler, sandsynligvis til at opholde sig i -637 til -271 region i Kpnβ1 promotoren. Med hensyn til Kpnα2, deletion af regionen fra 1900 til -180 havde lille indvirkning på Kpnα2 promotoraktivitet i nogen af ​​cellelinierne (Fig. 2C, D), hvilket antyder, at regionen opstrøms for -180 i Kpnα2 promotoren ikke giver transkriptionsaktivitet. Imidlertid deletion af regionen fra -180 til -24 resulterede i signifikant formindsket promotoraktivitet, næsten til niveauet af tom vektor, med faldet i aktivitet kan være mere udtalt i SVWI38 og CaSki-celler, sammenlignet med WI38 (fig. 2C, D). Dette tyder på, at vigtige funktionelle elementer, der er nødvendige for høj basal Kpnα2 promoter aktivitet i transformerede og livmoderhalskræft celler bor i -180 til -24 region af promotoren.

A. Luciferase reporter konstruktioner indeholdende deleterede fragmenter af den humane Kpnβ1 promotoren blev forbigående transficeret ind WI38 og SVWI38 celler. Luciferaseaktivitet var signifikant højere i SVWI38 celler sammenlignet med normale WI38 celler for alle testede konstruktioner. Den -637 til +100 Kpnβ1 promoter fragment indeholdt signifikant mere promotoraktivitet end -271 til +100 fragmentet i transformerede celler (* p 0,05). B. Aktivitet af Kpnβ1 promotor deletionskonstruktioner i CaSki-celler. C. Luciferase reporter konstruktioner indeholdende deleterede fragmenter af den humane Kpnα2 promotoren blev forbigående transficeret ind WI38 og SVWI38 celler. Sletning af -180 til -24 promoter region resulterede i signifikant formindsket promotor-aktivitet. D. Aktivitet af Kpnα2 promotor deletionskonstruktioner i CaSki celler.

De Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere indeholder funktionelle E2F steder i

​​En bioinformatisk analyse af regionerne -637 til -271 af Kpnβ1 promotor og -180 til -24 i Kpnα2 promoteren (ved hjælp Matlnspector og Conreal softwareprogrammer) identificeret en række formodede bindingssteder for E2F. Dereguleret E2F aktivitet er kendt for at spille en central rolle i udviklingen af ​​kræft; dermed funktionaliteten af ​​disse formodede E2F sites blev undersøgt. Fem formodede E2F-bindingssteder blev identificeret i Kpnβ1 (-637 til -271) promotorregion, og under anvendelse af site-directed mutagenese (og mutere mindst tre baser i konsensus bindingssteder), blev mutante konstruktioner genereret. Tre E2F-steder fandtes at være funktionel, da deres mutation resulterede i signifikant formindsket Kpnβ1 promotoraktivitet (fig. 3A). Dette omfattede de formodede sites mærket som E2F (a), E2F (b) og E2F (c). Interessant mutation af disse tre anlæg samtidig ikke giver nogen yderligere fald i promotoraktivitet, sammenlignet med mutation af E2F sites individuelt, hvilket antyder, at de kan arbejde sammen for at regulere Kpnβ1 genekspression (fig. 3A). Af note, også var opdagelsen af, at mutation af de E2F-steder medførte promotoraktivitet sammenlignelig med den -271 til +100 konstrukt, hvilket antyder, at det er de E2F-steder, der er ansvarlige for stigningen i promotoraktivitet i regionen fra -271 til -637. Mutation af de tre E2F-steder i Kpnβ1 promotoren havde en mere udtalt effekt på promotoraktivitet i SVWI38 og CaSki celler sammenlignet med den i WI38 celler. Disse resultater tyder på, at der er øget afhængighed af E2F steder i transformerede og kræftceller, sammenlignet med normale (fig. 3B).

A. Mutation af de fem formodede E2F-steder i Kpnβ1 (-637 til +100) promotor blev udført ved steddirigeret mutagenese. Mutation af de tre distale E2F-steder fører til et signifikant fald i Kpnβ1 (-637 til +100) promotoraktivitet, som angivet ved luciferaseassays. Mutation af de tre funktionelle E2F sites samtidig førte ikke til nogen yderligere fald i promotor-aktivitet. B. Mutation af de tre E2F steder i SVWI38 og CaSki celler havde en mere dybtgående indvirkning på Kpnβ1 promotor-aktivitet sammenlignet med i WI38 celler (tal angiver fold undertrykkelse). C. Mutation af den fælles E2F site i Kpnα2 promotoren helt afskaffet promotor-aktivitet. D. Mutation af E2F websted i SVWI38 og CaSki celler havde en mere dybtgående indvirkning på Kpnα2 promotor-aktivitet sammenlignet med i WI38 celler. Forsøg er vist som middelværdi ± SE for eksperimenter i fire eksemplarer udført mindst to gange (* p 0,05).

Bioinformatik analyse af Kpnα2 promotoren, på den anden side, afslørede tilstedeværelsen af ​​kun en formodet E2F sted i -180 til -24 region. Interessant, i modsætning til de E2F-steder i Kpnβ1 promotoren, mutation af denne enkelte E2F-site helt afskaffet Kpnα2 promotoraktivitet (fig. 3C). Mutation af E2F-site i SVWI38 og CaSki-celler resulterede i 84- og 57-fold repression af promotoraktivitet, hvorimod dens mutation i WI38-celler resulterede kun 4 gange undertrykkelse af promotoren (fig. 3D).

Sammen disse resultater tyder, at Kpnβ1 promotor indeholder E2F sites, der virker til at forbedre promotor-aktivitet, mens Kpnα2 promotor indeholder en E2F websted, der er involveret i basal promotor aktivering. Desuden E2F aktivering af begge initiativtagere er mere udtalt i transformerede og cancerceller, i forhold til det normale.

E2F /DP1 heterodimerer binde og aktivere Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere

in vivo

E2F fungerer som en heterodimer transskription faktor sammensat af to underenheder: en E2F familiemedlem og en Dp familiemedlem. Selv om der er flere E2F-familiemedlemmer, der menes at binde den samme konsensussekvens (5′-TTTSSCGS-3 ‘; S refererer til C eller G), har E2F1, E2F2 og E2F3 vist sig at indeholde en stærk onkogen kapacitet [15], dermed binding af E2F til Kpnβ1 og Kpnα2 promotorer blev undersøgt under anvendelse af et antistof mod E2F2 at krydsreagerer med E2F1, E2F2 og E2F3. Dp proteinfamilien omfatter proteiner Dp1-3, med DP1 har tidligere været forbundet med kræft. For at vurdere E2F2 /DP1 binding

in vivo

blev chip assays udført under anvendelse af chromatin fremstillet fra SVWI38 og CaSki-celler. DNA blev immunpræcipiteret under anvendelse af α-E2F2 eller α-DP1 antistoffer og anvendt i en PCR med primere spænder over E2F-steder i Kpnβ1 og Kpnα2 promotorer (fig. 4A, B). Positiv forstærkning i både SVWI38 og CaSki cellelinjer bekræftet en sammenhæng mellem E2F2 /DP1 og E2F steder i både Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere (fig. 4A, B).

A, B. Prøver af sonikerede kromatin var immunpræcipiteret med et α-E2F2 antistof, et α-DP1 antistof eller intet antistof som angivet. DNA isoleret fra immunpræcipiteret materiale blev amplificeret ved PCR under anvendelse af primere spænder over E2F-steder til stede i Kpnβ1 (A) eller Kpnα2 (B) promotorer. Amplificerede fragmenter blev analyseret ved elektroforese på en 2% agarosegel. Eksperimenter blev udført i både SVWI38 og CaSki cellelinier. C. Western blot, der viser Kpnβ1 og Kpnα2 proteinniveauer efter DP1 inhibering ved hjælp siRNA. β-tubulin blev anvendt som en kontrol for protein loading. D, E. Kpnβ1 og Kpnα2 promoter aktiviteter efter DP1 hæmning. De viste resultater er middelværdien ± SE for eksperimenter i fire eksemplarer udført mindst to gange (* p 0,05).

Desuden at bestemme, om bindingen af ​​E2F /DP1 til Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere blev ansvarlige for de forhøjede niveauer af både Kpnβ1 og Kpnα2 proteiner

in vivo

, E2F aktivitet blev inhiberet af silencing ekspressionen af ​​DP1, uden hvilken E2F ikke længere kan fungere. Kpnβ1 og Kpnα2 proteinniveauer blev målt ved Western blot-analyse efter DP1 knock-down hjælp siRNA, og viste sig at falde efter DP1 inhibering (fig. 4C). Kpnβ1 og Kpnα2 promoter aktiviteter blev ligeledes undertrykt på DP1 hæmning (fig. 4D, E).

HPV E7 regulerer Kpnβ1 og Kpnα2 promoter aktiviteter i livmoderhalskræft celler via undertrykkelse af Rb

I livmoderhalskræft cancerceller HPV E7-protein vides at binde retinoblastoma (Rb) -protein, hvilket fører til dets phosphorylering og i sidste ende nedbrydning. Det er grunden til, at E2F målgener ofte overudtrykkes i livmoderhalskræft, som E2F er ikke længere undertrykkes af Rb og kan således frit mobilisere de målgener. Derfor har vi antaget, at hæmning af HPV E7 i livmoderhalskræft celler ville føre til genoprettet Rb-funktion, der forårsager reduceret E2F aktivitet, og dermed mindsket Kpnβ1 og Kpnα2 promoter aktiviteter. For at teste denne hypotese blev CaSki-celler transficeret med HPV16 E7 siRNA (fig. 5A), og efter bekræftelse genoprettelsen af ​​Rb (angivet i fig. 5B ved et fald i niveauerne af phosphoryleret Rb og en tilhørende steg i ikke-phosphoryleret Rb), Kpnβ1 (-637 til 100) og Kpnα2 (-180 til 69) promoter aktiviteter blev målt. Kpnβ1 og Kpnα2 promoter aktiviteter blev væsentligt reduceret i E7 knock-down celler, i forhold til at styre celler, om end i forskelligt omfang (fig. 5C og D). For at bekræfte, at de faldt Kpnβ1 og Kpnα2 promotoraktiviteter var via genetablering af RB-funktion, blev Rb overudtrykt i CaSki cervikal cancerceller og Kpnβ1 og Kpnα2 promotoraktiviteter målt. Resultaterne viste, at Kpnβ1 og Kpnα2 promotoraktiviteter var begge betydeligt reduceret på overekspression af Rb (fig. 5E og F). Sammen disse resultater tyder på, at de høje Kpnβ1 og Kpnα2 ekspressionsniveauerne i livmoderhalskræft celler skyldes til dels, at E7-medieret hæmning af Rb, og den deraf følgende øgede aktivering af Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere af E2F.

A , B. HPV16 E7 siRNA blev anvendt til at inhibere E7-ekspression i CaSki-celler og Western blot-analyse udført for at analysere HPV E7 (A) og Rb (B) niveauer efter HPV E7 knock-down. C, D. Kpnβ1 (C) og Kpnα2 (D) promoter aktiviteter blev målt efter E7 siRNA transfektion, og viste sig at være hæmmet betydeligt efter HPV E7 hæmning. E, F. Rb blev overudtrykt i CaSki-celler og Kpnβ1 (E) og Kpnα2 (F) promotoraktiviteter viste sig at blive inhiberet signifikant. De viste resultater er middelværdien ± SE for eksperimenter i fire eksemplarer udført mindst to gange (* p 0,05).

Diskussion

I denne undersøgelse vi klonet og analyseret Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere med et mål at identificere potentielle reguleringsmekanismer, der kunne drive deres høj ekspression i cancerceller. Denne undersøgelse er hidtil ukendte, idet det er den første, vi ved, der beskriver E2F som et vigtigt transkriptionel regulator af Kpnβ1 og Kpnα2 ekspression i cancerceller. E2F spiller en rolle i en bred vifte af cellulære processer og er blevet rapporteret til at regulere ekspressionen af ​​gener involveret i differentiering, udvikling, proliferation og apoptose [16]. Det blev tidligere rapporteret, at E2F spiller en rolle i reguleringen af ​​RanBP1 genet [17], en vigtig partner for Ran GTPase og integreret del af processen nukleare transport, og vores studie, der beskriver E2F-regulering af Kpnβ1 og Kpnα2 nukleare importør proteiner yderligere implicerer E2F i reguleringen af ​​gener involveret i nuklear transport.

E2F aktivitet styres af Rb-vejen, hvorved under normale omstændigheder RB binding til E2F undertrykker E2F aktivitet, indtil G1 /S-fasen af ​​cellens cyklus, hvorefter Rb bliver phosphoryleret af cdk4 /cyclin D-komplekser, og E2F er frigivet til at aktivere sit mål gener. Imidlertid er E2F aktivitet ofte dereguleret i cancer, som følge af den hyppige afbrydelse af Rb-vejen [18] – [21]. Rb mutationer er blevet observeret i et bredt spektrum af tumorer, herunder osteosarkomer, småcellede carcinomer, brystcarcinomer, og andre. I mange cancere p16

INK4a cdk inhibitoren er muteret, eller dets funktion er tab. Dette fører til forhøjede cdk4 /cyclin D aktivitet, hvilket resulterer i øget Rb-phosphorylering og dermed E2F akkumulering. Endelig dereguleret ekspression og /eller amplifikation af cyclin D og CDK4-gener er også blevet observeret i mange cancertyper. Dette fører til en øget grad af CDK4 /cyklin D aktivitet og dermed tilsvarende deregulering af E2F vej [21]. I livmoderhalskræft, inaktiveringen af ​​E2F repressoren, Rb, HPV E7, resulterer i øget E2F aktivitet. Som følge af hyppig afbrydelse af vejen, der regulerer E2F funktion, E2F målgener ofte overudtrykt i cancerceller på grund af forøget E2F transaktivering [22].

Vi viser, at overexpresion af Kpnβ1 og Kpnα2 i cancer skyldes til dels forøget aktivering af deres promotorer af E2F. Et murint undersøgelse af Ishida et al. [23] identificeret en potentiel rolle for E2F i reguleringen af ​​Kpnα2 genekspression under cellecyklus. Vores undersøgelse udvider dette resultat og viser en rolle for E2F i reguleringen af ​​menneskets Kpnα2, via en specifik E2F websted placeret ved position -34 til -27 i Kpnα2 promotoren. Denne E2F websted vises afgørende for både basal og aktiveret Kpnα2 genekspression. Desuden har vi identificeret tre funktionelle E2F sites i Kpnβ1 promotor, der vises til at handle i fællesskab for at regulere Kpnβ1 udtryk. Det er blevet rapporteret, at flere E2F sites kan eksistere i promotorområdet af et gen, og at disse steder ofte samarbejder om at regulere genekspression [24].

Konstateringen af, at Kpnβ1 og Kpnα2 generne er reguleret af E2F tyder på, at de er reguleret i en cellecyklus-afhængig måde. Det er tidligere blevet rapporteret, at den nukleare import af karyopherin a /p substrater er mere effektiv i visse faser af cellecyklus [25], i overensstemmelse med vores data, der viser E2F-regulering af Kpnβ1 og Kpnα2. Samlet set vores resultater tyder på, at det liberaliserede E2F i cancerceller medfører øget aktivering af Kpnβ1 og Kpnα2 initiativtagere, hvilket fører til forhøjede niveauer af disse proteiner, og i sidste ende påvirker kræft fænotype.

Materialer og metoder

Cellekultur

WI38 normale lungefibroblaster, SVWI38 transformeret WI38- fibroblaster, og CaSki livmoderhalskræft celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). Celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og 10% kalvefosterserum (FBS) (Gibco, Paisley, Skotland). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2.

Protein høst og Western Blot-analyse

Celler i kultur blev dyrket til 80% konfluens og lyseret på is i RIPA-buffer (10 mM Tris-CI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% deoxycholat, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1 X Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Basel, Schweiz)). Western blot-analyser blev udført ved anvendelse af kanin-anti-Kpnβ1 (H-300) (sc-11367, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), gede-anti-Kpnα2 (C-20) (sc-6917), kanin-anti -Dp1 (K-20) (sc-610), muse-anti-HPV16 E7 (ED17) (sc-6981), muse-anti-Rb (4H1) (# 9309, Cell Signaling), og kanin-anti-β-tubulin ( H-235) (sc-9104, Santa Cruz Biotechnology) antistoffer

PCR-amplifikation af Kpnβ1 (-2013 til +100) promotor

Primere blev udformet, som ville amplificere regionen fra. – 2013-100 af Kpnβ1 genet (GenBank accessionsnummer: NC_000017): Kpnβ1F 5’AGGCTAGCCCAGCTACATCCAATTACCC 3 ‘og Kpnβ1R 5’AGAAGCTTCTGGGGGCAGCTCAGA 3’ (Nhel site er understreget og HindIII-sted er med fed), og -1992 til +69 af Kpnα2 genet (Genbank: NC_000017): Kpnα2F 5’AGTT

CCCGGG

GCAAAAGAAACTCAACTTGGC 3 ‘og Kpnα2R 5’AGAAGCTTGGGAATCAGCGGCTGTAG 3’ (Smal-stedet er kursiverede og HindIII site er med fed skrift). PCR blev udført ved anvendelse af 100 ng normalt blod DNA som skabelon, og high fidelity Expand Plus DNA Polymerase (Roche). 5% DMSO blev inkluderet i PCR for Kpnβ1 at forbedre specificiteten. Promotorsekvenser PCR-produkter blev subklonet i vektoren pGEM-T Easy (Promega) og Kpnβ1 (-2013 til +100) fragment udskåret med Nhel- og Hindlll-restriktionsenzymer, og Kpnα2 (-1992 til +69) fragmentet udskåret med Smal og HindIII restriktionsenzymer, til subkloning ind i luciferasereporterplasmid, pGL3 Basic Vector (Promega). Der var problemer med Smal digest, dermed Sad blev brugt i stedet, som en Sad sted var til stede ved position -1900 i Kpnα2 promotoren. Subkloning i pGL3 Basic placerede Kpnβ1 (-2013 til +100) og Kpnα2 (-1990 til +69) promotorfragmenter opstrøms for promotor-mindre luciferasegenet for promotoraktivitet analyse. Konstruktioner blev verificeret ved sekventering hjælp af UCT Human Genetik Sequencing Unit.

Generation of Kpnβ1 og Kpnα2 promotor deletionskonstruktioner

Promoter deletionskonstruktioner for Kpnβ1 blev genereret ved hjælp af enten restriktionssteder fælles for både den klonede promotor fragmentet og pGL3-Basic multiple kloningssted (KpnI for -637 til +100 konstrukt; SacI for -271 til +100 konstrukt), eller gen-specifikke fremadrettede primere (5’AGGCTAGCGCCGTCAGGAGAGCTTGA 3 ‘for -861 til +100 konstruere, 5 ‘AGGCTAGCAGCGCCTGGCCAGTTAG 3’ for -108 til +100 konstruktion, Nhel restriktion site er understreget) og Kpnβ1 R primeren. Den -180 til 69 sletning konstruktion for Kpnα2 blev genereret ved hjælp Nrul og Sacl restriktionsenzymer, der udgav -1900 til -180 fragment, mens -24 til 69 sletning konstruktion blev genereret ved hjælp Swal og Sacl restriktionsenzymer, der udgav -1900 til -24 fragment.

luciferaseassays

100 ng af hver promotor konstruktion blev transficeret ind 30 000 CaSki livmoderhalskræft celler /brønd i en plade med 24 brønde under anvendelse af 0,3 pi Transfectin ( Bio-Rad). At normalisere for transfektionseffektiviteten blev cellerne co-transficeret med 10 ng af pRL-TK-plasmidet (der koder Renilla luciferase). Totale cellelysater blev fremstillet ud fra celler 24 timer efter transfektion under anvendelse af 1 X Passive Lysis Buffer (Promega) og ildflue-luciferaseaktivitet blev analyseret under anvendelse af Dual Luciferase Kit (Promega). Luminescens blev overvåget ved anvendelse af Glomax 96 mikroplade luminometer (Promega). Aktivitet blev normaliseret til den Renilla luciferaseaktivitet fra pRL-TK i samme ekstrakt.

steddirigeret mutagenese af formodede E2F steder i

​​Mutationer i E2F-bindingssteder i Kpnβ1 promotoren blev fremstillet ved site-directed mutagenese ved anvendelse af mutagene primere: E2Fa: F: 5’CGCTCAGGCCCGCtAgcACCTCGCGCAACAC 3 ‘; E2Fa: R: 5 ‘GTGTTGCGCGAGGTgcTaGCGGGCCTGAGCG 3’; E2Fb: F: 5’GAACCCAGCTCCGCCTCTTgCtaGcGGCGTCCCATCGTGCCCC 3 ‘; E2Fb: R: 5 ‘GGGGCACGATGGGACGCCgCtaGcAAGAGGCGGAGCTGGGTTC 3’; E2Fc: F: 5’GCTCCTAGGGTTGCtaGcCACCTCCCGCCTTCC 3 ‘; E2Fc: R: 5 ‘GGAAGGCGGGAGGTGgCtaGCAACCCTAGGAGC 3’; E2Fd: F: 5’CGGGCACCTCCCGCCTgCtaGCGCCCCGACCCCGAAC 3 ‘; E2Fd: R: 5 ‘GTTCGGGGTCGGGGCGCtaGcAGGCGGGAGGTGCCCG 3’; E2Fe: F: 5’CTCCTCTCCTTAGTTCTCgCtaGCACCCTATCCTATCAAC 3 ‘; E2Fe: R: 5 ‘GTTGATAGGATAGGGTGCtaGcGAGAACTAAGGAGAGGAG 3’ (muterede baser er angivet med små bogstaver, Nhel restriktion site er understreget). Mutation af E2F-bindingssted i Kpnα2 promotoren blev udført under anvendelse af mutagene primere: F 5’CAATCGGAATGCGGAGTCgCtaGcAAATTTAAATCGCGCCGGGC 3 ‘og R5’ GCCCGGCGCGATTTAAATTTgCtaGcGACTCCGCATTCCGATTG 3 ‘. PCR blev udført under anvendelse af følgende betingelser: 95 ° C i 30 sekunder, efterfulgt af 18 cykler ved 95 ° C i 30 sekunder, 61 ° C i 1 minut og 72 ° C i 6 minutter, efterfulgt af en endelig forlængelse trin med 72 ° C i 20 minutter. Efter PCR-amplifikation, 10 U Dpnl (Promega) blev tilsat, og fordøjelse udført ved 37 ° C i 90 minutter, før transformation ind JM109 yderst kompetente celler (Promega). Restriktionsfordøjelse analyse blev anvendt til at identificere kloner bærer mutationen.

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

Celler blev dyrket til ca. 90% sammenflydning og protein-DNA-komplekser tværbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter, efterfulgt af tilsætning af 0,125 M glycin, pH 2,5. Celler blev høstet, lyseret i lysisbuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-CI, pH 8,1, 1 X Complete Protease Inhibitor (Roche)), og sonikeres til længder på mellem 400 og 1000 bp. Cellelysater blev fortyndet i fortyndingsbuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-CI, pH 8,1, 1 X Complete Protease Inhibitor) og derefter for-klaret med protein A-agaroseperler (Merck, NJ, USA) i 2 timer. Perler var tidligere blevet blokeret i 100 ug /ml laksesperma-DNA og 5% BSA. Kromatin blev inkuberet med 2 ug antistof (α-E2F 2 (C-20 X, sc-633 X, Santa Cruz Biotechnology); a-DP1 (K-20, sc-610, Santa Cruz Biotechnology), eller intet antistof negativ kontrol ) ved 4 ° C natten over. Protein-A agaroseperler blev tilsat i yderligere 2 timer ved 4 ° C, og immunkomplekser bundet af perlerne udvindes ved centrifugering og vasket to gange sekventielt i TSE I (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-CI, pH 8,1, 150 mM NaCl), TSE II (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-CI, pH 8,1, 500 mM NaCl), Buffer III (0,25 M LiCI, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-CI, pH 8,1) og TE, pH 7,4.