PLoS ONE: Karakterisering af en TIP60 specifik inhibitor, NU9056, i prostata Cancer

Abstrakt

TIP60 (KAT5) er en histonacetyltransferase (HAT enzym) er involveret i flere cellulære processer, herunder transkriptionel regulering, DNA-skader reparation og cellesignalering. I prostatacancer, aggressive tilfælde overudtrykker TIP60 der fungerer som en androgen receptor co-aktivator via direkte acetylering af lysinrester i KLKK motiv af receptoren hængselsregionen. Formålet med denne undersøgelse var at identificere og karakterisere en TIP60 acetylase inhibitor. High-throughput screening afslørede en isothiazol der hæmmede både TIP60 og p300 HAT aktivitet. Dette stof (oprindeligt identificeret som 4-methyl-5-bromoisothiazole) og andre isothiazoler blev syntetiseret og analyseret mod TIP60. Selv om en autentisk prøve af 4-methyl-5-bromoisothiazole var inaktiv mod TIP60, i en

in vitro

HAT assay 1,2-bis (isothiazol-5-yl) disulfane (NU9056) blev identificeret som en relativt kraftig inhibitor (IC

50 2 pM). Cellulær aktivitet blev bekræftet ved analyse af acetylering af histon og ikke-histon-proteiner i en prostatacancer-cellelinie model. NU9056 behandling inhiberede cellulær proliferation i et panel af prostatakræft-cellelinier (50% væksthæmning 8-27 um) og induceret apoptose via aktivering af caspase 3 og caspase 9 i en koncentrations- og tidsafhængig måde. Også, nedsat androgen receptor, prostataspecifikt antigen, p53 og p21 proteinniveauer blev påvist i respons på behandling med NU9056. Endvidere forbehandling med NU9056 hæmmede både ATM phosphorylering og TIP60 stabilisering som reaktion på ioniserende stråling. Baseret på aktiviteten af ​​NU9056 og specificitet af forbindelsen mod TIP60 forhold til andre HAT enzymer har disse kemiske biologiske undersøgelser identificeret TIP60 som et potentielt terapeutisk mål for behandling af prostatacancer

Henvisning:. Coffey K, Blackburn TJ Cook S, Golding BT, Griffin RJ, Hardcastle IR, et al. (2012) Karakterisering af en TIP60 specifik inhibitor, NU9056, i prostatakræft. PLoS ONE 7 (10): e45539. doi: 10,1371 /journal.pone.0045539

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: April 18, 2012; Accepteret: August 21, 2012; Udgivet: 8. oktober, 2012 |

Copyright: © Coffey et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var leveret af Cancer Research UK (CRUK) (C240 /A7409; C29821 /A10348) (www.cancerresearchuk.org) og Medical Research Council (MRC) PROMPT (G0100100 /64424) (www.mrc.ac.uk). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. KH var ansat af OSI Pharmaceuticals, Inc. Forbindelser diskuteret i denne artikel, er ikke patenteret i udvikling eller markedsføres af dette selskab. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

histonacetylering og deacetylering er centrale begivenheder i reguleringen af ​​kromatin struktur. Histonacetyltransferaser (hat) katalyserer tilsætningen af ​​acetylgrupper til ε-aminoterminalen af ​​lysinrester inden histoner. Acetylering resulterer i en åben kromatin struktur ved at fjerne positive ladninger fra histoner, og dermed fremkalde protein konformationelle ændringer, som tillader transkriptionel maskiner at få adgang til DNA og fremme transkriptionsaktivitet. Histondeacetylaser (HDAC) er imod denne proces ved at fremme en lukket kromatin struktur, som er transkriptionelt undertrykt. Desuden kan histonacetylering mærker fungere som docking sites for andre proteiner til at fortolke den “histon koden«; for eksempel, blev den tredelte motiv indeholdende 24 (TRIM24) for nylig beskrevet som en “læser” protein, der genkender både umodificeret histon H3 ved lysin 4 og histon H3 acetyleret ved lysin 23 på samme histon halen resulterer i øget genekspression [1] . Desuden ikke-histon-proteiner, såsom p53 [2], [3], ataksi telangiectasia muteret (ATM) [4] og androgen receptor (AR) [5], [6] kan også acetyleret resulterer i ændret proteinaktivitet. Derfor kan protein acetylering og deacetylering få væsentlig indvirkning på celle funktion og for celler til at opretholde en normal vækst og differentiering er det vigtigt, at disse to funktioner opretholde ligevægt. Til støtte for dette koncept, har HDAC-hæmmere vist sig at have vidtrækkende cellulære effekter og klinisk aktivitet i leukæmi [7], [8], med Vorinostat (SAHA) er godkendt til klinisk brug i denne sygdom. Modulation af histonacetylering klart har terapeutisk potentiale.

TIP60, for nylig omdøbt KAT5, er medlem af MYST familien af ​​HAT-enzymer først identificeret i 1996 [9]. Siden da er der fundet mange cellulære funktioner til at bruge dette protein. Tab af TIP60 resulterer i nedsat DNA-reparation, da dette HAT aktiveres som reaktion på ioniserende stråling (IR), der forårsager acetylering af histoner og aktivering af p53 og ATM [4]. Hæmning af TIP60 bør derfor bevidstgøre celler til DNA-skadelige midler anvendt som kræftmedicin. TIP60 også funktioner i NF-KB-vejen, via interaktioner med B-celle CLL /lymfom 3 (BCL-3) [10] og cAMP-afhængig signalering [11]. Desuden kan TIP60 fungere som en co-aktivator for en række steroidhormonreceptorer herunder AR, som er involveret i udviklingen og progressionen af ​​prostatacancer (CaP). Undersøgelser har vist, at AR kan acetyleres ved en række HAT enzymer, herunder p300, p300 /CBP-associeret faktor (PCAF) og TIP60, at øge sin transkriptionsaktivitet [6], [12]. AR acetylering menes at regulere rekruttering af co-aktivatorer til det transkriptionelle maskineri androgen responsive gener [13]. Derudover TIP60 er funktionelt opreguleret i kliniske CaP-prøver og ekspression korrelerer med sygdomsprogression [14]. I modsætning hertil en rapport foreslået, at TIP60 er forpligtet til at udtrykke tumormetastaser suppressor KAI1 i Cap-cellelinjer, hvilket tyder på, at TIP60 er en tumor suppressor [15]. Ligeledes en TIP60 gen knockout undersøgelse foreslået TIP60 som haplo-utilstrækkelig tumor suppressor på pre og tidlig-tumor stadier af lymfom, bryst og hoved og hals kræft [16]. Men undersøgelser af kliniske prostata prøver modsiger dette forslag og støtte TIP60 som et onkogen i CaP [13], [17]. Således målrette acetylase aktivitet TIP60 kunne være en nyttig terapeutisk strategi i CaP.

Et lille antal HAT-hæmmere er blevet rapporteret. Kobling af en histon H3 peptid til CoA til dannelse af en bisubstratinhibitor af HAT-aktivitet er blevet beskrevet; imidlertid har forbindelsen ringe cellemembranpermeabilitet [18]. De naturlige produkter anacardic syre og garcinol er HAT inhibitorer, som er celle permeable; de sensibilisere celler til IR, som kunne være nyttige som en kombinationsterapi til kræftbehandling. Andre hæmmere af HAT-funktion omfatter a-methylen butyrolactoner [19], benzylidengrupper acetones [20] og alkylidengrupper malonater [21]. For nylig isothiazoloner, som kovalent binder til det aktive sted HAT thiol, er blevet beskrevet som en effektiv udgangspunkt for molekylære modellering tilgange til generering mere potente og specifikke inhibitorer [22] – [24]. I den aktuelle undersøgelse anvendte vi en højkapacitetsscreening tilgang til at identificere selektive inhibitorer af TIP60. Baseret på den ledende molekyle, strukturelt beslægtede forbindelser blev genereret og testet for HAT hæmning og TIP60 specificitet med henblik på at identificere en molekylær redskab til studier i cellelinje modeller af CaP.

Resultater

High Throughput screen (HTS) og Hit Validering

en high throughput screening kampagne for TIP60 hæmmere blev gennemført på OSI Pharmaceuticals Ltd. Analyser baseret på ALPHA ™ skærm og DELFIA ™ formater blev udviklet og anvendt til at screene en strukturelt forskelligartet sammensatte samling (~80,000 medlemmer). Et antal hits blev identificeret fra den primære ALPHA ™ skærmen. Men de fleste af disse ikke viser signifikant aktivitet i det sekundære skærm. En enkelt forbindelse oxa-10 (oprindeligt identificeret som 4-methyl-5-bromoisothiazole, 1), blev identificeret som et hit i begge skærme, og aktiviteten blev gentaget med tilbagekøbt materiale. Tilbagekøbes oxa-10 udviste aktivitet mod TIP60 (IC

50 1.1 uM – figur 1) og p300 (IC

50 2.7 uM) (tabel 1), men ikke andre histonacetyltransferaser, f.eks PCAF og GCN5 (IC

50 100 uM). LC-MS-analyse af de tilbagekøbte prøve af oxa-10 indikerede tilstedeværelsen af ​​-80% 4-methyl-5-bromoisothiazole 1, men viste, at den indeholdt ca. 20% af en ukendt urenhed. For at validere 1 som den aktive inhibitor af TIP60 i oxa-10, blev syntesen af ​​1 forpligtet sig sammen med analoger, for at udvikle structure activity relationships. Nærmere oplysninger om kemisk syntese (figur 2) kan findes i supplerende oplysninger.

For at vurdere aktivitet mod TIP60 HAT,

in vitro

HAT analyser ved hjælp af

3H acetyl-CoA blev gennemført ved anvendelse af histoner som substrater. Assays blev udført i fire eksemplarer og gentaget to gange. For forbindelser, der producerer 50% inhibering ved 100 uM, IC

50 værdier blev beregnet. Individuelle IC

50 værdier præsenteres. For andre forbindelser på% hæmning ved 100 uM præsenteres. Vejviser

Specificitet af NU9056 for TIP60 acetyltransferase

NU9056 (7), samt forbindelser 5 og 6, blev testet for

in vitro

aktivitet mod et panel af rekombinante HAT enzymer, herunder p300, PCAF og GCN5, at afgøre, om de udviser større specificitet mod TIP60 end forbindelse 1. ICR CCT129182, som har vist sig at har inhiberende aktivitet over for p300 og PCAF, blev også testet [24]. Et antal forbindelser viste sig at inhibere aktiviteten af ​​TIP60 ved lave mikromolære koncentrationer (figur 1; Supplemental Figur S1). Imidlertid specificitet mod TIP60 frem for andre testede HAT enzymer viste sig at være størst med forbindelse 7 (NU9056) som vist i tabel 1 (16.5-, 29- og 50-fold for selektivitet for TIP60 løbet PCAF, p300 og GCN5 henholdsvis ).

NU9056 Hæmmer Protein Acetylering i prostata kræftceller

TIP60 acetylerer histon proteiner specifikt histoner H4 og H2A, i en nukleosomal sammenhæng [25]. Endvidere

in vitro Salg undersøgelser har vist, at TIP60 kan også acetylere kernehistoner H2A (Lys 5), H3 (Lys 14) og H4 (Lys 5, Lys 8, Lys 12 og Lys 16) [26], [27]. For at teste om NU9056 kunne hæmme acetylering af endogene proteiner rettet af TIP60 blev LNCaP celler anvendes, da disse er en repræsentativ model af androgen afhængig CaP. Acetyleringen status histon H4 på lysin 8 (H4K8) og 16 (H4K16) og histon H3 på lysin 14 (H3K14) blev undersøgt i disse celler ved Western blotting. Desuden blev niveauet af TIP60 vurderes efter behandling med NU9056 og kontrolforbindelsen, 1,2-bis (4-pyridyl) ethan (figur 3A) demonstrerer, at TIP60 niveauer selv er upåvirket. Som de basale niveauer af disse acetylerede histon mærker er ganske lavt, blev HDAC inhibitor Trichostatin A (TSA) indført for at fjerne indflydelsen af ​​HDAC aktivitet på acetylering i det cellulære assay. Ved tilstedeværelse af TSA alene, blev acetylering forøget ved H4K8, H4K16 og H3K14 (figur 3B), i overensstemmelse med tidligere rapporter [28] – [30]. Stigende koncentrationer af NU9056 resulterede i reducerede niveauer af acetyleret histon H4K16, H3K14 og H4K8, mål for TIP60-medieret acetylering (figur 3C). Desuden kontrol sammensatte, 1,2-bis (4-pyridyl) ethan, påvirkede ikke nogen af ​​histon modifikationer undersøgt

Del 1 -. Syntese af forbindelser 4-7. Del 2 – Syntese af forbindelser 1 og 11.

LNCaP-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af NU9056 eller kontrolforbindelsen, 1,2-bis (4-pyridyl) ethan i 24 timer. (A) Niveauer af TIP60 blev vurderet ved Western blot. (B) LNCaP-celler blev behandlet med 2 pM TSA i 6 timer og niveauer af histon H4 acetyleret lysin 16, blev histon H4 acetyleret lysin 8 og histon H3 acetyleret lysin 14 vurderes ved Western blotting. LNCaP-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af NU9056 eller kontrolforbindelsen i 2 timer, derefter behandlet med HDAC-inhibitor TSA (2 uM) i yderligere 4 timer. (C) Niveauer af histon H4 acetyleret-lysin 16, histon H4 acetyleret-lysin 8 og histon H3 acetyleret lysin 14 blev vurderet ved Western blot. (D) LNCaP-celler blev behandlet med 24 pM NU9056 over 4 dage og niveauerne af acetyleret tubulin blev vurderet ved Western blotting. (E) LNCaP-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af NU9056 eller kontrolforbindelsen i 2 timer, derefter behandlet med HDAC-inhibitor TSA (2 uM) i yderligere 4 timer. Niveauer af acetyleret tubulin blev vurderet ved Western blotting. Alpha-tubulin blev anvendt som en loading kontrol. Repræsentative blots er vist for dublerede eksperimenter.

For at definere yderligere HAT hæmmende aktivitet NU9056, acetylering af den ikke-histon protein α-tubulin blev også undersøgt. Når LNCaP-celler blev inkuberet med NU9056 (24 uM) i 24 timer blev der observeret et fald i acetyleret tubulin. Men ved 72 timer acetylering var vendt tilbage til basale niveauer (figur 3D). For at bekræfte, at denne virkning skyldtes NU9056, blev acetyleret tubulin overvåget men blev ikke observeret nogen ændring i niveauet inden for 6 timer i modsætning ændringer histon modifikationer (figur 3e). Densitometri for alle Western blots er vist i Supplemental Figur S2.

NU9056 Hæmmer Cell Growth

Vi observerede, knockdown af TIP60 i LNCaP-celler resulterede i en inhibering af celleproliferation med ca. 33% (p -værdi = 0,0019) (figur 4A). Effektiv knockdown af TIP60 mRNA i disse celler blev bekræftet ved realtids-PCR (figur 4B, 70% knockdown; p-værdi = 0,0313) og Western blotting (figur 4C). Hvis NU9056 handling blev medieret gennem inhibering TIP60 enzymatisk aktivitet, ville forventes inhibering af celleproliferation med NU9056. Faktisk proliferation blev fundet at blive reduceret i nærvær af NU9056 i alle testede CaP cellelinier som målt ved sulforhodamin B (SRB) assayet (tabel 2, supplerende Figur S3, S4). Interessant LNCaP celler, som er androgen lydhør og udtrykker et muteret men funktionelle AR samt vildtype p53, og knoglemetastaser afledte PC3 celler, som ikke udtrykker en funktionel AR og er p53 null, viste lignende GI

50 koncentrationer (24 uM ± 2 og 27 pM ± 2 ved LNCaP og PC3-celler, henholdsvis). Imidlertid LNCaP-AI-celler, en sub-linje af LNCaP-celler serielt opretholdes i steroid-depleterede medier, som stadig udtrykker en funktionel AR og er en model af kastrationsniveau resistent CaP efter androgen ablation terapi, har en lavere GI

50 ( 24 uM ± 2 og 16 uM ± 1 ved LNCaP og LNCaP-AI, henholdsvis). Andre cellelinie modeller af androgenuafhængighed, f.eks LNCaP-CdxR, som er serielt opretholdes i nærvær af bicalutamid og CWR22rv1, viser signifikant større følsomhed til NU9056 end den parentale LNCaP-cellelinien (GI

50 værdier på 12 pM ± 2,5 og 7,5 uM ± 0,2 (p 0,05 og p 0,0005, henholdsvis)). TIP60 niveauer blev målt ved Western blotting i disse cellelinier (figur 4D) for at afsløre, at den mest følsomme cellelinie, CWR22rv1, faktisk udtrykker mest TIP60.

(A) For at bekræfte at inhibering af TIP60 kan reducere cellulær spredning 2,5 nM siRNA målrettet mod TIP60 i LNCaP celler eller blev anvendt en ikke-lyddæmpning kontrol. Proliferation blev bestemt ved sulforhodamin B (SRB) assays ved 3 kontrol proliferation fordobling tidspunkter efter siRNA transfektion i normal vækst medier. For at bekræfte TIP60 knockdown blev RNA opsamlet ved 96 timer fra et parallelt forsøg og vurderet for TIP60 ekspression under anvendelse af (B) real-time PCR og (C) Western blotting. (D) TIP60 niveauer i prostatacancercellelinjer blev vurderet ved Western blotting. (E) Prostatacancer celleoverlevelse blev vurderet ved behandling LNCaP-celler med 24 pM NU9056 i 24 timer og derefter udpladning ved varierende celledensiteter (3 × 10

3, 1,6 × 10

4 og 3 × 10

4 ) og tillade kolonier til dannelse over 2 uger. Kolonier blev derefter fikseret med Carnoys fiksativ og farvet med krystalviolet. Kolonier blev derefter talt og kolonidannende effektivitet beregnes. Gennemsnittet af 3 eksperimenter ± standardafvigelse er vist på søjlediagrammer. * P-værdi. 0,05

For at teste, om NU9056 kan reducere overlevelsen Cap celler blev kolonidannende evne evalueret efter eksponering af LNCaP celler til 24 uM (GI

50) NU9056 i 24 timer. Kolonidannende evne blev reduceret efter NU9056 eksponering, som var statistisk signifikant (p 0,05). (Figur 4E)

NU9056 Behandling Årsager Apoptose via caspaseaktivering

Virkningerne af NU9056 på cellecyklus fase distribution og apoptoseinduktion blev også testet i LNCaP-celler. For at vurdere apoptotiske virkninger, blev anvendt FACS-analyse for aktiveret caspase 3 og aktiveret caspase 9. NU9056 resulterede i både caspase 3 og caspase 9-aktivering på en tids- og koncentrationsafhængig måde (figur 5A, Supplerende fig S5 og S6). Niveauerne af apoptose blev også sammenlignet med andre HAT-hæmmere som viser, at NU9056, med dens større specificitet for TIP60, kan inducere apoptose på samme niveau til de mere promiskuøse hæmmere (Supplerende figur S7). Analyse af sub-G1 population i LNCaP-celler (figur 5B) bekræftede induktion af apoptose på en tids- og koncentrationsafhængig måde for NU9056. Men under ingen betingelser for udsættelse for NU9056 vi observere nogen G1 eller G2M cellecyklusstop i LNCaP celler; kun ophobning i sub-G1 fase blev set (figur 5C, D). For at bestemme om kastrationsniveauer resistente cellelinier er mere følsomme over for NU9056 som foreslået af GI

50 bestemmelse en sammenligning af LNCaP-celler med LNCaP-AI og LNCaP-CdxR celler efter behandling med NU9056 i 24 timer blev udført. Faktisk LNCaP-AI og LNCaP-CdxR celler synes at være mere følsomme over for NU9056 end LNCaP celler som vist ved en større befolkning være i Sub-G1 fasen af ​​cellecyklus (figur 5E). Ved hjælp af LNCaP GI

75 dosis (36 uM) en signifikant stigning i Sub-G1 blev set i LNCaP-AI-celler (p = 0,036) sammenlignet med LNCaP-celler. Lignende tendenser blev set for LNCaP-CdxR selv om dette ikke var statistisk signifikant (p = 0,1679).

(A) LNCaP-celler blev podet på 6 brønde i 24 timer, og derefter stigende doser af NU9056 blev anvendt til ( i) 24 timer, (ii) 96 timer eller (iii) GI

25 (17 uM) eller (iv) GI

50 (24 uM) blev påført over 4 dage. Alle celler blev opsamlet og fikseret med Cytofix /cytoperm (BD) derefter caspase 3 og caspase 9 assaykits (BD) blev anvendt til at vurdere deres aktivitet ved flowcytometri. Fluorescens blev detekteret på FL-1 kanal i FACSCAN. (B) Analyse af SubG1 population blev udført på disse samme celler ved anvendelse af propidiumiodid for at farve cellulært DNA. LNCaP-celler podedes på plader med 6 brønde i 24 timer, derefter NU9056 blev ansøgt om (C) 1 eller (D) 4 dage. (E) LNCaP, LNCaP-AI og LNCaP-CdxR celler blev podet ud på plader med 6 brønde og NU9056 blev påført i 24 timer. Analyse af SubG1 blev udført som beskrevet ovenfor. Alle celler blev opsamlet og fikseret med Cytofix /cytoperm (BD) derefter cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse propidiumiodid at farve cellulært DNA. Alle FACS data blev analyseret ved hjælp WinMDI. Alle eksperimenter blev udført 3 gange, og middelværdien ± standardfejl er vist. * P-værdi 0,05; ** P-værdi 0,005; *** P-værdi. 0,001

NU9056 Behandling Reducerer PSA Expression i LNCaP Celler

TIP60 er blevet rapporteret som en AR co-aktivator [31], som spiller en rolle i CaP udvikling. For at bekræfte rolle TIP60 i PSA-ekspression, blev siRNA anvendes til knockdown TIP60 niveauer i LNCaP-celler og PSA mRNA-niveauer overvåges som svar på androgen (dihydrotestosteron (DHT)) stimulation. I nærvær af en ikke-silencing siRNA PSA blev induceret ved cirka 10 gange som respons på DHT (figur 6A). Men efter knockdown af TIP60 (figur 6B) kun en 2,5 gange stigning blev observeret, (figur 6A). At undersøge virkningerne af NU9056 på AR-funktion, blev LNCaP-celler behandlet med 24 pM NU9056 over en periode på 48 timer, hvorefter niveauet af AR og PSA-protein blev vurderet ved Western blotting. Derudover undersøgte vi niveauerne af p53 og dets målgenet p21, som p53 er også et mål for TIP60. Vi opdagede, at niveauerne af både AR og p53 blev reduceret efter 24 timer ved 2- og 3-fold henholdsvis og at produkter af målgener, p21 og PSA, blev også reduceret med 3 og 2 gange (figur 6C, D). Dette resultat tyder på, at ja TIP60 er involveret i AR og p53 signalering i denne cellelinie, og at NU9056 kan, ved at modulere TIP60 acetylering aktivitet, påvirker disse vigtige downstream mål.

For at bekræfte effekten af ​​TIP60 på androgen receptor aktivitet vi brugte 2,5 nM siRNA målrettet mod TIP60 i LNCaP celler, eller ikke-lyddæmpende kontrol. Knockdown blev opnået efter 48 timer i steroid forarmet medium hvorefter 10 nM DHT blev anvendt til at inducere androgen receptor aktivitet og PSA-ekspression. RNA blev opsamlet efter 24 timer DHT-stimulering, revers transkription og real-time PCR udført. Ekspression af (A) PSA og (B) TIP60 blev normaliseret i forhold til HPRT1 ekspression. (C) LNCaP-celler blev behandlet med 24 pM NU9056 over 48 timer, og proteinprøver blev opsamlet i SDS-prøvebuffer. Protein-analyse blev udført ved hjælp af SDS PAGE og Western blotting for p53, p21, AR, PSA og alfa tubulin. (D) Densitometri blev udført på Western blots. Alle forsøg blev udført to gange, og middelværdien ± standardafvigelse er vist.

NU9056 Hæmmer DNA skade responset i prostatacancerceller

TIP60 vides at spille en rolle i DNA beskadigelse respons [25]. Ved udsættelse for IR TIP60 aktiveres, hvilket resulterer i acetylering af histon-proteiner og aktivering af ATM og p53 [4]. For at teste om NU9056 kunne hæmme DNA beskadigelse respons via hæmning af TIP60 Acetylase aktivitet, blev aktivering af ATM vurderet ved Western blotting som respons på IR efter forbehandling med NU9056. Som svar på IR blev Patm niveauer steget dramatisk inden for 10 minutter. Over tid Patm niveauer gradvist faldt. Men i nærværelse af NU9056 dette fald var meget hurtigere (figur 7A). Som svar på IR niveauer af TIP60 protein stabiliseret resulterende i akkumulation. Celler, der var forbehandlet med NU9056 viste ikke TIP60 akkumulation (Figur 7B), hvilket kan forklare højere omsætning Patm niveauer.

For at demonstrere hæmning af TIP60 aktivitet ved NU9056, niveauer af Patm, TIP60 og γH2AX blev undersøgt i afhængighed af IR i nærvær og fravær af lægemiddel. LNCaP-celler blev behandlet med 24 pM NU9056 eller vehikelkontrol i 1 time før 0,5 Gy IR. Proteinlysater blev opsamlet på forskellige tidspunkter post-IR og analyseret ved Western blotting for (A) Patm og (B) TIP60 niveauer. (C) 293T, (D) LNCaP og (E) LNCaP-CdxR celler blev forbehandlet med NU9056 (24 uM) eller kontrol i 1 time før 2 Gy IR køretøj. Celler blev fikseret og farvet for γH2AX foci over tid og foci bestemt ved immunofluorescens for 293T-celler og flowcytometri for LNCaP og LNCaP-CdxR. Forsøgene blev gentaget 3 gange med repræsentative viste billeder og kvantificerede data vist som middelværdier% celler farvet for γH2AX ± standardafvigelse.

TIP60 acetylase aktivitet er nødvendige for at lette ubiquitinligase UBC13-medieret ubiquitinering og efterfølgende destruktion af γH2AX [32]. Derfor vil inhibering af TIP60 acetylase aktivitet forhindre nedreguleringen af ​​γH2AX signal. For at teste dette, blev 293T-celler behandlet med NU9056 (24 uM) eller kontrol i 1 time før IR (2 Gy) eksponering køretøj. Cellerne blev derefter fikseret og γH2AX foci visualiseret ved immunofluorescens. I forhold til kontrol køretøj blev γH2AX dannelse stadig tydeligt beriget så meget som 24 timer efter IR stimulering (figur 7C) tyder på, at reparationen af ​​DNA-skader er svækket. Dette ses også i LNCaP og LNCaP-CdxR celler, som blev vurderet ved flowcytometri for γH2AX. I LNCaP-celler, antallet af foci signifikant højere efter 24 timers restitution i nærværelse af inhibitor (p = 0,0277) (fig 7D), mens det i LNCaP-CdxR celler en signifikant forskel ses efter 4 timers restitution (p = 0,0324) ( Figur 7E). En stigning i γH2AX ses også på 24 timers restitution, men viste sig ikke at være statistisk signifikant.

Diskussion

Protein acetylering, som en reguleringsmekanisme, viser sig at være vigtig i mange cellulære veje , ikke blot gentranskription via histon modifikation. Begge sæt af enzymer, der er ansvarlige for regulering af acetylering, hatte og HDAC, er de-reguleret i sygdomstilstande. Derfor målretning begge typer af enzymer med småmolekylære inhibitorer som en terapeutisk strategi er gyldig. Hæmmere mod HDAC’er har vist sig at være en succes i kliniske forsøg; Men HAT-hæmmere er på et tidligere udviklingstrin. For nylig har der været nogle formodede HAT-hæmmere, der er beskrevet, selv om ingen synes i stand til at skelne væsentligt mellem de forskellige HAT familiemedlemmer og ingen er blevet specielt udviklet mod TIP60, en HAT enzym, der ser ud til at spille en særlig rolle i CaP udvikling og progression. For at løse dette punkt, vi identificeret en HAT-hæmmer, ved hjælp af HTS og målrettet sammensatte syntese, som hæmmer TIP60 frem for andre HAT enzymer.

Kravet til fuldt ud at validere HTS hits gennem resyntesen er bredt accepteret som materiale i kommercielle sammensatte samlinger kan omfatte uidentificerede urenheder, eller kan forringe ved lagring, typisk som frosne DMSO-opløsninger, der giver falske positiver. I dette tilfælde en litteratur syntese for 1 var ikke tilgængelige og en rute måtte blive udviklet. forsøgt Den første ordning (del 1) gav ikke målforbindelser, 1 eller dens desmethyl analog; dog blev isocyanat og disulfid analoger 4-7 forberedt. Forbindelse 1 blev forberedt med succes via en alternativ rute (del 2).

Den biologiske aktivitet observeret for de disulfider 5 og 7 (NU9056), fik os til at undersøge aktiviteten af ​​andre simple aromatiske og heteroaromatiske disulfider. Interessant, disse forbindelser var blottet for TIP60 inhibitorisk aktivitet, hvilket indikerer, at TIP60 hæmning ikke alene på grund af tilstedeværelsen af ​​disulfidgruppen. Tilsvarende bromthiophen analoge isothiazol 1 var inaktivt.

Isothiazoloner er tidligere blevet rapporteret at målrette acetylase aktivitet af mange HAT enzymer, herunder p300 og PCAF [24]. Men en specifik inhibitor for TIP60 ikke er blevet beskrevet,. Der er mange fordele at hente ved at målrette dette protein på grund af de forskellige cellulære processer, hvori TIP60 er impliceret. For eksempel, ikke alene denne proteinfunktion at øge den transkriptionelle aktivitet af AR og p53, men det kan også spille en rolle i DNA-reparation, hvor det kan acetylere histonproteiner at markere lokaliteter af DNA-skader og aktivere ATM [25].

i denne rapport har vi udarbejdet en isothiazolonforbindelsen, NU9056 (7), der er målrettet TIP60 HAT aktivitet selektivt resulterer i reduceret acetylering af histon proteiner

in vitro

. har vist sig TIP60 der skal udtrykkes afvigende i en række cancere, herunder prostata og hudkræft. Konkret kan TIP60 acetylere AR, en central transskription faktor i CaP, at fremme øget AR transkriptionel aktivitet [6] og TIP60 udtryk har også vist sig at korrelere med sygdomsprogression [14]. Således målrette acetylase aktiviteten af ​​dette protein kan være til gavn for patienter, der lider med kastrationsniveau modstandsdygtig CaP der ikke længere reagerer på androgen afsavn terapi. Derfor, for at teste evnen af ​​NU9056 at inhibere HAT-aktivitet i celler, vi har brugt CaP-cellelinje-modeller. I disse cellelinjer har vi vist den inhiberende virkning af NU9056 mod HAT aktivitet TIP60. Endvidere blev fundet acetylering af ikke-histon proteiner såsom tubulin at blive reduceret i disse cellelinjer som reaktion på NU9056. Interessant, niveauet af AR og p53 faldt en smule efter NU9056 behandling i LNCaP celler understøtter tidligere rapporter, at acetylering forbedrer stabiliteten af ​​disse proteiner [33], [34]. På grund af betydningen af ​​AR og p53 og deres tilstedeværelse i LNCaP-celler, kan dette forklare, hvorfor både apoptose forøges, og proliferation reduceres som reaktion på NU9056 i en koncentration og tid afhængig måde. Alligevel er der forskelle i følsomhed mellem forskellige CaP cellelinier, som ikke alene kan forklares ved AR eller p53 status. Sidstnævnte observation tyder på, at aktiviteten af ​​TIP60 mod AR og p53 er ikke en medvirkende faktor til den cellulære respons på lægemidlet. som reaktion på DNA-beskadigende IR, som aktiverer acetylase aktivitet af TIP60, finder vi imidlertid, at NU9056 inhiberer udviklingen af ​​Patm signal og hæmmer stabilisering af TIP60 selv, potentielt via hæmning af auto-acetylering. Endvidere NU9056 svækker celleoverlevelse som respons på IR og forringer fjernelse af γH2AX varemærket potentiel hindring DNA-reparation.

Interessant cellelinje modeller af kastrationsniveau resistens synes at være mere følsomme over for NU9056. Øget niveauer og stabilitet TIP60 i androgen-ufølsomme celler, på grund af kronisk vækst i androgen poleres betingelser, er blevet rapporteret i andre lignende cellelinje modeller [35], humane CaP xenografter og biopsi prøver fra kastrationsniveauer resistente patienter [14]. Det er muligt, at androgen-ufølsomme celler er mere afhængige af TIP60 niveauer for deres vækst, i forhold til deres androgen lydhør modparter, hvilket resulterer i større følsomhed over for NU9056. Faktisk indledende undersøgelser viser, at niveauerne af TIP60 protein varierer mellem de testede cellelinjer, med flere NU9056 følsomme cellelinjer, CWR22rv1 og LNCaP-CdxR demonstrerer de højeste niveauer af TIP60. Forskelle i enzymaktivitet TIP60 mellem cellelinier kan også være vigtig. Denne hypotese bør være fuldt afprøvet i fremtidige undersøgelser i en række cellelinjer og

in vivo

modelsystemer til endegyldigt afgøre den mekanisme af følsomhed. Med hensyn til om NU9056 er generelt toksisk for cellerne; vi mener, at det er usandsynligt for det meste. For det første var der ingen ændring i γH2AX farvning når NU9056 blev påført celler tyder ingen induktion af DNA-beskadigelse. Dels forskellige virkninger blev set afhængigt af cellelinjen tyder generelt toksicitet ikke var årsag til skadelige cellulære virkninger.