PLoS ONE: Analyse af væv og Serum MicroRNA Expression i patienter med øvre urinveje urothelial Kræft

Abstrakt

Introduktion

MikroRNA’er spille en vigtig rolle i mange humane maligniteter; hidtil, forbliver deres udtryk, der skal undersøges i øvre urinveje urotelial kræft (UUTUC).

Materialer og metoder

Udtrykket af elleve mikroRNA (miR-10a, miR-21, miR- 96, miR-135, miR-141, miR-182, miR-200b, miR-205, miR-429, miR-520B, miR-1244) tidligere vist sig at være opreguleret i urotelial blærekræft blev undersøgt i tilsvarende normale og kræft vævsprøver fra patienter, der gennemgår nephroureterectomy for UUTUC. Opreguleres microRNA blev derefter målt i serumprøver fra patienter med UUTUC og patienter med ikke-maligne urologiske sygdomme at vurdere deres potentiale som ikke-invasive biomarkører for UUTUC.

Resultater

MicroRNA udtryk tilladt differentiering af normalt og kræft væv: miR-21, miR-96, miR-135, miR-141, miR-182, miR-205, miR-429 og miR-520B signifikant overudtrykt. Endvidere blev miR-205 opreguleret i dårligt differentierede UUTUC. Analysen af ​​cirkulerende RNA i serum viste en stigning på MIR-141 i patienter med UUTUC; receiver operatør karakteristisk analyse viste et område under kurven for 0,726 for miR-141 som et diagnostisk biomarkør. Desuden observerede vi lavere niveauer af miR-10a og miR-135 i UUTUC patienter.

Konklusioner

MicroRNA udtryk er ændret i UUTUC. Analysen af ​​cirkulerende miR-141 kan være nyttigt at identificere patienter med UUTUC

Henvisning:. Kriebel S, Schmidt D, Holdenrieder S, Goltz D, Kristiansen G, Moritz R, et al. (2015) Analyse af væv og Serum MicroRNA Expression i patienter med øvre urinveje urothelial Cancer. PLoS ONE 10 (1): e0117284. doi: 10,1371 /journal.pone.0117284

Academic Redaktør: Georgios Gakis, Eberhard-Karls Universitet, TYSKLAND

Modtaget: 13. april, 2014 Accepteret: December 20, 2014; Udgivet: 28 januar 2015

Copyright: © 2015 Kriebel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. indsamlingen af ​​serum og vævsprøver på Universitätsklinikum Bonn blev udført inden for rammerne af den Biobank initiativ i Centrum für integrierte Onkologie (CIO) Köln Bonn ( https://www.cio-koelnbonn.de/mediziner/biobank/), der er støttet af Deutsche Krebshilfe. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

urothelial carcinoma er en af ​​de mest almindelige humane maligniteter [1]; omkring 5-10% af disse urothelial karcinomer er placeret i de øvre urinveje (UUTUC, pyelocaliceal hulrum og ureter). Selvom ætiologien af ​​UUTUC og blærekræft er ens, naturhistorie UUTUC adskiller sig fra blærekræft: UUTUC er ofte invasive på diagnosetidspunktet, og dermed er prognosen dårligere. Adskillige prognostiske faktorer (dvs. etape, kvalitet, lymfeknude invasion, lymphovascular invasion, tumor placering) er blevet identificeret [2]. Alligevel forbliver vanskelig forudsigelsen af ​​det kliniske forløb af en specifik patient, som alle de ovenfor nævnte faktorer kun kan bestemmes postoperativt. Identifikationen af ​​en præoperativ markør, dvs. en serum biomarkør, ville være nyttigt at tillade bedre risiko lagdeling [3].

MikroRNA’er er små, ikke-kodende RNA-molekyler, der modificerer udtryk for mange menneskelige gener og dermed regulere vigtige cellulære funktioner som cellecyklus, udvikling, apoptose og differentiering [4]. Ekspressionsprofil undersøgelser viste tumorspecifik microRNA ekspression. En nylig undersøgelse viste forskellige microRNA ekspressionsprofiler i normalt nyrevæv, UUTUC og renalcellecarcinom imidlertid UUTUC blev ikke sammenlignet med normale urotelial væv [5]. På grund af lighederne af UUTUC og urotelial cancer i blæren, er det sandsynligt, at microRNA ekspression ligeledes ændres. MikroRNA’er kan påvises i en række af legemsvæsker, herunder serum [6]. Stabiliteten mod nedbrydning af RNaser og ydre påvirkninger (pH-ombygning, opbevaring, fryse /optøning) kvalificerer cirkulerende microRNA som ikke-invasive biomarkører [7,8]. Som følge heraf er serum microRNAer været undersøgt i mange maligniteter (f.eks blærecancer [9], nyrecancer [10], prostatacancer [11], testikelkræft [12]).

For at undersøge rolle microRNA som ikke-invasive biomarkører i patienter med UUTUC, ekspressionen af ​​elleve microRNA (mIR-10a, mIR-21, mIR-96, mIR-135, mIR-141, mIR-182, mIR-200b, mIR-205 , blev analyseret mIR-429, mIR-520B, mIR-1244) tidligere vist at være opreguleret i urotelial blærekræft [13-20], [11] i tilsvarende normale ureter og UUTUC væv. Derefter undersøgte vi serum niveauer af disse mål microRNA med den højeste opregulering i patienter med UUTUC og patienter med ikke-maligne urologiske sygdomme, at udforske deres diagnostiske /prognostiske potentiale.

Materialer og metoder

2.1. Prøvetagning

Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra den enkelte og undersøgelsen blev godkendt af den lokale etiske komité (godkendelsesnummer: 036/08 og 049/13). Prøvetagning blev gennemført fra 2005-2012 (væv) og 2008-2013 (serum). De kliniske-patologiske parametre i undersøgelsen kohorten er angivet i tabel 1.

2.2. Vævsprøver

miRNA niveauer i kræft vævsprøver fra 47 patienter, der gennemgår nephroureterectomy ved Urologisk afdeling på University Hospital Bonn blev undersøgt. Histologisk normal ureter væv var tilgængelig fra 36 disse patienter. Prøverne blev fikseret i formalin, indlejret i paraffin og arkiveres i Patologisk Institut ved University Hospital Bonn.

Ved hjælp af en mikrotom, 5 til 10 sektioner (20 um) blev produceret fra hver paraffin blok. Snittene blev nedsænket i opvarmet vand og anbragt på objektglas. Efter tørring i 24 timer blev prøverne deparaffineret hjælp xylol og fortyndingsserie af ethanol. På grundlag af hæmatoxylin-eosin farvede sektioner, hvor tumor og normalt væv blev markeret på forhånd, blev en makro-dissektion gjort, adskillelse tumoren og tilstødende normale urotelial vævsprøver ( 1 cm fra hinanden)

. totalt RNA blev derefter ekstraheret under anvendelse RECOVERALL samlede Nucleic Acid Isolation Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) som anbefalet af producenten. Det endelige elueringsvolumen var 50 pi. Mængde og renheden af ​​RNA blev bestemt ved anvendelse af NanoDrop 2000 spektrofotometer (PeqLab, Erlangen, Tyskland). Revers transkription blev udført under anvendelse af miScript II RT Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentgaranti instruktioner med 400 ng RNA (fortyndet i et samlet volumen på 12 pi). cDNA blev endelig fortyndet til en koncentration på 5 ng /pl i HiSpec-buffer.

2.3. Serumprøver

Vi prospektivt indsamlede blodprøver på de urologiske afdelinger på universitetshospitalerne Bonn (n = 10) og Münster (n = 34). De serumprøver blev håndteret i overensstemmelse med de standardprocedurer, der i biobanken initiativer. Som en kontrol, en alder matchede kohorte af 34 individer med ikke-maligne sygdomme (benign prostata hyperplasi, urethral striktur, inkontinens, sten i urinvejene) undergår mindre urologiske operationer blev anvendt. Veneblod blev taget i Serum S-Monovette Gel rør med koagulation aktivator (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) før operation. Efter mindst 60 minutter blev clotted serum centrifugeret (10 min, 2500 g), separeret og opbevaret i kryorør ved -80 ° C indtil anvendelse.

Totalt RNA blev isoleret fra 400 pi serum ved anvendelse af Mirvana PARIS Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), efter tilsætning af 25 fmol af det syntetiske miRNA cel-mIR-39 (Qiagen, Hilden, Tyskland), som muliggør en kvantificering af RNA-isolering effektivitet. Ekstraktionen blev udført ved at følge producentgaranti protokol. Final elueringsvolumen var 50 pi. Revers transkription blev udført under anvendelse af miScript II RT Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Forud for real-time PCR, blev en forforstærkning gjort for at opnå tilstrækkeligt materiale (miScript Preamp PCR Kit, Qiagen, Hilden, Tyskland), som indledende test viste, at serum microRNA niveauer var for lavt til direkte kvantificering. Forstærkertrinene blev udført ifølge den producentgaranti protokol, anvendelse af de følgende cykliseringsbetingelser: Initial aktiveringstrin (95 ° C, 15 minutter), 2-trins cykling (denaturering 94 ° C i 30 sekunder, annealing og forlængelse 60 ° C i 3 minutter) med 12 cykler.

2.4. Kvantitativ realtids-PCR

Alle PCR-forsøg blev udført i tredobbeltbestemmelse med 10 pi hver på en ABIPrism 7900HT (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i plader med 384 brønde vha miScript SYBR Green PCR-kittet (Qiagen, Hilden, Tyskland). Alle PCR-primere blev indkøbt fra Qiagen. Hver kørsel inkluderet cellelinien RT112 som positiv kontrol samt vand, ingen-RT, TE puffer og genomisk DNA som negative kontroller (forforstærket for serum PCR-runs). En seriefortynding af RT112 tilladt os at måle PCR amplifikation effektiviteten af ​​hver PCR-kørsel. PCR blev udført ifølge følgende protokol: 1.Hot Start (95 ° C, 15 minutter), 2.Denaturation (94 ° C, 15 sekunder), 3.Annealing (55 ° C, 30 sekunder), 4.Extension (70 ° C, 30 sekunder). Hver kørsel bestod af 40 cykler af trin 2 til 4. smeltekurveanalyse bekræftede specificiteten af ​​PCR-produkterne. MiRNA niveauer i prøver med CK-værdier 35 blev betragtet som nul; outliers med Cq forskel inden tre eksemplarer 1 blev udelukket. PCR blev analyseret med SDS Relativ Kvantificering Software v2.4 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) og QBase + v2.5 (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgien). De individuelle microRNA udtryk data leveres i S1 tabel (væv undersøgelse) og S2 Table (serum undersøgelse).

MicroRNA udtryk i væv blev normaliseret mod RNU1-4, SNORD43 og SNORD48. MicroRNA udtryk i serum blev normaliseret mod RNU1-4 og SNORD43, da SNORD48 ikke pålideligt kan måles i serum. Egnetheden af ​​disse RNA’er som henvisning genet blev påvist tidligere [21].

2.5. Statistisk analyse

Mann-Whitney-U-test og Kruskal-Wallis-testen blev anvendt til at evaluere forskelle mellem kræftpatienter og raske kontroller og at associere microRNA ekspression med kliniske-patologiske parametre som passende. Modtager Operator Curve (ROC) analyser blev udført for at bestemme følsomheden og specificiteten af ​​microRNA som diagnostiske biomarkører; den Youden indekset blev anvendt til at identificere den optimale tærskelværdi. Statistisk signifikans blev indgået ved p 0,05, og Bonferroni korrektion for multiple test hypotese blev udført (væv eksperimenter p 0,0045, serum eksperimenter p 0,0063). Unsupervised tovejs hierarkisk klyngeanalyse med euklidisk afstand blev udført for at klassificere tumor og normal urothelial vævsprøver. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS Statistics V21 (IBM, Chicago, Illinois, USA).

Resultater

3.1 Analyse af microRNA ekspression i øvre urinveje urotelial kræftvæv

MicroRNA udtryk er ikke blevet undersøgt i UUTUC væv hidtil. Vi bestemt således udtryk for elleve microRNAer tidligere vist sig at være overudtrykt i urotelial blærekræft i 47 UUTUC vævsprøver og 36 tilsvarende prøver af histologisk normale urinlederne. Vi observerede en væsentlig overekspression af miR-21, miR-96, miR-135, miR-141, miR-182, miR-205, miR-429, miR-520B (alle p 0,001) i UUTUC; Den microRNA miR-10a (p = 0,012) og miR-200b (p = 0,006) viste en tydelig tendens til opregulering, hvorimod miR-1244 (p = 0,600) var ens i normalt og malignt væv. MIR-205 (p = 0,002) blev opreguleret i udifferentieret UUTUC (G3 vs. G2 /G1). Se Fig. 1.

log2-fold-ændring blev anvendt til at konstruere den Heatmap hvilket indikerer, at en microRNA udtryk profilering tillader differentiering af normal ureter og urothelial karcinom væv. Prøverne fra normal urotelial væv er kodet med “N”, kræft prøver med “T”. De boxplot diagrammer angiver relative niveauer af hvert mål microRNA.

3.2 Analyse af cirkulerende serum microRNA’er i øverste kræft urinvejene patienter

Vi næste undersøgt serumniveauer af kandidatlandenes microRNA’er identificeret under væv profilering: serumprøver fra patienter med UUTUC (n = 44) i forhold til patienter med ikke-maligne urologiske sygdomme (n = 34) blev behandlet på to tertiære indbringelsen klinikker blev undersøgt. De microRNA ekspressionsniveauer i serum vises i fig. 2. miR-141 blev cirkulerer på betydeligt højere niveauer (p 0,001) i serum af UUTUC patienter end i kontrolgruppen (middel 1,30 vs. 0,69). ROC analyse viste en AUC på 0,726 (95% konfidensinterval 0,609-0,843) for miR-141 som diagnostisk biomarkør; se fig. 3 og tabel 2. MIR-200b (p = 0,041), MIR-205 (p = 0,008), MIR-425 (p = 0,025), MIR-96 (0,013) viste en tendens til højere niveauer hos cancerpatienter, men p-værdien var 0,0065, som blev defineret som signifikansniveau efter korrektion for multiple test hypotese. miR-182 (p = 0,083), miR-21 (p = 0,532) og miR-135 (p = 0,261) var ens i UUTUC patienter og kontroller.

Mann-Whitney-U test blev anvendt til evaluere forskelle mellem grupperne. Vejviser

Så vi korreleret serum microRNA niveauer med klinisk-patologiske parametre. Serum MIR-10a (p = 0,003) blev reduceret i muskel-invasiv UUTUC (PTA /PT1: 1,79 vs. pT2-4: 0,79). miR-135 viste også en tendens til lavere niveauer i kræftpatienter med muskel-invasive tumorer (2,18 vs. 0,96; p = 0,040). Vi har ikke observere en sammenhæng med alder, køn, metastaser eller sortering (alle p 0,05). Og cirkulerende microRNA niveauer

Diskussion

Interessen for microRNA steget dramatisk i de seneste år, og væv og tumor-specifikke udtryk profiler er blevet karakteriseret. I betragtning af de ligheder urotelial kræft i blæren og de øvre urinveje, vi udført en litteratursøgning for at identificere et sæt dysregulerede microRNA’er i blærekræft [13-19], som er af interesse for ekspression profilering i UUTUC væv og serumprøver. For ganske nylig har væv microRNA udtryk profiler i UUTUC blevet offentliggjort [5,22]: Antallet af UUTUC prøver (n = 5) var meget lille og ikke i forhold til den normale urotelial væv [5], eller undersøgelsen var begrænset til maligne prøver [22].

Vi først observeret, at microRNA udtryk profiler tilladt karakteristiske kræft og normale ureter /nyrebækken prøver med stor nøjagtighed. Især miR-21, miR-96, miR-135, miR-141, miR-182, miR-205, miR-429 og miR-520B blev tydeligt overudtrykt i UUTUC. Interessant, dette til dels overlapper microRNA udtryk profil tidligere etableret i et prostatakræft studie, hvor miR-205, miR-96 og miR-182 blev fundet særligt reguleret [23]. Vi kunne også bekræfte lignende molekylære carcinogenese af urothelial kræft i blæren og de øvre urinveje som opregulering af mange microRNA’er tidligere identificeret som oncomirs i blærekræft blev også set i UUTUC [13-19]. For nylig Zaravinos et al. [20] undersøgte microRNA udtryk i normale nyrevæv og nyre tumorer (renalcellecarcinom og UUTUC): 21 microRNA blev specifikt dereguleret i UUTUC (5 microRNA’er opreguleres og 16 microRNA’er nedreguleret-the UUTUC profil var forskellig fra vores mål microRNA’er); MIR-10a, MIR-200b og MIR-205 blev opreguleret sammenlignet med nyrevæv. Det skal bemærkes, at manglen på normale urothelial væv som passende kontrol begrænser informationsværdi (urothelium særligt udtryk er ikke kontrolleret) [20].

Vi næste undersøgte serum niveauer af disse microRNA i et to-center -cohort af patienter med UUTUC og ikke-ondartede sygdomme. Vi observerede en betydelig forøgelse af miR-141 i UUTUC patienter: gennemsnitlige niveauer var næsten dobbelt så højt sammenlignet med kontroller; flere andre kandidater (miR-200 mia, mir-205, miR-425 og MIR-96) viste også en tendens til øgede niveauer i UUTUC patienter. ROC-analyser viste, at miR-141 tilladt at skelne UUTUC patienter og kontroller med en AUC på 0,726 (sensitivitet 71% og specificitet 74%) angiver, at cirkulerende miR-141 er en egnet diagnostisk biomarkør. Så vidt vi ved, er dette den første beskrivelse af en nukleinsyre biomarkør i blodet hos patienter med UUTUC. I en tidligere undersøgelse af patienter med urotelial blærecancer, blev en betydelig stigning i MIR-141 i serum fra cancerpatienter ikke observeret, selvom en tendens til højere MIR-141 niveauer sammenlignet med kontrolindivider kunne ses [9]. Stage og kvalitet kunne forklare denne forskel: høje serum miR-141 niveauer blev observeret i mange undersøgelser i fremskredne stadier [24,25] eller patienter med recidiv efter kirurgi [25-27]; dog var miR-141 ikke korreleret med nogen prognostisk parameter i vores undersøgelse om UUTUC. Fundet af øget urin miR-141 hos patienter blærekræft støtter tanken om miR-141 som et diagnostisk redskab [28]. Det skal bemærkes, at cirkulerende MIR-141-niveauer er forhøjede i multiple tumor enheder herunder prostatacancer [25], tyktarmskræft [29] og livmoderhalskræft [30]. En overekspression af miR-141 er involveret i KEAP1-regulerede cisplatin resistens [31], og dermed miR-141 målinger kunne være nyttigt for overvågning af patienter, der gennemgår cisplatin kemoterapi for metastatisk UUTUC. Den TarBase 6.0 [32], en database med eksperimentelt validerede microRNA-gen interaktioner, indikerer, at miR-141 regulerer forskellige gener (f.eks PTEN [33], ERBB2IP [34], HOXB5 [34], E2F3 [33], cyklin D1 [33]) er involveret i urotelial carcinogenese (database forespørgsel:. 2014/06/03)

mIR-205 væv niveauer blev også korreleret med udifferentieret UUTUC, og miR-10a og miR-135 blev nedsat i serum af patienter med muskel-invasiv UUTUC. Tumor kvalitet og scene er normalt korreleret i urotelial kræft, og dermed ville man forvente signifikante korrelationer med stadium (miR-205) eller klasse (miR-10a, miR-135), hhv. Flere forklaringer er mulige:

(i)

visse biologiske processer fremkalde microRNA ændringer i senere stadier af carcinogenese; (

ii

) tre (ud af ti) patienter med ikke-muskel invasiv sygdom havde G3 svulster, og dermed begrænse korrelationen af ​​scenen og kvalitet; og (

iii

) en konstatering tilfældigt kan ikke udelukkes. Således kunne analysen af ​​microRNA være nyttig til prognostiske formål, omend der er brug fremtidige undersøgelser for at bekræfte vores resultater. Især blev MIR-205 [35], og MIR-10a [36] er forbundet med overlevelsestiden for patienter med blærecancer. Den seneste rapport fra Izquierdo et al. indikerer, at MIR-149 niveauer i tumorvæv er prædiktive for cancer-specifik overlevelse hos patienter med UUTUC [22]; en analyse af denne microRNA i serum i en kommende undersøgelse vil være af interesse. Men MIR-149 var ikke påviselige i serum fra hverken en patient med prostatacancer eller en rask person, selv om en forforstærkning trin blev anvendes ifølge Mitchell et al. [37], konkluderede, at miR-149 niveauer i blodprøver er kan være for lav til at opdage

En roman biomarkør skal bevise sig mod etablerede markører.; urin cytologi i patienter lider af en dårlig følsomhed [38], selv hos patienter med høj kvalitet UUTUC. Inddragelsen af ​​konjunktiv markører (BTA stat test [39] eller FISH [40]) nærmer kan øge den diagnostiske information betydeligt, men lav kvalitet kræft forbliver vanskelig at opdage. Udførelsen af ​​serum miR-141 ser ud til at være noget lavere i forhold til urinmarkørerne (følsomhed 71%, specificitet 74%), men lignende afsløring satser i muskel-invasive og non-muskel invasiv UUTUC retfærdiggøre fremtidig forskning at udforske sin værdi.

Nogle begrænsninger bør anerkendes: vi sammenlignet microRNA udtryk i kræft og tilstødende normale væv. Selvom det normale væv var histologisk normal og placeret mindst 1 cm fjernt fra tumoren, kunne den såkaldte “field effect” forårsage molekylære ændringer i denne kontrol væv. Men sammenligningen af ​​maligne og normale væv fra de samme patienter minimerer virkningen af ​​interindividuel microRNA ekspressionsforskelle. Prøven størrelse i vores undersøgelse var kun moderat (47 kræft vs 36 normale væv, og 44 UUTUC vs. 34 kontrol serumprøver), men den relative sjældenhed UUTUC forhold til blærekræft eller renalcellecarcinom gøre analysen af ​​store årgange vanskelig .

konklusioner

MicroRNA udtryk dysreguleret i UUTUC væv; disse ændringer fører til ændrede microRNA profiler i patienternes omløb. Påvisningen af ​​øget MIR-141 niveauer muliggør identifikation af patienter med UUTUC; hvis fremtidige undersøgelser bekræfter dette fund, kan måling af serum microRNA’er hjælpe klinikere til at håndtere disse patienter.

Støtte Information

S1 Table. Resumé af væv microRNA ekspressionsniveauerne hos patienter med øvre urinveje urotelial kræft

doi:. 10,1371 /journal.pone.0117284.s001

(XLSX)

S2 Table. Resumé af serum microRNA ekspressionsniveauerne hos patienter med øvre urinveje urotelial kræft

doi:. 10,1371 /journal.pone.0117284.s002

(XLSX)

Tak

Vi takker Jennifer Braunig for kritisk læsning af manuskriptet.