PLoS ONE: Cigarette Smoke Fremkalde C /EBP-β-medieret aktivering af miR-31 i normalt humant Respiratory epitel og Lung Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Begrænset oplysninger om mekanismer, som miRNA bidrager til pulmonal carcinogenese. Den foreliggende undersøgelse blev foretaget for at undersøge ekspression og funktion af miRNA fremkaldt af cigaretrøg kondensat (CSC) i normale humane respiratoriske epiteler og lunge kræftceller.

Metode

Micro-array og kvantitativ RT PCR (QRT-PCR) teknikker blev anvendt til at vurdere miRNA og vært genekspression i dyrkede celler, og kirurgiske prøver. Software-styrede analyse, RNA tværbinde immunpræcipitering (CLIP), 3’UTR luciferase reporter assays, QRT-PCR, fokuserede super-arrays og Western blot teknikker blev anvendt til at identificere og bekræfte mål af MIR-31. Chromatin immunoprecipitation (chip) teknikker blev anvendt til at evaluere histon mærker og transkriptionsfaktorer i LOC554202 promotoren. Celletal og xenograft eksperimenter blev anvendt til at vurdere virkningerne af miR-31 om spredning og tumorgenicitet af lungekræft celler.

Resultater

CSC signifikant forøget miR-31-ekspression og aktiveret LOC554202 i normal respiratorisk epitel og lungekræft celler; miR-31 og LOC554202 udtryk varede efter seponering af CSC eksponering. MIR-31 og LOC554202 ekspressionsniveauer blev signifikant forhøjet i lungekræft prøver i forhold til tilstødende normale lungevæv. CLIP og reporter analyser viste direkte interaktion af miR-31 med Dickkopf-1 (Dkk-1) og DACT-3. Over-ekspression af MIR-31 markant formindsket Dkk-1 og DACT3 ekspressionsniveauer i normale respiratoriske epiteler og lungecancerceller. Knock-down af miR-31 steg med DKK-1 og DACT3 niveauer, og ophævet CSC-medierede fald i Dkk-1 og DACT-3-ekspression. Endvidere overekspression af MIR-31 mindsket SFRP1, SFRP4, og WIF-1, og øget Wnt-5a-ekspression. CSC øgede H3K4Me3, H3K9 /14Ac og C /EBP-p-niveauer i LOC554202 promotor. Knock-down af C /EBP-β ophævede CSC-medieret aktivering af LOC554202. Over-ekspressionen af ​​miR-31 væsentligt forbedret proliferation og tumorgenicitet af lungekræft celler; knock-down af miR-31 hæmmede væksten af ​​disse celler.

Konklusioner

Cigaretrøg inducerer ekspressionen af ​​miR-31 rettet mod flere antagonister af kræft stamceller signalering i normal respiratorisk epitel og lungekræft celler . miR-31 fungerer som en OncomiR under human pulmonal carcinogenese

Henvisning:. Xi S, Yang M, Tao Y, Xu H, Shan J, Inchauste S, et al. (2010) Cigarette Smoke Fremkalde C /EBP-β-medieret aktivering af MIR-31 i normal human Respiratory epiteler og Lung Cancer Cells. PLoS ONE 5 (10): e13764. doi: 10,1371 /journal.pone.0013764

Redaktør: Oliver Eickelberg, Helmholtz Zentrum München /Ludwig-Maximilians-Universitetet i München, Tyskland

Modtaget: Juni 1, 2010; Accepteret: 4 oktober 2010; Udgivet: 29 oktober, 2010

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health murene midler. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Genetik samt epigenetisk dysregulering af genekspression under malign transformation skyldes delvis afvigende ekspression af mikro-RNA’er (miRNA) [1], [2]. Disse små (~21-mer) ikke-kodende RNA-molekyler regulerer genekspression ved binding til 3′-utranslaterede regioner (3 ‘UTR) af mål-mRNA’er, udløser transkript nedbrydning eller translationel undertrykkelse afhængigt af omfanget af komplementaritet mellem frø sekvens af miRNA og mRNA-motivet [3]. Ca. 30% af alle mRNA’er er potentielle miRNA mål. Til dato har mere end 800 miRNA blevet identificeret hos mennesker, som hver især målrettet mod flere funktionelt relaterede gener, således mediere komplekse regulerende netværk [3], [4].

En række miRNA har været impliceret i patogenesen af ​​humane lungekræft, langt de fleste, der direkte kan henføres til cigaretrygning [5], [6]. Nogle af disse miRNA fungerer som onkogener (oncomirs), mens andre fungerer som tumorsuppressorer. For eksempel MIR-21, som aktiveres delvist via afvigende EGFR signalering undertrykker ekspression af PTEN og PDCD4, lette proliferation, invasion, og modstandsdygtighed over for apoptose af lungecancerceller [7] – [11]. Aktivering af miR-93, miR-98 og miR-197 hæmmer ekspressionen af ​​FUS1, øge cellecyklusprogression og kemo-modstand i lungekræft celler [12], [13]. Undertrykkelse af MIR-15A og MIR-16, som er målrettet cycliner D1, D2 og E, ophæver Rb-medieret cellecyklusregulering i lungecancerceller [14]. Desuden nedregulering af lad-7 familiemedlemmer rettet adskillige mRNA koder cellecyklus regulerende proteiner såsom Ras, AURKA, AURKB og E2F5 øger proliferation og tumorgenicitet af lungekræft celler [7], [15], [16]. Interessant, flere miRNA ændringer ofte observeret i lungekræft, såsom nedregulering af lad-7 og overekspression af miR-17-92, er påvist i cancer stamceller [17], [18] samt pseudoglandular lungeparenkym [19], hvilket tyder på embryonale omprogrammering af miRNA udtryk under pulmonal carcinogenese.

på trods af de seneste undersøgelser påviser miRNA udtryk profiler korrelerer med tumor histologi, samt rygning status og prognose af patienter med primær lungekræft, [6], [20] – [22], begrænset information om miRNA ændringer, der direkte bidrager til indvielse og tidlig progression af disse maligne sygdomme. I den foreliggende undersøgelse har vi anvendt en in vitro modelsystem til at undersøge miRNA ændringer medieret af cigaretrøg kondensat (CSC) i normalt humant respiratorisk epitel, og lungekræft celler afledt fra rygere samt ikke-rygere. Heri rapporterer vi, at CSC inducerer ekspressionen af ​​miR-31 rettet mod flere Wnt signalering antagonister, herunder Dickkhopf-1 (Dkk-1) og DACT3 i normalt humant respiratorisk epitel samt lunge kræftceller. Disse observationer giver en direkte mekanistisk sammenhæng mellem cigaretrøg og aktivering af en OncomiR undertrykke antagonister af stamceller signalering under tobak-induceret pulmonal carcinogenese.

Materialer og metoder

cellelinjer og behandling betingelser

Alle lungekræft linjer blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA), og opretholdt i RPMI medium suppleret med 10% FCS, 10 mM glutaminsyre, og 1% penicillin /streptomycin. Primære normale humane lille luftvejs-epitelceller (SAEC) og normale humane bronchiale epithelceller (NHBE) blev opnået fra Lonza, Inc (Frederick, MD) og dyrket pr sælger instruktioner. Immortaliserede humane bronkiale epitelceller (HBEC) blev generøst tilvejebragt af John D. Minna (UT Southwestern, Dallas, TX), og dyrket i komplet keratinocyt-SFM medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 5 pg /L epidermal vækstfaktor ( EGF) og 50 mg /l bovin hypofyse (BPE). Cigaretrøg kondensater (CSC) afledt fra Kentucky referencenummer 3R4F forskning blend cigaretter (University of Kentucky) blev fremstillet som beskrevet [23], og resuspenderet ved en koncentration på 1 mg tjære /ml i RPMI, der blev defineret som 10% CSC [24 ]. Til forsøg røg eksponering, celler blev dyrket i 10 cm skåle i egnede normalt medium (NM) med eller uden CSC (1%). Medium blev ændret dagligt med tilsætning af frisk CSC. Cellerne blev subdyrket som nødvendigt, og høstet på forskellige tidspunkter til analyse.

Humane væv

Primære lungekræft prøver og tilstødende histologisk normal lungeparenkym blev høstet inden operativt fra patienter, der gennemgår potentiel kurativ resektioner på NIH intern anmeldelse board-godkendte protokoller, der kræver skriftlig informeret samtykke. Alle væv blev straks snap-frosset med en del af høstet væv sendes til øjeblikkelig histologisk bekræftelse af en uafhængig, anatomisk patolog på en blindet måde. Vævsprøver var bar-kodet og gemt i Thoracic Oncology Laboratory, Surgery Branch, NCI. For microRNA isolation og ekspression analyse blev lille RNA fraktionen isoleret med RT2 qPCR-Grade miRNA Isolation kit (Qiagen, Valencia, CA), og miRNA ekspression blev kvantificeret med QRT-PCR miRNA Detection Kit (ABI, Carlsbad, CA) .

miRNA overekspression og hæmning

Precursor og inhibitor miRNA pMiR-H31PA-1, pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP negative kontrol, MZIP31-PA-1, pGreenPuro Scramble Hårnål negativ kontrol blev købt fra SBI (System Biosciences, Mountain View, CA). miRNA forstadier eller inhibitorer (både ved 50 nM) blev transficeret ind i celler ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Reporter vektorer og DNA-konstruktioner

3’UTR’er af DKK1 (850 bp) og DACT3 (2461 bp) blev PCR amplificeret fra human SAEC cDNA og indsat nedstrøms for CMV-drevne ildflueluciferase kassette i pMIR-RAPPORT vektor (Ambion, Austin, TX) mellem

Hind III

Spel

sites. Mutant reporterplasmider (3 ‘UTR’er af DKK1 og DACT3) blev oprettet ved hjælp af QuikChange steddirigeret mutagenese kit (Stratagene, Wilmington, DE). Alle insert-fragmenter blev bekræftet ved direkte sekventering.

Luciferase miRNA target reporterassays

I miRNA målvalidering, ca. 2 × 10

4 SAEC brønd i 24-brønds plader blev forbigående transficeret med 25 til 50 ng af hver ildflue-luciferase-reporterkonstruktion (Promega, Madison, WI) 150 og 175 ng pcDNA3 tom vektor, 200-ng PrtK-Luc (Promega) som intern kontrol, og 30 pmol af præ-mIR-31 (SBI, Mountain View, CA). Renilla luciferase vektor blev anvendt til at normalisere transfektionseffektiviteten. Ca. 24 timer efter transfektion, ildflue og Renilla luciferaseaktiviteter blev analyseret. Normaliserede relative lysenheder repræsenterer ildflueluciferaseaktivitet /Renilla luciferaseaktivitet.

Proliferationsassay

Celler blev udpladet ved en koncentration på 5 × 10

4 celler per brønd i 24-brønds plader og dyrket i NM med eller uden CSC plus plasmid transfektion. Tredobbelte brønde blev høstet og talt ved trypan blå-udelukkelse teknikker.

Kvantitativ RT-PCR

I mRNA blev totalt RNA fremstillet under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) og genomisk DNA blev elimineret med TURBO DNA- fri Kit (Ambion). Et ug totalt RNA revers transkriberet under anvendelse iScript revers transkriptase (Bio-Rad). Udeladelse af revers transkriptase tjente som en negativ kontrol. cDNA blev amplificeret under anvendelse af Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). PCR blev udført som følger: 5 min ved 94 ° C, 35 cykler af 60 sekunder ved 94 ° C, 60 sekunder ved 57-60 ° C, og 60 sekunder ved 72 ° C, efterfulgt 5 minutter ved 72 ° C. Real-time kvantitativ RT-PCR-analyse blev udført som beskrevet [25] ved hjælp Dkk-1, DACT3, SFRP1, SFRP4, WIF-1, og p-actin primere fra Applied Biosystems eller integreret DNA Technologies (Coralville, IA). For microRNA isolation og udtryk analyse, udtryk for miRNA isoleret med RT2 qPCR-Grade miRNA Isolation (Qiagen) blev kvantificeret med QRT-PCR miRNA Detection Kit (ABI).

chromatin immunoprecipitation (chip)

Celler blev tværbundet med 1% formaldehyd, lyseret og sonikeret på is for at generere DNA-fragmenter med en gennemsnitlig længde på 200-800 bp [26]. Efter pre-clearing, blev 1% af hver prøve gemt som input fraktion. Immunpræcipitation blev udført under anvendelse af antistoffer som specifikt genkender H3K4me3, H3K9Ac, H3K14Ac (Abcam), RNA polymerase II (Upstate) eller IgG kontrol. DNA blev elueret og oprenset fra komplekser, efterfulgt af PCR-amplifikation af LOC554202 promotoren ved anvendelse af primere og betingelser som beskrevet [27].

siRNA og shRNA knockdown

Calu-6 og H841-celler blev forbigående transficeret med siRNA’er rettet mod C /EBP-α og C /EPB-β, eller sham siRNA-sekvenser (Dharmacon, Lafayette, CO) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Målgen knockdown blev bekræftet ved RT-PCR og Western blot-teknikker.

Western blot-analyse

Proteinekstrakter blev dannet som beskrevet tidligere [26]. Prøver blev separeret på 4-12% Tris-glycin SDS-polyacrylamidgelelektroforese geler og blottet på Immobilon P membran (Millipore, Billerica, MA); proteiner blev påvist under anvendelse forøget kemiluminescens påvisningsreagenser (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Antistoffer anvendt til Western analyse blev gede-anti-Dkk-1, muse-anti-DACT3, og gede-anti-β-actin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA). Salg

RT-PCR arrays

Wnt signalering RT-PCR super-arrays (PAH-043A) blev opnået fra SABiosciences (Frederick, MD). 1 ug totalt RNA blev anvendt til revers transkription og hele cDNA reaktionen blev fortyndet og fordelt mellem de 96 brønde i den super-arrayet plade. Reaktionerne blev udført med RT

2 SYBR Green /ROX PCR Master Mix (SABiosciences). Resultaterne blev analyseret ved hjælp af software, som sælgeren https://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php.

MicroRNA microarray analyse

lavmolekylære RNA (små RNA) blev udvundet fra celle plader under anvendelse Mirvana ™ miRNA isolation kit (Ambion, Austin, TX) under anvendelse af miRNA berigelse fremgangsmåden ifølge fabrikantens protokol. Tre hundrede nanogram af små RNA’er fra vævsprøver blev direkte mærket med N-kode miRNA mærkning (Invitrogen) pr sælgerens protokoller. Kort fortalt blev modne miRNA i de små RNA-prøver først tailed med poly (A); Poly (A) hale miRNA blev derefter mærket med et capture-sekvens efterfulgt af hybridisering til Cy5 /Cy3 mærket 3DNA dendrimerer. For microarray databehandling og normalisering, blev microarray chips scannet ved hjælp af en GenePix 4000B scanner (Axon Instruments, Union City, CA) og median spot intensiteter blev genereret ved hjælp GenePix 5.0 (Axon Instruments, Union City, CA). Microarray data blev behandlet og normaliseret (50%) under anvendelse GeneSpring (Agilent, CA). Statistik og klyngedannelse blev udført ved hjælp GeneSpring software. Ekspressionsniveauer af miRNA blev underkastet 2-vejs variansanalyse (ANOVA) for CSC behandlet vs ubehandlede betingelser for de forskellige cellelinier.

Ago CLIP (Identifikation af AGO-1-associerede mRNA’er)

Celler blev høstet og CLIP eksperimenter blev udført under anvendelse af enten anti-AGO familie eller elF2C antistoffer som beskrevet (28). Kort fortalt blev celler tværbundet med bestråling i 400 mJ /cm

2 og yderligere 200 mJ /cm

2 i Stratalinker, og lyseret til at generere RNA /protein (siden) komplekser [28] – [30]. Efter pre-clearing, blev 1% af hver prøve gemt som input fraktion. Immunpræcipitation blev udført under anvendelse af specifikke antistoffer mod enten AGO familie (Millipore, Billerica, MA), eller elF2C (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), eller kontrol IgG. RNA blev isoleret og oprenset fra komplekser, efterfulgt af PCR-amplifikation af 3’UTR’er af MIR-31-mål.

Murine xenograft eksperimenter Salg

Calu-6 og H358-celler transficeret med pCDH-CMV-MCS -EF1-copGFP vektor kontrol og pMiR-H31PA-1 blev suspenderet i PBS i en koncentration på 1 x 10

6 celler /100 pi, og inokuleret subkutant i kontralaterale flanker af athymiske nøgne mus (10 mus pr behandlingsgruppe pr eksperiment ). Musene blev overvåget to gange ugentligt og tumorvolumener blev beregnet på grundlag af vinkelrette diametre. Ca. 21 dage og 35 dage senere for Calu-6 og H358 eksperimenter henholdsvis mus blev aflivet, og vurderet for procent tumoroptagelse, og massen af ​​udskårne xenotransplantater. Derefter blev tumorvæv lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret til fremtidig analyse. Alle dyreforsøg blev godkendt af National Cancer Institute Animal Care og brug Udvalg, og var i overensstemmelse med NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

Statistisk analyse

Forskelle mellem matchede prøver fra samme lungekræftpatienter, såsom tumor og normalt væv blev testet med den underskrevne rank test. Grupper blev sammenlignet med Wilcoxon-Mann-Whitney-test. Konfidensintervaller for forskellen i medianerne mellem to grupper blev beregnet ved bias-korrigeret og accelereret bootstrapping metoder. Forskelle i tumorvolumener mellem modstående flanker af tumorbærende mus blev testet med Wilcoxon-signed rank test ved 5-dages intervaller.

P

værdier blev justeret for multipel testning ved fuldstændig resampling [31]. Konfidensintervaller for medianen af ​​flanke forskelle blev beregnet som eksakte ikke-parametrisk to-tailed konfidensintervaller baseret på Wilcoxon-test.

primersekvenserne

Indsendt som tabel S1.

Resultater

opregulering af miR-31 i dyrkede celler udsat for CSC

Foreløbige forsøg med array-teknikker blev udført for at undersøge miRNA udtryk profiler i et panel af normal respiratorisk epitel ( SAEC og NHBE), immortaliserede humane bronkiale epitelceller (HBEC) og lungecancerceller (Calu-6, H841, H1299, H1650 og H1975) dyrket i normalt medium med eller uden CSC. Denne analyse viste unikke basale miRNA udtryk profiler falder sammen med histologi (normal vs maligne). Desuden lungekræft linjer afledt af rygere (Calu-6, H1299, H841) var let skelnes fra de fra ikke-rygere (H1650, H1975) (M. Yang, manuskript under udarbejdelse).

Af særlig interesse , førnævnte mikro-array-eksperimenter foreslog, at CSC behandling induceret ekspression af miR-31 i normal respiratorisk epitel samt lunge kræftceller. For yderligere at undersøge dette fænomen, udførtes kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) forsøg til at undersøge MIR-31 ekspression i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841 celler dyrket i normalt medium (NM) med eller uden CSC i 5 dage . Disse eksperimenter (Figur 1A) viste, at ubehandlet Calu-6 og H841cells udviste højere endogene niveauer af MIR-31 i forhold til SAEC og HBEC celler; yderligere analyse viste, at fem dage CSC eksponering opreguleret miR-31 udtryk 5.5 gange og 3,6 gange i SAEC og HBEC henholdsvis i forhold til kontrolgruppen. Lignende behandling øget miR-31 udtryk 3.1 og 6.5 gange i Calu-6 og H841 celler, (figur 1B). Tidsforløb eksperimenter afslørede opregulering af miR-31 i SAEC og H841 celler inden 24 timer efter påbegyndelse af CSC eksponering, med udtryk topper og flade ud omkring 96 h senere (figur 1C). Interessant, opregulering af MIR-31 CSC varede ved i 20 dage efter fjernelse af CSC fra dyrkningsmedier (figur 1B).

A) QRT-PCR-analyse af endogen MIR-31-ekspression normaliseret med kontrol miRNA ( RNU44) i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841cells. Basale niveauer af MIR-31 er højere i lungecancere forhold til dyrkede normale eller immortaliserede humane respiratoriske epitelceller. B) QRT-PCR-analyse af MIR-31 ekspression i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841cells dyrket i normalt medium (NM) med eller uden CSC i 5 dage. Øget miR-31-ekspression var tydeligt 20 dage efter seponering af CSC behandling. C) QRT-PCR-analyse demonstrerer tidsafhængig aktivering af MIR-31 i SAEC og H841cells dyrket i NM med eller uden CSC for 0, 12, 24, 48, 72, 96, og 120 timer. D) QRT-PCR-analyse viser miR-31-ekspression i humane lungekræft i forhold til parrede tilstødende normale lungevæv. MIR-31 niveauer i tumorer var højere end tilsvarende normale lunge. Desuden miR-31 niveauer signifikant højere i lungekræft fra aktive /tidligere rygere sammenlignet med dem fra aldrig-rygere.

miR-31-ekspression i primære lungekræft prøver

Yderligere QRT-PCR-forsøg blev udført for at undersøge mIR-31 ekspressionsniveauer i en tilfældigt udvalgt panel af primære ikke-småcellet lungekræft og tilstødende histologisk normal lungeparenkym (kliniske og patologiske data sammenfattet i tabel 1). Som vist i figur 1 D, blev MIR-31 ekspression forøget (middelværdi 4,13 fold; interval fra 1,47 til 12,46 gange) i lungecancere forhold til parrede normale lungevæv. Interessant, miR-31 niveauer i lungekræft fra rygere var højere end observeret hos ikke-rygere (5,2 vs 1,65 fold, henholdsvis; p 0,01). Kollektivt, disse data bekræftede præliminære eksperimenter, der demonstrerer højere niveauer af MIR-31-ekspression i lungekræft celler i forhold til dyrkede normale respiratoriske epiteler (figur 1A), og foreslog, at aktivering af MIR-31 kan være et biologisk relevant fænomen under human pulmonal carcinogenese.

Virkninger af miR-31 om antagonister af WNT signalering

Software-guidet analyse viste, at flere antagonister af Wnt-signalering, herunder Dkk-1 [32] og DACT3 [33] var potentiale miR-31 mål. For at bekræfte disse resultater, SAEC, HBEC, Calu-6, og H841-celler blev transient transficeret med MIR-31. Kvantitativ RT-PCR-forsøg afslørede ~12 gange stigninger i MIR-31-ekspression i MIR-31-transficerede celler i forhold til vektor kontrol (figur 2A). Over-ekspressionen af ​​miR-31 faldt Dkk-1 samt DACT3 (~5-8 fold og ~1.5-7 fold henholdsvis i forhold til kontroller) i disse fire cellelinjer (figur 2B). Disse effekter forekom noget mere udtalt i normal SAEC og udødeliggjort HBEC, muligvis på grund af lavere niveauer af endogen miR-31 og højere niveauer af Dkk-1 og DACT3 i disse celler i forhold til Calu-6 og H841 lunge kræftceller.

A) mIR-31 var over-udtrykt i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841 celler via transient transfektion af primære mIR-31-konstruktionerne. QRT-PCR-analyse bekræftede høj MIR-31 ekspression i MIR-31-transficeret i forhold til kontrol-celler. B) QRT-PCR-analyse af Dkk-1 og DACT3 ekspressionsniveauer i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841 celler med eller uden over-ekspressionen af ​​miR-31. Over-ekspressionen af ​​miR-31 faldt Dkk-1 og DACT3 i alle fire cellelinjer. C) QRT-PCR-analyse demonstrerer nedsatte niveauer af endogent MIR-31 i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841 celler efter transient transfektion af antisense-MIR-31 (Zip-MIR-31) konstruktioner i forhold til kontroller. D) QRT-PCR-analyse af Dkk-1 og DACT3 ekspressionsniveauer i SAEC, HBEC, Calu-6 og H841 celler med eller uden nedregulering af miR-31. Knock-down af miR-31 øger basale niveauer af Dkk-1 og DACT3 i disse celler. E) QRT-PCR-analyse viser, at knockdown af miR-31 delvist blokerer CSC-medieret fald i Dkk-1 og DACT3 i SAEC. F) Western blot analyse af Dkk-1 og DACT3 udtryk i forældrenes og vektor kontrol SAEC og Calu-6 celler, samt SAEC og Calu-6 celler udviser konstitutiv overekspression eller knock-down af miR-31. Densitometri værdier er normaliseret til b-actin kontrol. Dkk-1 og DACT3 niveau blev nedsat, eller noget forbedret i disse celler efter overekspression eller knock-down af miR-31, hhv.

blev gennemført Efterfølgende eksperimenter for at afgøre, om udtømning af endogene miR-31 påvirkede ekspressionen af ​​Dkk-1 og DACT3 i dyrkede respiratoriske epitelceller. Som vist i figur 2C blev MIR-31 ekspressionsniveauer reduceret ~7-10 fold i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841-celler transient transficeret med antisense-MIR-31 (Zip-MIR-31) konstruktioner i forhold til vektor kontrol . Reduktion af miR-31-ekspression øget Dkk-1 samt DACT3 udtryk i disse cellelinjer (~1.47-8 folde og ~4.7-9 fold henholdsvis, figur 2D). Efterfølgende eksperimenter viste, at knockdown af miR-31 betydeligt svækket CSC-medierede fald i Dkk-1 og DACT3 i SAEC samt H841 celler (Figur 2E). I overensstemmelse med ovennævnte resultater, afslørede western blot-analyse, at Dkk-1 og DACT3 proteinniveauer i SAEC og Calu-6 celler blev reduceret med over-ekspression af MIR-31 (figur 2F). I modsætning hertil knock-down af endogen MIR-31 syntes at øge Dkk-1 og DACT3 proteinniveauer i SAEC og Calu-6-celler, selv om disse ændringer ikke korrelerer nøjagtigt med ændringer i mRNA-ekspression, muligvis skyldes til dels, at protein stabilitets- og antistof-affiniteter. Kollektivt, disse eksperimenter kraftigt antydet, at miR-31 modulerer Dkk-1 og DACT3 via post-transkriptionel og translationel-hæmmende mekanismer i dyrkede normale respiratoriske epiteler og lunge kræftceller.

Super-arrays blev brugt til yderligere at undersøge virkninger af mIR-31 om Wnt signalering i SAEC og Calu-6 celler. Denne analyse viste 7-14 fold nedregulering af Dkk-1, samt yderligere antagonister af Wnt-signalering, herunder SFRP1, SFRP4, og WIF1, samt en 5 gange stigning i CTNNB1, TCF7 og Wnt-5a (data om anmodning). Efterfølgende QRT-PCR-forsøg bekræftede undertrykkelse af SFRP1, SFRP4, og WIF-1, og op-regulering af Wnt-5a i SAEC og Calu-6 celler over-udtrykkende miR-31 (figur S1A). Kollektivt, antyder disse data, at miR-31 aktiverer Wnt signalering i dyrkede lungekræft og normale respiratoriske epitelceller.

Dkk-1 og DACT3 er direkte mål kandidater af MIR-31

Yderligere forsøg blev forpligtet sig til at undersøge, om miR-31 direkte interagerer med 3 ‘UTR’er på Dkk-1 og DACT3. Kort fortalt blev RNA tværbinde immunopræcipitation (CLIP) teknikker anvendes til at detektere interaktionen af ​​MIR-31 med disse potentielle mål i SAEC celler [28]. Figur 3A viser de potentielle miR-31 bindingssteder inden for 3 ‘UTR’er på DKK-1 og DACT3 udskrifter. RT-PCR-analyse afslørede, at AGO familie antistof præcipiterede Dkk-1 og DACT3 transkripter i cytoplasmaet af ubehandlet SAEC (figur 3B). Oplagte stigninger i PCR-produkter svarende til 3 ‘UTR’er på Dkk-1 og DACT3 blev observeret i SAEC overudtrykker miR-31; dette fænomen blev ikke observeret i miR-31-forarmet SAEC celler. I disse eksperimenter β-actin tjente som negativ kontrol, da der ikke sekvenser kan målrettes ved MIR-31 (figur 3B). Fordi MIR-21 har vist sig at direkte målrette 3’UTR af PDCD4 humane væv [34], immunopræcipiteret RNA fra SAEC celler over-udtrykkende MIR-21 tjente som en positiv kontrol for CLIP (data ikke vist). I overensstemmelse med førnævnte Wnt SuperArray resultater, yderligere CLIP eksperimenter viste interaktion af miR-31 med SFRP4 (figur S1B).

A) Formodede målområder af miR-31 inden Dkk-1 3’UTR (øverst) og DACT3 3’UTR (nederst). B) miRNA-målrettede transkripter i RISC blev udfældet med AGO familie antistoffer efter UV-induceret krydsbinding af RNA’er til deres bindingsproteiner, efterfulgt af RT-PCR-amplifikation. Over-ekspressionen af ​​miR-31 signifikant øget nedbør på Dkk-1 og DACT3 mål udskrifter i SAEC celler. β-actin tjente som negativ kontrol, da der ikke sekvenser i 3’UTR, som kan målrettes af MIR-31. C) luciferaseassays demonstrerer reduktion i luciferaseaktivitet i SAEC transficeret med pMiR-Rapport vektorer med eller uden indsætning 3’UTR eller muteret 3’UTR af Wnt signalering antagonister.

udførtes Yderligere eksperimenter under anvendelse pMiR- Rapport vektorer med WT eller mutant 3 ‘UTR’er på Dkk-1 eller DACT3, forbigående cotransficeret med miR-31 primære konstruktioner eller kontrol vektorer i SAEC. Som vist i figur 3C, luciferaseaktiviteter af wt 3’blev UTR’er af Dkk-1 og DACT3 reduceret -70% sammenlignet med vektorkontrol eller muteret 3’UTR’er hhv. Kollektivt, disse eksperimenter tyder på, at miR-31 direkte interagerer med 3 ‘UTR’er på Dkk-1 og DACT3.

Epigenetisk ændringer falder sammen med CSC-medieret aktivering af miR-31

Nyt chip-analyse af spredningsmønstre for H3K4Me3, H3K9 /14Ac, og H2AZ foreslog, at værten genet for miR-31 er LOC554202 [35]. Som blev udført sådan, yderligere forsøg for at undersøge, om CSC moduleret udtryk for LOC554202 i SAEC. I overensstemmelse med resultaterne vedrørende MIR-31 (figur 1A), 5 dages CSC behandling induceret ekspression af LOC554202, som blev opretholdt i 20 dage efter fjernelse af CSC fra dyrkningsmedier (figur 4A); disse resultater var i overensstemmelse med dem, der vedrører CSC-medieret opregulering af miR-31 (figur 1). QRT-PCR-forsøg viste, at 6 af 7 primære lungecancer prøver udtrykker ≥2 gange højere MIR-31 niveauer i forhold til parrede normale lungevæv også udviste overekspression af LOC554202 (figur 4B).

A) RT- PCR-analyse demonstrerer opregulering af LOC554202 udtryk i SAEC følgende 5-dages CSC eksponering. I overensstemmelse med data vedrørende opregulering af MIR-31 CSC, ekspression af LOC554202 varede ved i 20 dage efter ophør af CSC eksponering. B) QRT-PCR-analyse demonstrerer ekspressionsniveauer af LOC554202 i primære lungecancere forhold til tilstødende normale lungevæv. C) Skematisk fremstilling af LOC554202, det formodede vært genet af MIR-31. A, B, C, og D repræsenterer positioner af parrede primere anvendt til chipanalyse. D) chip analyse skildrer H3K4Me3 og H3K9 /14 acetyleringsniveauer inden for fire områder af LOC554202 promotor (~ 1 kb, 2 kb, 3 kb, og, 5 kb fra TSS) i SAEC dyrket med og uden CSC. Øget aktivering mærker blev observeret i den proksimale promotor regionen efter CSC eksponering.

Sekvensanalyse viste ingen klassiske CpG ø i promoter regionen LOC554202, hvilket tyder på, at denne vært gen ikke reguleres primært via DNA methylering mekanismer (data ikke vist). Efterfølgende CHIP eksperimenter viste forhøjede niveauer af H3K4Me3 og H3K9 /14Ac aktivering mærker i den proksimale promotor-regionen (0 til -1,5 k), LOC554202 (som formentlig indeholder de regulatoriske elementer for miR-31) i SAEC følgende CSC eksponering (figur 4C og D ). Interessant, disse aktivering mærker i LOC554202 promotor-regionen i SAEC var stadig til stede 20 dage efter ophør af CSC behandling. Disse fund var i overensstemmelse med RT-PCR-resultater afbildet i figur 4A.

Rolle C /EBP-β i CSC-medieret aktivering af MIR-31

Yderligere forsøg blev udført for yderligere at undersøge mekanismerne hvorved CSC medierer aktivering af LOC554202. Indledende software analyse viste ingen karakteristiske XRE sekvenser inden for 5 kb af den formodede transskription startstedet (TSS) for LOC554202, tyder på, at opregulering af LOC554202 af CSC ikke var medieret primært via aryl kulbrinte receptor signalering [36]. Som vist i figur 5A, denne analyse afslørede multiple potentielle bindingssteder for C /EBP-β, som tidligere er blevet vist at mediere opregulering af Bd-XL i brystcancerceller udsat for cigaretrøg [37]. Som sådan blev udført yderligere eksperimenter for at konstatere, om denne transkriptionsfaktor bidrog til CSC-medieret aktivering af MIR-31 i dyrkede respiratoriske epiteler.