PLoS ONE: Cirkulerende MACC1 Udskrifter i Kolorektal Cancer Patient Plasma Forudsige Metastase og Prognosis

Abstrakt

Baggrund

Metastase er den hyppigste årsag til svigt behandling og død i kolorektal cancer. Tidlig påvisning af tumorer og metastaser er afgørende for at forbedre behandlingsstrategier og patient resultat. Udvikling af pålidelige biomarkører og enkle test rutinemæssigt gældende i klinikken til påvisning, prognosticering og overvågning terapi er af særlig interesse. Vi har for nylig identificeret det hidtil ukendte gen Metastase-associeret i Colon Cancer 1 (MACC1), en central regulator af HGF /Met-pathway. MACC1 er en stærk prognostisk biomarkør for tyktarmskræft metastase og tillader identifikation af højrisiko-emner i tidlige stadier, når bestemt i patienternes primære tumorer. For at overvinde begrænsningen af ​​et begrænset antal molekylære analyser i tumorvæv, etablering af en non-invasiv blodprøve for tidlig identifikation af patienter med høj risiko kræft, til overvågning sygdomsforløb og terapi reaktion er stærkt behov for.

Metode /Principal Fund

for første gang, vi beskrive en ikke-invasiv analyse til kvantificering af cirkulerende MACC1 udskrifter i blod på mere end 300 patienter med tarmkræft. MACC1 transcript niveauer øges i alle sygdomstilstande faser af kræftpatienter sammenlignet med tumor-fri frivillige. Højeste MACC1 niveauer blev bestemt i individer med metastaser (alle P 0,05). Vigtigere, høje MACC1 niveauer korrelerer med ugunstig overlevelse (P 0,0001). Kombinere MACC1 med cirkulerende udskrifter af metastaser genet S100A4, en transskriptionel mål af Wnt /β-catenin-pathway, forbedrer overlevelsen forudsigelse for nydiagnosticerede kræftpatienter.

Konklusion /Betydning

Dette blod -baseret assay til cirkulerende MACC1 transkripter, som kan kvantificeres på en rutinemæssig basis, er klinisk anvendelig til diagnose, prognose og terapeutisk overvågning af cancerpatienter. Her demonstrerer vi den diagnostiske og prognostiske værdi af cirkulerende MACC1 udskrifter i patient plasma til metastaser og overlevelse. Da MACC1 repræsenterer en lovende mål for anti-metastatiske terapier kan cirkulerende MACC1 udskrifter vise sig at være en ideel udlæsning til overvågning terapeutiske respons af fremtidige interventioner rettet mod MACC1-induceret metastaser hos kræftpatienter

Henvisning:. Stein U , Burock S, Herrmann P, Wendler I, Niederstrasser M, Wernecke KD, et al. (2012) cirkulerende MACC1 Udskrifter i Kolorektal Cancer Patient Plasma Forudsige Metastaser og Prognose. PLoS ONE 7 (11): e49249. doi: 10,1371 /journal.pone.0049249

Redaktør: Hassan Brim, Howard University, USA

Modtaget: Maj 2, 2012; Accepteret: 4 Oktober 2012; Udgivet: November 14, 2012 |

Copyright: © 2012 Stein et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. USA og PMS er patenthavere vedrørende MACC1 (tidligere 7a5 /prognostin) bestemmelse i primære tumorer. Stein U, Schwabe H, Walther W, Schlag PM. Verwendung des neu-identifizierten Gens 7a5 /Prognostin (MACC1) für Tumordiagnostik und Tumortherapie. 7a5 /Prognostin og anvendelse deraf til den diagnostiske og behandling af tumorer. Patent JP2006-519895: 13.5.2011. Patent AU 2004259281: 12.5.2011. Patent US 7.851.168 B2: 14.12.2010. Patentansøgning CA 2.526.240: 2004. patentansøgning EP 008.053: 2004. patentansøgning DE 10.332.854,8: 2003. USA, PH, SB og PMS er indehavere af en patentansøgning for brug af metastase Progressor S100A4 udskrifter i kropsvæsker fra kolorektal og gastrisk kræftpatienter. Stein U, Herrmann P, Burock S, Schlag PM. Anvendelse af metastase Progressor S100A4 udskrifter i kropsvæsker fra kolorektale og mavecancerpatienter. Patentansøgning PCT /EP2010 /001.891: 19.3.2010 patentansøgning US 61 /261.017: 13.11.2009. Forfatterne bekræfte, at dette ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Metastase er den hyppigste årsag til svigt behandling og død i kolorektal cancer. Tidlig påvisning af tumorer og metastaser er afgørende for at forbedre behandlingsstrategier og patient resultat. Udvikling af pålidelige biomarkører og enkle tests, der rutinemæssigt anvendes i klinikken til påvisning, prognosticering og overvågning terapi er af særlig interesse.

Vi har for nylig identificeret det hidtil ukendte gen Metastase-associeret i Colon Cancer 1 (MACC1) [ ,,,0],1] – [3]. MACC1 er en ny prognostisk biomarkør for tyktarmskræft metastase og metastase overlevelse ved bestemmelse i patienternes primære tumorer. MACC1 niveauer i primære tumorer viste sig at være betydeligt højere i kræftsygdomme, metachronously udviklede fjernmetastaser i forhold til dem, der ikke metastaserer inden for et 12-års opfølgning. Den prædiktive værdi af biomarkør om, hvorvidt en tumor vil metastaserer eller ikke var 74% og 80%. Det 5-års-overlevelse var 80% for patienter med lav MACC1, sammenlignet med 15% for patienter med forhøjet MACC1 udtryk i deres primære tumorer. MACC1 er en prædiktor for tarmkræft metastase uafhængig af tumor stadium, alder, køn, tumor infiltration, nodal status og lymfekar invasion, og tillader således identifikation af individer med høj risiko for metastase i tidlige stadier [1]. Dette gør MACC1 en vigtig prognostisk gen i klinisk praksis. Endvidere fandt vi, at MACC1 virker en central regulator af HGF (hepatocytvækstfaktor) /Met-pathway, hvilket er afgørende i colorektal cancer for tumorudvikling og metastase-dannelse [1], [2], [4].

Flere grupper bekræftede i mellemtiden en korrelation med høj MACC1 udtryk i tumoren til progression, metastase, overlevelse, og terapi respons i kolorektal cancer (CRC) [5] – [9]. Rolle MACC1 som biomarkør for kræft progression og overlevelse blev i mellemtiden også rapporteret for andre faste kræftformer, såsom gastrisk [10], lunge [11], [12], hepatocellulært [13], [14] og ovariecancer [15 ].

Molekylær analyser i tumorvæv, f.eks nødvendig for sygdomsprognose i forbindelse med metastasedannelse og overlevelse, er begrænset til et begrænset antal tilgængelige vævsprøver. For at overvinde denne begrænsning, etablering af en ikke-invasiv MACC1-baserede blodprøve for tidlig identifikation af højrisikopatienter kræft og til overvågning af sygdommen kursus samt af behandlingen reaktion er derfor stærkt brug for.

Her for første gang, har vi udviklet en ikke-invasiv assay for MACC1 transkriptniveauer i plasma. Vi analyserede den diagnostiske værdi af MACC1 niveauer til påvisning af tumorer og metastaser i colon og rektal cancer patienter, og dens prognostisk værdi for samlet overlevelse (overlevelse) af disse patienter. Desuden har vi vurderet fordelen ved at kombinere MACC1 med en yderligere metastaser gen, S100A4, for forbedret forudsigelse af sygdom prognose [16] – [18].

Materialer og metoder

Målsætning

metastase-fremkaldende gen MACC1 er en stærk prognostisk biomarkør for tyktarmskræft metastase og tillader identifikation af højrisiko-emner i tidlige stadier, når bestemt i patienternes primære tumorer. For at overvinde begrænsningen af ​​et begrænset antal molekylære analyser i tumorvæv, vi sigter mod etableringen af ​​en ikke-invasiv MACC1-baserede blodprøve for tidlig identifikation af højrisikopatienter kræft og til overvågning af sygdomsforløbet.

Deltagere

for kolon og rektal kræftpatienters egenskaber se tabel 1, 2, 3. konsekutive patienter med colon eller rektal cancer, som blev set ved Robert Rössle cancer Hospital, Charité University Medicin Berlin, i løbet af 2006 til 2007 for indlæggelse eller ambulant behandling og som gav deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i vores tumor biobank blev indrulleret. Vejviser

Patienternes data for histopatologisk karakterisering af tumoren (herunder tumor infiltration , lymfeknude-status, metastase, sortering, lymfekar infiltration, blodkar infiltration, residual tumor), til behandling og overlevelse var tilgængelige fra tumoren bred af Charité Comprehensive Cancer center. Histologisk tumor staging blev udført ved rutinemæssig patologi. Eksklusionskriterier var andre maligniteter under historie eller opfølgning. Vi analyserede 312 blodprøver fra colon (n = 151) og rektal (n = 161) kræftpatienter (tabel 1, 2, 3).

Blodprøver blev taget på dagen for diagnose fra nydiagnosticerede patienter med en primær tumor uden eller med synkrone metastaser eller fra patienter, som udviklede metastaser metachronously efter R0-resektion af den primære tumor. Undtagelse: Patienter med nydiagnosticeret lokalt avanceret endetarmskræft, som modtog neoadjuverende kort kursus stråling eller langvarig radiochemotherapy (n = 16). Her blev der taget blodprøver efter neoadjuverende behandling af den primære tumor. For patienter, der får kort kursus stråling, intervallet mellem afslutningen af ​​behandlingen og blod tage var 3 til 6 dage. Vi fandt ikke signifikant forskellige MACC1 transkriptniveauer mellem det behandlede (n = 16) og de ikke-behandlede rektal cancer patienter (n = 23).

Blodprøver fra kohorte af opfølgende patienter blev taget udelukkende under opfølgningsperioden (median 975 og 1280 dage efter primær diagnose, median 807 og 853 dage opfølgning efter blod tager for tyktarmen og endetarmskræft, henholdsvis)

plasma kontroller afledt af to uafhængige kohorter. af frivillige (n = 54). Rekruttering af de frivillige blev støttet af Klaus Sperber, Medicinsk praktiserende, Berlin, og af Ursula Plöckinger, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin. Alle frivillige skal være tumor-fri og uden en historie af onkologiske sygdomme. Vi fandt ikke signifikant forskellige MACC1 niveauer med hensyn til køn, alder, eller mellem de to kohorter.

Nydiagnosticeret kolorektal cancer patienter med primær tumor med eller uden synkrone metastaser blev grupperet på grund af deres kronologiske gennemgang i en test-sæt (n = 36) og en validering-sæt (n = 35) til bestemmelse af den diagnostiske værdi af cirkulerende MACC1 udskrifter (tabel 4).

Plasma Forberedelse

først undersøgte vi optimale betingelser for blod tage, opbevaring og plasma separation. Efter blod udtagning af raske frivillige (n = 12) blev EDTA-blod opbevares ved stuetemperatur eller ved 4 ° C. Plasma separation blev udført enten med det samme, eller 7, 24, 48, og 72 timer efter blod taking (10 analyser per frivillig). RNA blev isoleret og MACC1-specifik kvantitativ real-time RT-PCR blev udført i dubletter (fig. 1A). MACC1 transkriptniveauer tjente som udlæsning. Vi fandt ingen ændringer af MACC1 niveauer, når plasma separation blev gennemført i løbet af de første 24 timer (enten afkølede eller holdes ved stuetemperatur). Baseret på disse resultater, blev plasma adskilt fra afkølet EDTA-blod på samme dag inden for 7 timer efter blod tage. Procedure til plasmaseparationsproces blev som tidligere beskrevet [18]. Blindede prøver, hverken tyktarmen eller endetarmskræft eller sygdom etape blev afsløret under analysen, blev opbevaret ved -80 ° C.

A. betingelser Plasma separation til bestemmelse af cirkulerende MACC1 udskrifter. Plasma separation af prøver fra tumor-fri frivillige (n = 12) blev udført straks, 7, 24, 48, og 72 timer efter indtagelse blod, enten fra blodprøver holdt ved 4 ° C eller ved stuetemperatur. Efterfølgende plasma dannes inden for de første 7 timer fra 4 ° C afkølet blod. B. MACC1 transkripter i plasma af tumor-fri frivillige (n = 54). Ingen forskel i MACC1 transkriptniveauer blev fundet i to uafhængigt analyserede kohorter af tumor-fri frivillige (n = 34 og n = 20, henholdsvis). C. MACC1 udskrifter i plasma af alle patienter med tarmkræft (n = 312). Alle patientkohorter bærer kolorektal, kolon (n = 151) eller rektal (n = 161) kræft udtrykt signifikant højere MACC1 udskrift niveauer end tumor-fri frivillige (

P

0,001 for alle sammenligninger).

RNA og Quantitative Real-Time RT-PCR

Isolering af totalt RNA blev udført som tidligere beskrevet [18]. Kvantitativ real-time RT-PCR blev udført ved 30 sekunder 95 ° C, 45 × (10 sek 95 ° C, 10 sek 62 ° C, 10 s 72 ° C), der smeltede kurve 40 ° C til 95 ° C, ved under anvendelse af LightCycler (DNA Master hybridiseringsprober kit, Roche Diagnostics) som tidligere beskrevet [1]. Følgende primere og prober blev anvendt amplifikation af en 136 bp MACC1-specifik PCR-produkt: forward primer 5′-TTCTTTTGATTCCTCCGGTGA-3 ‘, revers primer 5′-ACTCTGATGGGCATGTGCTG-3′, FITC-probe 5’-GCAGACTTCCTCAAGAAATTCTGGAAGATCTA-3 ‘, LCRed640- probe 5’-AGTGTTTCAGAACTTCTGGACATTTTAGACGA-3 ‘(synteser af primere og prober: BioTeZ og TIB MolBiol, Berlin, Tyskland). Den kalibrator cDNA blev ansat i seriefortyndinger samtidigt i hver kørsel, afledt af cellelinier SW620. Autentificering af cellelinjen blev udført ved korte tandemgentagelse (STR) genotypebestemmelse (DSMZ Braunschweig, Tyskland). STR genotype var i overensstemmelse med den offentliggjorte genotype for denne cellelinje (ATCC, CCL-227). S100A4-specifik kvantitativ real-time RT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [18]. mRNA-ekspression af en blodprøve er givet som procent af mRNA-ekspression af et defineret kalibrator prøve, der blev sat 100%. Hver prøve blev kørt i to eksemplarer, midlerne er afbildet.

Etik

Alle blodprøver fra patienter og tumor-fri frivillige blev opnået med informeret skriftligt samtykke i overensstemmelse med den internationale konference om harmonisering og med godkendelse af den lokale IRB.

statistiske Metoder

Forskelle mellem grupper i form af MACC1 transkriptniveauer i plasma blev testet ved hjælp af ikke-parametrisk Wilcoxon-Mann-Whitney test (afhængig af fordelingen af normalitet): tumor-fri frivillige vs. patienter med primære tumorer uden og med synkrone metastaser, til patienter med metachronous metastaser, og at opfølgende patienter; patienter med tumorer vs. dem med tumorer og metastaser. I tilfælde af små prøver, større forskelle i stikprøvestørrelser, store men ubalancerede grupper, datasæt indeholder tilknytninger eller sparsomme data, blev der udført tests i en nøjagtig udgave. Vi overvejede

P

0,05 at være betydelig. Alle numeriske beregninger blev udført med SPSS version 18.

For at definere den diagnostiske værdi af cirkulerende MACC1 udskrifter i plasma, sensitivitet og specificitet blev beregnet med en firedobbelt bord for tarmkræft (test- og validering-sæt), kolon, og rektal kræftpatienter, der nyligt blev diagnosticeret med en primær tumor uden eller med synkrone metastaser sammenlignet med blodprøver fra 54 tumor-fri frivillige. I overensstemmelse med deres kronologiske gennemgang og indledende patienter blod tager blev grupperet i en test-sæt og validering-sæt. Vi begyndte med en test-sæt nydiagnosticerede CRC patienter (n = 36), bestemmes den optimale cut-off værdi MACC1 (følsomhed 75%, specificitet 76%), og anvendt denne cut-off værdi for validering-sæt CRC patienter (n = 35). Følsomhed og specificitet var 77% og 76%, hhv. Ved kombination af alle nydiagnosticerede CRC patienter, sensitivitet og specificitet var 76%. Når man analyserer kolon og rektal kræftpatienter separat, sensitivitet var 77% for tyktarmskræft og 76% for endetarmskræft. Specificitet var 89% for tyktarmskræft og 76% for endetarmskræft, henholdsvis.

For at overleve analyse af nydiagnosticerede og alle CRC patienter blev Kaplan Meier kurver i kombination med log rank test anvendes. Disse CRC patienter blev inkluderet i denne analyse, hvor begge mærker, MACC1 og S100A4, kunne bestemmes (n = 294). Cut-off værdi MACC1 og cut-off værdi S100A4 var medianen af ​​de undersøgte grupper (primær diagnose eller alle patienter), hhv. Beregninger blev udført med SPSS version 18.

Resultater

Kvantificering af cirkulerende MACC1 Udskrifter i Human Plasma

Vi oprindeligt identificerede optimale betingelser for plasma behandling og MACC1 udskrift kvantificering efter blod tager. Plasma separation og efterfølgende MACC1 analyser blev udført straks eller 7, 24, 48, og 72 timer efter blod tage fra tumor-fri frivillige (n = 12; 10 portioner pr frivillige), enten 4 ° C afkølet eller efterladt ved stuetemperatur ( fig. 1A). Øgede MACC1 niveauer blev målt på grund af hæmolyse efter 48 og 72 timer efter at tage blod. For at bestemme de basale niveauer af cirkulerende MACC1 udskrifter i tumor-fri frivillige og kolorektal cancer patienter, vi efterfølgende separerede plasma fra 4 ° C-afkølede blodprøver inden for de første 7 timer efter blod tage.

Cirkulerende MACC1 Afskrifter i plasma tumor-fri frivillige

Vi analyserede de basale MACC1 niveauer af tumor-fri frivillige i to uafhængige kohorter (n = 34 og n = 20, fig. figur 1B). MACC1 udskrifter blev påvist i alle prøver, uden væsentlige forskelle mellem de to kohorter. Alle tumor-fri frivillige blev kombineret til efterfølgende analyser (median 0,224 MACC1 mRNA-ekspression /% kalibrator).

Cirkulerende MACC1 Udskrifter i plasma diskriminere Tumor-fri Frivillige og tarmkræft Patienter

Næste, vi analyserede MACC1 niveauer i plasma fra colon (n = 151) og rektal (n = 161) kræftpatienter (patienternes karakteristika: tabel 1, 2, 3). For at evaluere den diagnostiske værdi af cirkulerende MACC1 transkripter i plasma, sammenlignede vi nydiagnosticerede CRC patienter med en primær tumor med eller uden synkrone metastaser (n = 71) med tumor-fri frivillige (n = 54) og beregnet følsomhed og specificitet med en firdobbelt tabel. Vi begyndte med en test-sæt nydiagnosticerede CRC patienter (n = 36; følsomhed 75%, specificitet 76%), og anvendt den beregnede optimale afskæringsværdi for validering-sæt af nydiagnosticerede CRC patienter (n = 35; sensitivitet 77%, specificitet 76%). Ved kombination af alle CRC patienter nydiagnosticerede, sensitivitet og specificitet var 76% (tabel 4). Når man analyserer kolon og rektal kræftpatienter separat, følsomheder var 77% og 76%, og særlige var 89% og 76%, hhv. Således MACC1 transcript niveauer i plasma understøtter identifikation af enkeltpersoner, der bærer kolon og endetarmskræft.

Vi har registreret MACC1 udskrifter i plasma af alle kræftpatienter. Vi fandt signifikant højere MACC1 niveauer i tyktarmen, endetarmen, og kolorektal (kombineret) kræftpatienter i forhold til tumor-fri individer (alle

P

0,001;. Figur 1C). Vi observerede ingen signifikante variationer af MACC1 niveauer på grund af alder, køn, eller mellem tumor trin I, II og III.

Høj Cirkulerende MACC1 transkriptniveauer i plasma af metastaseret tarmkræft Patienter

Til evaluerer relevansen af ​​cirkulerende MACC1 transkripter i plasma i forhold til metastasedannelse blev patienter klassificeres efter sygdom stadium: patienter med en primær tumor uden synkron metastase (trin i-III, n = 51 for tyktarms-, n = 12 for colon og n = 39 til rektal kræftpatienter); patienter med en primær tumor og synkront metastase (trin IV, n = 20 for tyktarms-, n = 10 for colon, og n = 10 til rektal kræftpatienter); og personer med metachronous metastase efter R0-resektion af den primære tumor (n = 11 for tyktarms-, n = 4 for colon, og n = 7 til rektal kræftpatienter) (tabel 1, 2, 3). Blod blev taget på dagen for diagnose. Desuden har vi også medtaget opfølgende patienter (n = 230 for tyktarms-, n = 125 for colon, og n = 105 for rektale kræftpatienter, tabel 1, 2, 3). MACC1 niveauer signifikant højere i hver sygdom fase af colon og rektal cancer sammenlignet med tumor-fri frivillige (fig. 2A-C). Bemærkelsesværdigt, blev påvist klart forøgede MACC1 niveauer i nydiagnosticerede kræftpatienter med synkron metastaser (stadie IV), i forhold til kræftpatienter uden fjernmetastaser (trin I-III): for kolorektal (. Figur 2A), kolon (. Figur 2B), og endetarmskræft (fig. 2C), medianer 0,937, 2,249, og 0,829 MACC1 mRNA-ekspression /% kalibrator i metastaseret patienter, sammenlignet med 0,61, 0,78, og 0,559 MACC1 mRNA-ekspression /% kalibrator i patienter uden fjernmetastaser (

P

= 0,006,

P

= 0,176, og

P

= 0,041 for colorectal, colon og rektal cancer patienter). Således kvantitativ bestemmelse af MACC1 transkripter i patientens blod er af diagnostisk værdi med hensyn til metastase.

A, B, C. Alle colorectal (A, n = 312), colon (B, n = 151), og rektal (C, n = 161) kræftpatienter sub-kohorter viste signifikant højere cirkulerende MACC1 transkriptniveauer end tumor-fri frivillige (n = 54). Højere MACC1 niveauer blev også fundet for kolorektal (

P

= 0,006; A) og rektal (

P

= 0,041; C) kræftpatienter med synkrone metastaser (n = 20 og n = 10) sammenlignet med patienter uden fjernmetastaser (n = 51 og n = 39, henholdsvis). Box plot analyse, baseret på kvantitativ real-time RT-PCR.

Høj Cirkulerende MACC1 transkriptniveauer i plasma af tarmkræft Patienter er associeret med Shorter Survival

Dernæst vi evaluerede prognostiske betydning af cirkulerende MACC1 udskrifter i plasma. Vi begyndte analysen af ​​cirkulerende MACC1 niveauer med hensyn til overlevelsen af ​​nydiagnosticerede CRC patienter med en primær tumor med eller uden synkrone metastaser (blodprøver blev udtaget på dagen for diagnose) (fig. 3A). Den afskæringsværdi anvendte var medianen af ​​de målte MACC1 niveauer i denne patient kohorte (0.670 MACC1 mRNA-ekspression /% kalibrator). I overensstemmelse med denne cut-off, blev patienterne klassificeret som lave eller høje MACC1 ekspressorer. Interessant, de nydiagnosticerede patienter med lave MACC1 niveauer ( cut-off) viste en signifikant længere overlevelse end patienter med forhøjet MACC1 niveauer ( cut-off) (

P

= 0,003; Fig. 3A). Således cirkulerende MACC1 transkriptniveauer i plasma når fastsættes på dagen for diagnosen, er af prognostisk værdi for overlevelsen af ​​nydiagnosticerede patienter.

A, B. Kaplan-Meier analyse for nydiagnosticeret (A, n = 49) og alle (B, n = 294) CRC patienter, baseret på MACC1 alene (A, lav MACC1 n = 24, høj MACC1 n = 25; B, lav MACC1 n = 147, høj MACC1 n = 147). Nydiagnosticerede CRC patienter (A) samt alle CRC patienter (B) med høje cirkulerende MACC1 transkriptniveauer demonstrerede kortere overlevelse sammenlignet med patienter, der viser lavt MACC1 niveauer (

P

= 0,003 og

P

0,0001 henholdsvis). C, D. Kaplan-Meier analyse for nydiagnosticeret (C, n = 49) og alle (D, n = 294) CRC patienter, baseret på en kombination af MACC1 og S100A4. Nydiagnosticerede CRC patienter (C) og alle CRC patienter (D) blev klassificeret i grupper af lave ekspressorer af begge gener (n = 13 og n = 85, henholdsvis), af patienter med højt S100A4 niveauer (n = 25 og n = 147 henholdsvis), af patienter med høje MACC1 niveauer (n = 25 og n = 147, henholdsvis), eller med høj ekspression af begge biomarkører (n = 14 og n = 85, henholdsvis). For nydiagnosticerede patienter (C), blev overlevelse reduceret med stigende niveauer af cirkulerende udskrifter af S100A4, af MACC1, eller af begge. Expression induktion af enten MACC1 eller S100A4 eller begge biomarkører korreleret til reduceret overlevelse patienter.

Næste, vi ønskede at analysere, om en prognostisk effekt af MACC1 udskrifter gælder for den kohorte alle CRC patienter, herunder opfølgende patienter. Den afskæringsværdi anvendte var medianen af ​​de målte MACC1 niveauer af alle CRC patienter (0,518 MACC1 mRNA-ekspression /% kalibrator). Baseret på denne cut-off, blev alle CRC patienter grupperet som lave eller høje MACC1 ekspressorer. Bemærkelsesværdigt, kunne vi bekræfte vores konklusion fra gruppen af ​​nydiagnosticerede patienter også for alle CRC patienter analyseret: patienter med lavt MACC1 niveauer ( cut-off) viste en signifikant længere overlevelse end patienter med forhøjet MACC1 niveauer ( cut- off) (

P

0,0001;. figur 3B). Således niveauer af cirkulerende MACC1 udskrifter i CRC patient plasma er af prognostisk værdi med hensyn til patientens overlevelse.

Kombination af cirkulerende MACC1 og S100A4 transkriptniveauer i plasma Forbedrer Survival forudsigelse for tyktarms- og endetarmskræft Patienter

for yderligere at forbedre forudsigelse af overlevelse, vi tilføjet metastaser gen S100A4, et mål af Wnt /β-catenin-pathway, til dette MACC1 analyse. Vi havde valgt disse metastase biomarkører for kombination, da de løse mest relevante signalveje i kolorektal cancer progression og metastase: MACC1 – en vigtig regulator af HGF /Met signalvejen, og S100A4- en transskriptionel target gen af ​​Wnt /β-catenin signalvejen. Hidtil ingen tværs regulering af disse to metastase-associerede gener – MACC1 og S100A4 – er kendt

Desuden har vi tidligere rapporteret den diagnostiske og prognostiske værdi af S100A4 udskrifter i plasma [18].. Her personer med lav S100A4 plasmaniveauer viste også en længere overlevelse (fig. S1A, B).

Vi først behandlet spørgsmålet om, om kombinationen af ​​de to biomarkører, cirkulerende udskrifter af MACC1 og S100A4, kan forbedre den prognostiske værdi af MACC1 alene i kohorte af nydiagnosticerede CRC patienter. De afskæringsværdier anvendte var medianen af ​​de målte MACC1 niveauer i denne patient kohorte (0.670 MACC1 mRNA-ekspression /% kalibrator) samt medianen af ​​de målte S100A4 niveauer i denne patient kohorte (0,435 S100A4 mRNA-ekspression /% kalibrator) . I overensstemmelse med disse cut-off-værdier blev patienterne klassificeret som lav ekspressorer af begge gener, som høje ekspressorer af S100A4, som høje ekspressorer af MACC1, eller så høje ekspressorer af begge gener. Patienter, som viste lave cirkulerende niveauer af MACC1 og S100A4, havde de længste overlevelsestider. Nedsat overlevelse blev derefter observeret for patienter med høje S100A4 niveauer, efterfulgt af patienter med høje MACC1 niveauer. Korteste overlevelsestider blev fundet for patienter med både biomarkører højt udtrykte (fig. 3C). Således for nydiagnosticerede patienter, kombinationen af ​​høj MACC1 og høje S100A4 niveauer forbedret overlevelse forudsigelse, sammenlignet med høje MACC1 niveauer alene.

Vi derefter evalueres denne kombinatorisk MACC1 og S100A4 tilgang til overlevelse for alle CRC patienter , herunder de opfølgende patienter. De afskæringsværdier anvendte var medianen af ​​de målte MACC1 niveauer for alle CRC patienter (0,518 MACC1 mRNA-ekspression /% kalibrator) samt medianen af ​​de målte S100A4 niveauer for alle CRC patienter (0,421 S100A4 mRNA-ekspression /% kalibrator) . I overensstemmelse med disse cut-off-værdier, blev alle CRC patienter klassificeret som lav ekspressorer af begge gener, som høje ekspressorer af S100A4, som høje ekspressorer af MACC1, eller så høje ekspressorer af begge gener. Som observeret for de nydiagnosticerede patienter, også alle CRC patienter, der viste lave cirkulerende niveauer af MACC1 og S100A4, havde de længste overlevelsestid. Expression induktion af enten MACC1 eller S100A4 eller begge biomarkører korreleret til reduceret patienter overlevelse (fig. 3D).

Derudover har vi også sammenlignet overlevelsen af ​​patienter med lave niveauer af MACC1 og S100A4 eller med kun én markør (enten MACC1 eller S100A4) steg med overlevelsen af ​​de patienter, som viste både MACC1 og S100A4 forhøjet. Vi fandt en signifikant kortere overlevelse for patienter med høje plasmaniveauer af begge biomarkører. Dette blev observeret for kohorten af ​​nydiagnosticerede patienter (

P

0,0001;. Figur S2A) samt for analyseret alle CRC patienter (

P

= 0,001;. Fig S2B ).

Discussion

Her rapporterer vi udviklingen af ​​den første blod-baseret assay for metastase-inducerende gen MACC1, som er en prognostisk biomarkør for tyktarmskræft metastase samt for tumorudvikling og overlevelse i en række forskellige faste cancere. Dette assay til cirkulering MACC1 transkripter, som kan kvantificeres på en rutinemæssig basis, er klinisk anvendelig til diagnose, prognose og terapeutisk overvågning af cancerpatienter. Niveauer af cirkulerende MACC1 transkripter er signifikant højere hos kræftpatienter sammenlignet med tumor-fri frivillige. Bemærkelsesværdigt blev højeste niveauer af cirkulerende MACC1 transkripter bestemt i personer med metastaser, hvilket viser den diagnostiske værdi af cirkulerende MACC1 transkripter i patientens plasma med hensyn til metastase-dannelse. Vigtigst, høj MACC1 niveauer – prospektivt bestemt -. Korrelere med ugunstig overlevelse af de patienter, der understreger den prognostiske værdi af cirkulerende MACC1 udskrifter

Påvisning af celle-fri mRNA i blod som “flydende biopsier” giver real-time overvågning sygdommens udvikling, prognose og terapeutisk respons [19]. Talrige undersøgelser beskriver transkript påvisning af cirkulerende cellefri RNA i plasma og serum fra patienter, der lider af en række forskellige faste cancere, herunder skjoldbruskkirtlen, lunge, mave, bryst og uterin livmoderhalskræft, og dets anvendelse til prognose af sygdomsforløbet [20] – [29]. Stabilitet af cirkulerende cellefri RNA sikres ved exosomer (mikropartikler, mikrovesikler, multivesicles) at beskytte det mod nedbrydning [30], [31]. Især for cirkulerende plasma RNA fra kolon kræftpatienter er det rapporteret, at dette cellefri RNA er begrænset i mRNA-berigede vesikel-lignende strukturer [32]. Adskillige cirkulerende transkripter er allerede blevet rapporteret at være nyttig til diagnose og prognose for tarmkræft; f.eks. hTERT [33], β-catenin [34], thymidylatsyntase [35], og LISCH7 [36]. Især CEA [37], [38], også i kombination med markører såsom CK19, CK20, hTERT, TIMP-1, miR141 [39] – [41], er anerkendt som potentiel støtte i tidlig påvisning af CRC, som prognostisk markør for tilbagefald, og også som prædiktiv biomarkør med hensyn til terapi respons. Test af kombination af begge, CEA og MACC1, kan overgå disse funktioner.

Vores nye fund af cirkulerende MACC1 udskrifter i plasma af kolorektal cancer patienter til diagnosticering og forudsigelse af overlevelse er i overensstemmelse med dem, som vi tidligere har rapporteret baseret på kvantificering af mRNA-ekspression i de kolorektale cancer væv med hensyn til sygdomsprognose [1]. Efterfølgende flere grupper valideret linket til høj MACC1 udtryk i kolorektal cancer væv til fremskreden sygdom (fx [5], [7], [8]).