PLoS ONE: opreguleret miR155 Vender Epithelial-mesenkymale Transition induceret af EGF og Øger Chemo-følsomhed over for cisplatin i Human Caski Livmoderhalskræft Cells

Abstrakt

epitel-mesenkymale overgang (EMT) induceret af EGF fremmer livmoderhalskræft progression; Men mekanismerne bag EGF-inducerede EMT fortsat uklare. I denne undersøgelse har vi rapporteret at miR155 overekspression undertrykt EGF-induceret EMT, nedsat migration /invasion kapacitet, inhiberede celleproliferation og øgede kemo-følsomhed for DDP i humane Caski cervikal cancerceller. Endvidere overekspressionen af ​​miR155 forøget TP53 ekspression men reduceret SMAD2, og CCND1 ekspressionsniveauer. Disse data antyder, at miR155 negativt regulerer EGF-induceret EMT. Vi konkluderer, at miR155 ikke handler som et onkogen, men som en tumor suppressor i Caski celler

Henvisning:. Lei C, Wang Y, Huang Y, Yu H, Huang Y, Wu L, et al. (2012) opreguleret miR155 Vender Epithelial-mesenkymale Transition induceret af EGF og Øger Chemo-følsomhed over for cisplatin i Human Caski Cervical Cancer Cells. PLoS ONE 7 (12): e52310. doi: 10,1371 /journal.pone.0052310

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: August 8, 2012; Accepteret: November 16, 2012; Udgivet: December 20, 2012 |

Copyright: © 2012 Lei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte for dette arbejde blev leveret af Natural Science Foundation i Hubei-provinsen (Grant nr. 2011CDB181), Uafhængig Research Fund, Wuhan University (nr. 201130302020016). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser exsit

Introduktion

Livmoderhalskræft er den næststørste klasse af maligne tumorer for kvinder, og det kvinders sundhed fare, især i udviklingslandene. Metastase og invasion er de vigtigste årsager til dødsfald i tilfælde af livmoderhalskræft, og dermed er det vigtigt at afklare de molekylære mekanismer i disse fænomener. Det er blevet rapporteret, at epitelial til mesenkymale overgang (EMT) er en vigtig proces involveret i tumormetastase og invasion [1]. De vigtigste elementer i EMT omfatter opløsningen af ​​epitel tætte sammenføjninger, ombygning af cytoskelettet, tabet af apikale-basal polaritet, og erhvervelse af mesenkymale markører, såsom N-cadherin og vimentin. EMT forlener tumorceller med højere invasive /metastatiske kapacitet, stamcelle-lignende egenskaber, modstandsdygtighed over for apoptose, og immuntolerance [2].

EGF (epithelial vækstfaktor) er en af ​​de vigtigste EMT regulatoriske faktorer, udløser EMT i en række faste tumorer, herunder cervikal cancer. Det er blevet rapporteret, at tumorer med høj EGF-receptor-ekspression har dårlig klinisk prognose, og EGF-induceret EMT kan være en grund til dette [3] – [5]. Således forhindrer EGF-induceret EMT kunne være en egnet metode til at hæmme invasion og metastase.

Nylige undersøgelser har antydet, at miRNA spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​EMT [6], [7]. miRNA er 18- til 25-nukleotid-lange ikke-kodende RNA, der kan regulere genekspression ved at fremskynde nedbrydningen og hæmme oversættelse af mål mRNA. Blandt de miRNA identificeret til dato, er miR155 forbundet med tumor proliferation og overudtrykkes i mange humane tumorer [8]. En undersøgelse viste, at den unormale udtryk for miR155 var en tidlig begivenhed i bugspytkirtelkræft og nært beslægtet med en lav overlevelse [9]. I endometriecancer, blev forekomsten af ​​EMT ledsaget af forhøjede miR155 ekspressionsniveauer [10]. Det er endnu ikke klart, om miR155 er involveret med forekomsten af ​​EMT i livmoderhalskræft. I denne undersøgelse, at bruge EGF som en EMT-inducerende faktor i humane livmoderhalskræft celler, vi udforskede de regulatoriske roller miR155 i EMT-processen, cellulær proliferation, cellulær følsomhed over for kemoterapeutiske stoffer, og vurderet den potentielle værdi af miR155 som en molekylær mål for tidlig forebyggelse af livmoderhalskræft invasion og metastase.

Materialer og metoder

cellelinier

Caski celler blev købt fra Cell Bank of China (Wuhan) og blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO2 i RPMI-1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 pg /ml streptomycin, og 100 enheder /ml penicillin.

RNA-isolering og miRNA Detection

RNA fra de dyrkede celler blev isoleret med Trizol-reagens (Invitrogen) og blev derefter anvendt til at syntetisere første streng cDNA. Påvisning af de modnede miRNA blev udført med PCR under anvendelse af SYBR Premix Ex Taq

tm (TAKARA). U6 blev anvendt som en intern kontrol. De anvendte primere i dette forsøg er vist i tabel S1.

Plasmidkonstruktion og Stald /transient transfektion af miR155

Et humant genomisk DNA-fragment på ca. 400 bp indeholdende miR155 sekvensen blev klonet ind i pcDNA3.1-GFP-vektoren. Det resulterende plasmid pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 bærer en rekombinant DNA-sekvens for GFP og miR155-holdige fragment. For at generere en cellelinie, som stabilt udtrykker miR155 blev Caski-celler transficeret med pcDNA3.1-GFP-miR155 anvendelse af lipofectamin 2000-reagens (Invitrogen). Efter udvælgelse med G418, den enkelt klon, at over-udtrykte miR155 blev identificeret. For miR155 forbigående overekspression blev miR155 efterligner (RIBOBRO), der anvendes til at transficere Caski celler.

In vitro

Migration og Invasion Analyser

En Matrigel-baserede transwell assay blev anvendt til assay cellemigration og invasion

in vitro

som tidligere beskrevet [11]. Til analyse af de invasive egenskaber, 2 × 10

4-celler blev podet på toppen af ​​de Matrigelcoatede cellekultur skær i 200 pi RPMI-1640 medium uden FBS og inkuberet i 24 timer. Indsatsene blev derefter vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og fikseret i 4% paraformaldehyd. Efter at være farvet med hæmatin blev de invasive celler talt under mikroskop. Migrationen assay blev udført ved den samme måde, der er beskrevet ovenfor, undtagen at Matrigel ikke blev coatet i indsatserne.

Western Blot (WB)

Samlet protein blev ekstraheret fra celler under anvendelse cellelyse-buffer (0,5 % NP-40, 0,5% SDS, 1,5 mM Tris-HCI pH 7,4, og 15 mM NaCl). Proteinprøver (20 ug /bane) blev elektroforeret, overført til PVDF-membraner og inkuberet natten over med primære antistoffer mod E-cadherin (sc-7870, Santa Cruz Biotechnology), N-cadherin (BA0637, BOSTER), MMP1 (130-1- 16, RayBiotech), og Annexin A2 (A2485, Sigma). Membranerne blev behandlet med gede-anti-kanin HRP-konjugeret sekundære antistoffer (Invitrogen). Målproteinet bånd blev bestemt under anvendelse af reagenserne leveret i ECL + plus kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA).

Immuno fl uorescence Analyse

Immuno fl uorescence-analyse blev anvendt til analyse af ekspressionsniveauerne af E-cadherin med antistoffer mod E-cadherin (sc-7558, Santa Cruz Biotechnology), og ekspressionen af ​​N-cadherin med antistoffer mod N-cadherin (BA0637, BOSTER) som beskrevet tidligere [12].

celleproliferationsassay

Caski og CaSki-miR155 blev podet i 96-brønds kulturplader og dyrket til 70% konfluens. Cellerne blev behandlet med DDP (cis-diammindichlorplatin, DDP) i 0-3 dage i RPMI-1640 medium. Mediet i hver brønd blev fjernet, og 100 pi (methyl thiazolyl tetrazolium, MTT) opløsning (0,25 g /l i RPMI-1640 medium) blev tilsat. Efter inkubation ved 37 ° C i 4 timer blev mediet fjernet og 200 pi DMSO blev tilsat til hver brønd. Absorbans (A) ved 570 nm blev registreret. Cellen vækstrate og hæmmer rente blev beregnet som følger:

flowcytometri

Caski og Caski-miR155 celler blev høstet i den logaritmiske vækstfase og faste natten over med 80% ethanol. Cellerne blev derefter vasket med kold PBS, farvet med propidiumiodid (PI, 0,05 mg /ml) og RNase A (0,5 mg /ml). Flowcytometri-analyse blev anvendt til at bestemme fordelingen af ​​celler i cellecyklus subfaser og måle apoptose peak induceret af DDP (10 pmol /ml) i 24 timer.

Statistical Analysis

alle data blev præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Statistisk analyse mellem grupperne blev vurderet ved Students to-halet t-test og ANOVA. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

EGF inducerer EMT i Caski Celler

Det er blevet rapporteret, at EGF-receptoren er stærkt forhøjet i livmoderhalskræft celler, hvilket tyder på, at eksponering EGF kan fremkalde EMT i den cervikale cellelinjer [13], [14], [15]. I dette eksperiment Caski-celler blev dyrket under sædvanlige med eller uden EGF (50 ng /ml) i 1, 3 eller 5 dage, og EMT-relaterede ændringer blev bestemt. Den morfologiske ændring blev først visualiseret i denne proces. Efter EGF-stimulering, Caski-celler blev mere fusiform og forbindelsen mellem cellerne faldt (figur 1A). Når E-cadherin (E-cad) ekspression blev analyseret ved WB, resultaterne viste, at eksponering EGF nedregulerede E-cad-ekspression sammenlignet med kontrolcellerne (figur 1b). Den tilsvarende nedregulering af E-cad-ekspression blev verificeret ved en IF assay, hvori Caski-celler blev behandlet med EGF (50 ng /ml) i 3 dage (figur 1c). Samtidig punkt, detekteres vi også ekspressionen af ​​andre EMT-relaterede faktorer (N-cadherin, MMP1 og annexin A2) efter WB og fandt, at alle tre faktorer blev opreguleret (Figur 1D). Disse data viser, at EGF kan inducere EMT i CaSki-celler. Salg

Caski-celler blev dyrket under rutinemæssige betingelser uden EGF (50 ng /ml) i 1 til 5 dage. A. De morfologiske ændringer forårsaget af EGF blev observeret ved mikroskopi. B. Nedregulering af E-cadherin ved behandling EGF bestemtes ved Western blot. Densitometrisk analyse af tre uafhængige tredobbelte Western blots. C. E-cadherin nedregulering som reaktion på EGF (50 ng /ml) behandling i 3 dage blev verificeret ved IF. D. opregulering af N-cad, MMP1 og annexin A2 i EMT Fremgangsmåde undersøgt ved Western blot. Densitometrisk analyse af tre uafhængige tredobbelte Western blots. Værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med S.D. indikeret ved fejlsøjler. * P 0,05, ** P. 0,01, sammenlignet med kontrol

miR155 opreguleres i EGF-inducerede EMT

Total RNA blev oprenset fra EGF-induceret mesenchymal- ligesom Caski-celler og normale Caski-celler. Ekspressionsniveauerne af miR155 eller miR200c blev påvist ved at udføre real-time PCR på disse totale RNA’er. Resultaterne viste, at sammenlignet med de normale Caski-celler, blev miR155 stærkt opreguleret i de mesenkymale Caski-celler, men blev ikke observeret nogen ændring af ekspressionsniveauet for miR200c, som viste sig at blive nedreguleret under EMT proces i mange faste tumorer af andre undersøgelser [ ,,,0],16], [17] (figur 2).

A. De relative ekspressionsniveauer af miR155 og miR200c blev påvist ved real-time PCR. miR155 blev opreguleret med 3 dages behandling EGF (50 ng /ml), og ingen ændring blev fundet i miR200c ekspressionsniveau under EGF-stimulering. Den relative miR155 udtryk forholdet i EGF behandling /Control er 12,21. Forsøg blev gentaget 3 gange. T-test blev anvendt til statistisk analyse; ** P 0,01. B. opreguleres miR155 ekspressionsniveau blev verificeret ved revers-transkription PCR. U6 blev anvendt som en intern kontrol, bane 1 og 2 er EGF behandling, bane 3 er negativ kontrol, 4 lane er markør, bane 5 og 6 er kontrol (uden EGF).

overekspression af miR155 Forhindrer EMT

Selvom miR155 blev stærkt opreguleret i EGF-inducerede EMT proces, er det muligt, at dette kun er en kompenserende begivenhed eller en ikke-relateret fænomen. For yderligere at præcisere, hvilken rolle miRNA155 i EMT-processen, idet en Caski cellelinje med overudtrykt miR155 (Caski-miR155) blev oprettet ved transfektion pcDNA3.1-GFP-miR155 plasmidet ind i Caski celler, med miR155 udtryk verificeret af real -tids PCR (figur 3A). Brug af denne cellelinie som en model, fandt vi, at overekspression af miR155 inhiberede cellevækst og forstyrrede cellecyklussen ved at nedsætte celle-forhold i S-fasen (17% i Caski kontrolceller, 5,4% i Caski-miR155) men stigende cellen forholdet i G1-fasen (63,7% i Caski kontrolceller, 81,4% i Caski-miR155), som vist i figur 3B. EGF-induceret nedregulering af E-cadherinekspression blev delvist vendes ved forbigående transficerede miR155 efterligner (figur 3C). Med miR155 overekspression, morfologien af ​​cellerne blev mere kubisk. Efter 3 dages behandling med EGF (50 ng /ml), blev kun en lille del af Caski-miR155 celler transformeret til at tenformet celler (figur 3D). Disse resultater viser, at overekspression af miR155 inhiberede EGF-induceret EMT.

A. Efter pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 transfektion, det miR155 ekspressionsniveauet steget mere end 12 gange, men blev ikke observeret nogen signifikant forskel for miR200c udtryk. Forsøget blev gentaget 3 gange uafhængigt. ** P 0,01 sammenlignet med kontrolceller. B. Celleproliferation blev testet ved MTT. Resultaterne viser, at miR155 overekspression inhiberede cellevæksthastigheden betydeligt. P 0,05 sammenlignet med kontrolcellerne. Flowcytometri blev anvendt til at teste virkningerne af miR155 overekspression på cellecyklussen. Resultaterne viser en nedsat celle-forhold i S-fasen (17% i Caski kontrolceller, 5,4% i Caski-miR155), men en forøget celle-forhold i G1-fasen (63,7% i Caski kontrolceller, 81,4% i Caski-miR155). Forsøget blev gentaget 3 gange uafhængigt af hinanden. P 0,01 sammenlignet med kontrolceller. C. E-cad-ekspression blev testet ved Western blot. E-cadherin ekspressionsniveauet blev stærkt reduceret med 3 dages EGF (50 ng /ml) eksponering i Caski-celler. Densitometrisk analyse af tre uafhængige tredobbelte Western blots. Værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med S.D. indikeret ved fejlsøjler. * P 0,05. Denne virkning blev delvis forhindres ved transfektion med miR155 efterligner. D. De morfologiske ændringer forårsaget af miR155 overekspression. Caski-miR155 celler er mere kubisk end normale Caski celler. Ved behandling med EGF (50 ng /ml) i 3 dage, blev kun en lille brøkdel af Caski-miR155 celler transformeret ind i tenformede-lignende celler.

TP53 og SMAD2 har været forbundet med EMT regulatoriske vej [18], [19]. Ved at screene Targetscan (https://www.targetscan.org) blev TCF4, CCND1 og SMAD2 forventes at være målet gener af miR155. Således har vi undersøgt TP53, SMAD2, TCF4, CMYC og CCND1 mRNA ekspressionsniveauer i Caski celler behandlet med EGF (50 ng /ml) i 3 dage med eller uden transfektion af miR155 efterligner (figur 4). Resultaterne viste, at TP53 blev nedreguleret i EGF-induceret EMT proces og opreguleret af miR155 overekspression, men TP53 ekspression induceret af miR155 blev grundigt vendes ved EGF behandling. miR155 overekspression faldt SMAD2 ekspression. Selv TCF4 blev bekræftet som en miR155 target protein ved en anden gruppe [20], ikke statistisk sås signifikante ændringer i vores eksperimenter for TCF4 mRNA-ekspression i EGF-induceret og miR155 efterligner transficerede celler. Derudover blev der ikke observeret ændringer for CMYC, som er en downstream mål for og reguleres af TCF4. CCND1 (a cellecyklus regulatorisk protein og en anden nedstrøms mål for TCF4) mRNA ekspressionsniveau blev nedreguleret ved miR155 overekspression og kan delvis vendes ved EGF behandling. , Formodes således vi, at miR155 vendt EGF-induceret EMT ved opregulering TP53, nedregulering af Smad2 ekspressionsniveauerne, og fastholdende cellevækst ved at hæmme CCND1 udtryk.

A. Forventede miR155-bindende steder i 3’UTR af SMAD2, TCF4 og CCND1 mRNA. B. TP53, SMAD2, TCF4, CMYC og CCND1 mRNA ekspressionsniveauer blev analyseret ved realtids-PCR i Caski celler behandlet med EGF (50 ng /ml) i 3 dage, med eller uden transfektion af miR155 efterligner. TP53 blev nedreguleret ved EGF behandling, men signifikant opreguleret af miR155 overekspression. Denne øgede TP53 udtryk blev vendt ved behandling Globaliseringsfonden. SMAD2 blev nedreguleret af både EGF behandling og miR155 overekspression. Behandling miR155-overekspression celler med EGF resulterede i et yderligere fald i SMAD2. Der blev ikke observeret signifikante ændringer i TCF4 eller CMYC mRNA mellem EGF-behandlede og miR155 efterligne-transfekterede celler. CCND1 mRNA ekspression blev nedreguleret af miR155 overekspression, og denne nedregulering blev delvist vendes ved behandling EGF.

overekspression af miR155 hæmmer Migration og Invasion evner Caski Celler

For at belyse effekter af miR155 om migration og invasion i Caski celler

in vitro

, transwell invasion /migration analyser udførtes (figur 5). Caski-miR155 og normale Caski-celler blev podet i indsatserne. Efter 24 timer blev antallet af de celler, der var overført til den nedre side af membranen beregnet til at kvantificere invasion og migration kapacitet. Antallet af celler, der passerede gennem membranen var signifikant lavere i CaSki-miR155 celler end i de normale Caski-celler. , Formodede vi, at miR155 forhindrer invasive og migration evner i Caski celler

in vitro

.

Caski-miR155 og Caski celler blev podet i Transwell indsætter med eller uden Matrigel. Indsatsene blev fikseret og farvet efter 24 timer, og derefter de migrerende /invaderende celler blev talt under et mikroskop. Antallet af Caski-miR155 celler passerer gennem membranen var signifikant lavere end i de normale Caski-celler, hvad enten detekteret ved migration eller invasion assays. Værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med S.D. indikeret ved fejlsøjler. * P. 0,05

miR155 Øget kemo-følsomhed Caski Celler til DDP

MTT metoden blev anvendt til at påvise effekten af ​​miR155 overekspression på kemo-følsomhed Caski celler til DDP. Resultaterne viste, at inhibering på Caski-miR155 når de behandles af DDP var meget højere end de normale Caski celler på en dosisafhængig måde. Proliferationshastigheden af ​​Caski-miR155 celler, når behandlet med DDP var meget langsommere end de normale Caski celler på en tidsafhængig måde (Figur 6 A, B). Behandling med DDP (10 pmol /l) i 24 timer resulterede i en meget højere apoptotisk celle-forhold i CaSki-miR155 celler end i de normale Caski-celler (Figur 6C). Ekspressionsniveauet af annexin A2, et protein involveret med apoptose resistens, blev bestemt ved WB. Disse resultater viste ikke, at annexin A2 blev nedreguleret ved miR155 overekspression (figur 6D).

A. Caski og Caski-miR155 celler blev behandlet med forskellige doser af DDP i 24 timer, og hastigheden for inhibering blev evalueret af en MTT-analyse. Middelværdi ± standardafvigelse, n = 4, P 0,05 ved ANOVA. B. Celleproliferation blev vurderet med en MTT assay. Caski og Caski-miR155 celler blev behandlet med DDP (10 pmol /l) i 0-3 dage. Middelværdi ± standardafvigelse, n = 4, P 0,05 ved ANOVA. C. mikroskopi blev anvendt til at observere apoptose af Caski og Caski-miR155 celler induceret af DDP (10 pmol /l) i 1 dag. Celler blev høstet, og FCM blev anvendt til analyse apoptose. Pilene viser placeringen af ​​toppen apoptose. D. Annexin A2-ekspression blev bestemt ved Western blot. Den Annexin A2-ekspression blev ikke reguleret af miR155 overekspression og kunne opreguleres ved behandling Globaliseringsfonden. Densitometrisk analyse af tre uafhængige tredobbelt vestlige blots.P 0,05, miR155- forhold til miR155 +, * P 0,05, EGF- sammenlignet med EGF +

Diskussion

EMT er en. dynamisk proces, som kan reguleres og vendes af mange faktorer, herunder miRNA. I denne undersøgelse, brugte vi den menneskelige Caski livmoderhalskræft cellelinje som model til at undersøge den rolle, miR155 i EGF-induceret EMT og forsøgt at besvare spørgsmålet om, hvorvidt miR155 regulerer EMT og har en rolle i metastase og kemo-følsomhed.

Vi brugte først EGF til at fremkalde EMT i Caski celler, som blev kontrolleret af E-cadherin, N-cadherin, udtryk og cellemorfologi. Den miR155 ekspressionsniveauet blev bestemt ved RT-PCR. En 12-gange forøgelse af miR155 ekspressionsniveau blev observeret efter behandling EGF, men ingen ændring blev fundet for miR200c, som var blevet rapporteret at være nedreguleret i bugspytkirtelkræft og andre faste tumorer [16], [17]. konkluderede vi, at miR155, men ikke miR200c, er involveret i EGF-induceret EMT i Caski celler. Lignende data offentliggjort af en anden gruppe viser også, at miR155 er opreguleret i EMT observeret i endometrie carcinosarcoma [10].

For at belyse den rolle miR155 i EMT, Caski cellelinjer overekspression miR155 overekspression blev bygget af stabile og forbigående transfektioner . Interessant, afvigende overekspression af miR155 dramatisk hæmmet celledeling, hæmmet migrering /invasion, og fremmet kemo-følsomhed Caski celler til DDP

in vitro

. Samtidig, fandt vi, at de celler, der overudtrykker miR155 blev mere kubisk, og kun en lille del af cellerne havde transformeret ind tenformede celler efter 3 dages behandling EGF. Nedreguleringen af ​​E-cadherin forårsaget af EGF behandling blev også delvis vendes ved miR155 efterligner i Caski-celler.

Tidligere forskning havde antydet, at MIR-155 var en kræftpsykologisk miR og at det overudtrykkes i en række humane maligniteter , herunder B-celle lymfom og carcinomer i bryst, colon, lunge, og ovarie [8], [9]. Det er blevet rapporteret, at MIR-155 undertrykte P53-induceret kerneprotein 1 (TP53NP1) og førte til pancreatisk tumorudvikling [21]. I brystcancer, miR155 forbedret de JAK2 /STATS signalvejen og transfektion af miR155 efterligner fremmet MDA-MB-231 og MCF-7-celleproliferation [22]. Vores data tyder imidlertid på, at miR155 overekspression hæmmer celledeling i Caski celler og forhindrer EMT. Lignende holdning om miR155 funktion blev godkendt af en anden gruppe [20], de viste sig at miR155 forhindrede EMT ved at nedsætte TCF-4 ekspressionsniveauet i 4T1 bryst tumorceller.

For at belyse den nøjagtige mekanisme af miR155 i celledeling og EMT i Caski-celler, vi analyseret ekspressionsniveauerne af nogle faktorer relateret til cellevækst og EMT (figur 7). Resultaterne viste, at TP53 ekspression blev opreguleret af miR155 overekspression og nedreguleres af EGF. Interessant, EGF-induceret E-cadherin nedregulering blev grundigt vendes ved transfektion med miR155 efterligner. Nylig undersøgelse antydede, at vildtype TP53 kontrollerede effektiviteten ved hvilken mammaepitelceller undergår EMT som respons på TGFp [23]. formodede vi Således miR155 vendt EMT gennem opregulering TP53 udtryk.

SMAD2 signalvejen er involveret i reguleringen af ​​proliferation, differentiering, apoptose og EMT [23]. I denne undersøgelse fandt vi, at med miR155 overekspression blev SMAD2 ekspression nedreguleres. Fordi der er to miR155 bindingssteder i 3’UTR af SMAD2 mRNA, foreslår vi, at miR155 negativt regulerer EMT gennem hæmning af Smad2 udtryk.

Vores resultater viser, at miR155 undertrykte migrationen og invasion evner Caski celler

i

vitro

. Et lignende resultat er blevet rapporteret i en anden undersøgelse med 4T1 brysttumorceller, hvori miR155 fandtes at direkte undertrykke ekspressionen af ​​TCF4 og negativt regulere EMT [20]. I vores undersøgelse, blev der ikke observeret statistisk signifikante ændringer i TCF4 udtryk niveau i Caski celler behandlet med eller uden EGF og miR155 efterligner. Nylig undersøgelse foreslog, at CCND1 øgede vandrende evne og årsag EMT i brystkræft [24]. CMYC og CCND1 er nedstrøms gener reguleret af TCF4 transkriptionsfaktor. I modsætning CMYC, der er en miR155-bindingssted i CCND1 3’UTR. I overensstemmelse med dette resultat, miR155 overekspression naturligvis nedreguleret CCND1 niveau, men havde ingen effekt på CMYC udtryk. Dette fund viste, at der ud over den TCF4 pathway, CCND1 kan også reguleres direkte af miR155.

Annexin A2 blev betragtet som en potentiel faktor til regulering af cellevækst, invasion og kemo-resistens [25 ]. Vores data viser, at EGF behandling fører til en stigning i Annexin A2-ekspression. Og der er ingen ændring i Annexin A2 udtryk under miR155 overekspression. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at klarlægge den mekanisme af Annexin A2 regulering af EGF.

Sammenfattende vi har vist, at i Caski celler, har miR155 ikke fungere som et onkogen, men som en tumor suppressor. miR155 reguleres negativt EGF-induceret EMT, nedsat proliferation, inhiberede migration /invasion og forøget kemo-følsomhed i Caski-celler in vitro. I EGF-induceret EMT, opregulering af miR155 er en begivenhed, celler kan kompensere for. Vores undersøgelse viser en ny aspekt af miR155 og dens rolle i tumor spredning og metastaser i livmoderhalskræft.

Støtte Information

Tabel S1.

Primere for Real-time PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0052310.s001

(TIF)

Tak

Vi takker Dr. Changbai Liu og Zhaoqi Liu for deres tekniske rådgivning og teknisk bistand i udfører real-time PCR. Vi takker også Ms. Ma Jielan for hendes bistand til gennemførelsen af ​​plasmid transfektioner og give GFP DNA-fragment. Vi takker personalet på Institut for Molekylær Biologi Three Gorges University.