PLoS ONE: Long Term Transkriptionel Reaktivering af epigenetisk tavshed gener i kolorektal Cancer Cells Kræver DNA hypometylering og histonacetylering

Abstrakte

Epigenetisk regulering af gener indebærer koordineringen af ​​DNA methylering og histon modifikationer for at opretholde transkriptionel status. Disse to funktioner er ofte forstyrret i malignitet, således at kritiske gener bukke under for inaktivering. 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) er et middel, der hæmmer DNA methyltransferase, og har et stort potentiale som en behandling for kræft, men omfanget af dens effektivitet varierer meget mellem tumortyper. Forrige tyder udtryk status efter 5-aza-dC eksponering kan ikke forklares ved DNA methylering status alene.

Sigt

Vi søgte at identificere kromatin ændringer involveret med kort og lang sigt gen reaktivering efter 5-aza-dC eksponering. To kolorektale cancer cellelinjer, HCT116 og SW480, blev behandlet med 5-aza-DC og derefter dyrket i stoffrie medier til at tillade DNA re-methylering. DNA methylering og kromatin ændringer blev vurderet med bisulfit sekventering og chromatin Immuno-Nedbør analyse.

Resultater

Øget H3 acetylering, H3K4 tri-methylering og tab af H3K27 tri-methylering var forbundet med reaktivering. Hypermethyleret gener, der ikke udviste øget acetylering blev kortvarigt udtrykkes med 5-aza-dC behandling, før man vender tilbage til en inaktiv tilstand. Tre reaktiveret gener, CDO1, HSPC105 og MAGEA3, stadig udtrykte 10 dage efter 5-aza-dC behandling og vises lokaliseret hypometylering på det transkriptionelle startsted, og også en øget berigelse af histon H3 acetylering.

Konklusioner

disse observationer tyder på, at hypometylering alene er utilstrækkelig til at genaktivere tavse gener og at øget histon H3 acetylering i samklang med lokaliseret hypometylering giver langsigtet reversion af disse epigenetisk tavshed gener. Denne undersøgelse tyder på, at kombinerede DNA methyltransferase og histondeacetylaseinhibitorer kan støtte langsigtede reaktivering af tavshed gener

Henvisning:. Mossman D, Scott RJ (2011) Long Term Transkriptionel Reaktivering af epigenetisk tavshed gener i kolorektal Cancer Cells Kræver DNA hypometylering og histonacetylering. PLoS ONE 6 (8): e23127. doi: 10,1371 /journal.pone.0023127

Redaktør: Michael Freitag, Oregon State University, USA

Modtaget: 16. december 2010; Accepteret: 12 Jul 2011; Udgivet: 4. august, 2011

Copyright: © 2011 Mossman, Scott. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af midler fra NBN Telethon, University of Newcastle og Hunter Medical Research Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det humane genom indeholder ca. 3 milliarder basepar af DNA [1], der kræver strategisk emballage til en kompakt, men alligevel dynamisk struktur. Kondens opnås med supercoiling af ~147 bp DNA omkring en octamer af histon proteiner (to kopier af hver H2A, H2B, H3 og H4) til at danne en nukleosom [2], som forhindrer utilsigtet genekspression og øger afhængigheden af ​​transkriptionelle aktivatorer [ ,,,0],3]. Transkriptionel repression kan være medieret af DNA-methylering og bistås af omfattende ændringer på højt konserverede lysinrester på haler histonproteiner. Lysin acetylering letter transskription ved at svække den sammenslutning af histon og DNA [4] og tillader transskriptionsfaktorbindende [5]. Lysin methylering er mere kompleks og kan være forbundet med både aktive og fortrængte områder af DNA, og kan være til stede i mono-, bi-, og tri-methyleret former [6]. For eksempel trimethylation af histon H3 lysin 4 (H3K4me3) er en aktiv mark [7], mens methylering af H3K9 og H3K27 vises transkriptionelt tavse genpromotorer [7], [8].

Afvigende epigenetisk inaktivering af gener kan initiere malignitet og vises ofte foruden genetiske ændringer, der bidrager til sygdomsprogression i flere former for kræft [9], [10], [11]. Desuden kan uregelmæssig hypometylering af proto-onkogener føre til deres aktivering [12], [13] Reduceret ekspression af talrige gener på grund af epigenetisk inaktivering korrelerer med dårlig prognose i mange former for malignitet såsom lunge [14], melanom [15] , bryst [16], gastrisk [17] og colon [18]. Sjældne forekomster af soma-dækkende mono-allelisk methylering af MLH1 er blevet vist at opstå via kimlinjeoverførsel [19]. Desuden kan arvelige kopi-nummer variationer resultere i transskriptionel læse og in-

cis

methylering når der støder op til de vigtigste gener [20]. Disse mekanismer giver en forklaring på, hvorfor nogle familier er på et højere risiko for sygdomsudvikling trods ikke bærer en underliggende genetisk mutation af afgørende gener. Individer i sådanne familier kunne drage fordel af tidlig påvisning af afvigende epigenetiske varemærker gener, der giver en forhøjet risiko for en bestemt sygdom. Med en stigende bevidsthed om epigenetiske abnormiteter i sygdom, modvirker disse ændringer med methyltransferase-hæmmere, såsom 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) synes at være en potentielt effektiv behandling. I virkeligheden er denne behandling ikke er effektiv i en specifik gruppe af tumortyper [21], hvilket kan skyldes reaktiveret gener vende tilbage til en lyddæmpet tilstand efter ophør af behandling.

Vi har tidligere identificeret reaktivering af talrige gener i kolorektale cancercellelinjer efter behandling med demethyleringsmiddel 5-aza-dC [22]. Ved fjernelse af lægemidlet og ti dages vækst forblev nogle af disse gener stærkt udtrykt, hvilket tyder på en vending af den transkriptionelle status for disse gener. Selvom reduceret med 5-aza-dC, har ændringerne i DNA methylering ikke korrelerer med niveauerne af udtryk i gruppen af ​​gener analyseret, hvilket indikerer andre epigenetiske ændringer blev kontrollerende transskription. De udvalgte til analyse gener blev undersøgt på grund af deres involvering i en række tumortyper og mulig anvendelse som biomarkører i disse tumorer [23], [24], [25], og /eller på grund af deres stærke re-ekspression og mønsteret for genekspression efter 5-aza-dC i kolorektale cancerceller [22]. CDKN2A blev valgt specifikt som det ofte er undertrykt i kolorektale kræftsvulster [26]. Disse gener kan repræsentere vigtige gener i den epigenetiske udvikling af en række tumortyper. I denne undersøgelse har vi karakteriseret ændringerne i DNA methylering og kromatin tilstand, der giver mulighed for enten en lang eller kort sigt reaktivering af udtryk følgende 5-aza-dC eksponering.

Metoder

Cell Culture

Tredobbelte kulturer af HCT116 og SW480-celler blev dyrket i DMEM-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 37 ° C og 5% CO

2. Celler blev behandlet med 5-aza-2′-deoxycytidin (Sigma-Aldrich) som tidligere beskrevet [22]. DNA og RNA blev ekstraheret fra ubehandlede celler, 5-aza-dC behandlede celler (72 timers behandling), og efter 4 og 10 dage efter ophør af behandling (dag 4 og 10 af re-methylering). Cellerne blev oprindeligt opnået fra ATCC og blev godkendt ved hjælp af Identifiler DNA identifikation kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ifølge producentens instruktioner.

Global methylering

Global methylering var vurderet som tidligere beskrevet [22]. Kort fortalt 50 ug DNA blev enzymatisk fordøjet med nuclease P1 (US Biological, Swampscott, MA, USA) efterfulgt af kromatografisk separation på et Varian Stjerne Kromatografi arbejdsstation med et Supelcosil LC-18-DB-søjle (Sigma-Aldrich). Absorbans blev overvåget ved 278 nm, og toparealer blev kvantificeret med Star Anmelder Software (Varian, Palo Alto, CA, USA). Indholdet 5-methylcytosin blev udtrykt som en procentdel af den samlede cytosin puljen efter korrektion for udryddelse koefficienter.

Bisulfite Sequencing

DNA blev omdannet i to eksemplarer ved hjælp af et Qiagen Epitect Bisulfite konvertering kit ( Qiagen, Valencia, CA, USA) under anvendelse af 2 ug phenol-chloroform oprenset DNA. Prøver blev elueret i 30 pi elueringspuffer, og en prøve blev fortyndet 1:03 før PCR og opbevaret ved 4 ° C, mens de resterende fraktion blev opbevaret ved -20 ° C. CpG-øer omkring transkriptionsstartstedet af gener blev målrettet i PCR-analyse under anvendelse af primerne, der er anført i tabel S1. Sekventeringsreaktioner blev udført in duplo, og blev analyseret på en ABI 3730 sequencer. Dataanalyse blev udført ved hjælp af Sequence Scanner software (Applied Biosystems). Procentdelen methylering ved hver CpG blev bestemt ved at dividere den maksimale cytosin ved de kombinerede højder af cytosin- og thymin toppe som tidligere beskrevet [27].

Real Time PCR-analyse af genekspression

RNA blev omdannet til cDNA ved anvendelse af Superscript II (Invitrogen) og vilkårlige primere (Promega) ifølge producentens anvisninger. Reaktioner blev udført tredobbelt under anvendelse af primere, der er opført i tabel S1, 2 × SYBR Green (Applied Biosystems) i et ABI PRISM 7500 PCR-maskine (Applied Biosystems). C

T-værdier bestemmes automatisk af Sequence Detection Software version 1.4 og de endelige beregninger blev udtrykt som fold forskelle i forhold til B-actin ved hjælp af ΔΔC

metode T. Gener med uopdaget udtryk blev tildelt en C

T værdi på 40. Fejllinjer i udtryk tal repræsenterer standardafvigelsen.

chromatin Immunfældning (chip) og Analyse

Kort fortalt tværbinding af DNA med protein og cellelyse blev udført ved anvendelse af EZ-Magna chIP Kit (Upstate /Millipore) ifølge producentens instruktioner. Lydbehandling blev udført under anvendelse 8 × 30-sekunders cyklusser ved 60% arbejdscyklus i et isbad, og prøver blev yderligere afkølet i 30 sekunder i mellem lydbehandling cyklusser. Kromatin Immunfældning blev udført som tidligere beskrevet [28] med små ændringer. Antistoffer blev opnået fra Upstate (katalognumre; a-H3Ac 06-599, α-H3K4me3 07-473, α-H3K9me3 17-625, α-H3K27me3 17-622) med undtagelse af kanin-IgG ikke-specifikt antistof fra Santa Cruz Biotechnology (Katalognummer SC2027). Antistof-mængder pr reaktionen blev bestemt i præliminære eksperimenter og var 5 pi for α-acetyl H3, 5 pi for α-H3K4me3, 4 pi for α-H3K9me3, 4 pi for α-H3K27me3. 5 pi af kanin-IgG blev tilsat til negative kontrolprøver. Tværbindinger blev tilbageført med tilsætning af 20 pi proteinase K (Promega) og inkuberet ved 62 ° C i 3 timer under omrystning. Udvundne DNA blev dernæst oprenset under anvendelse af en PCR rense kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).

Real time PCR-analyse af immunpræcipiteret kromatin

DNA blev kvantificeret under anvendelse af DNA Kvantificering System (Promega ) ifølge producentens instruktioner, og målinger blev taget ved anvendelse af en TD 20/20 luminometer (Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA). Real-time PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af 200 ρg af DNA-template med SYBR Green 2 × mastermiksens (Applied Biosystems) og primere anført i tabel S1. Reaktioner blev udført i tre eksemplarer og udføres ved anvendelse af en ABI PRISM 7500 PCR-maskine (Applied Biosystems). C

T-værdier bestemmes automatisk af Sequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems) og de endelige værdier blev udtrykt som en procentdel af input fraktion. Fejl barer i tal kromatin forandring repræsenterer standardafvigelsen.

Statistisk analyse

Standard afvigelser blev beregnet, og en T-test blev anvendt til at sammenligne ekspressionsniveauerne og histon modifikation niveauer i narkotika behandlede celler mod ubehandlet celler.

P

-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Genomisk DNA Methylering med 5-aza-dC behandling

Global methylering koncentrationen faldt efter 5-aza-dC behandling med 53% og 59% i HCT116 og SW480-cellelinier (figur 1). Dette udgør et signifikant fald i forhold til celler, der var mock behandlet som ikke undergår demethylering (HCT116 p-værdi = 0,003, SW480 p-værdi = 0,017). Fortsat inkubation af celler i yderligere ti dage efter behandling i narkotika frie medier tilladt DNA re-methylering og genomiske niveauer steget, men vendte ikke tilbage til samme niveau som observeret inden behandling i denne periode.

Genomisk methylering niveauer faldt betydeligt i begge cellelinier efter 5-aza-dC eksponering. Genomisk methylering niveauer blev gradvist genoprettet i løbet af de næste ti dage stoffri vækst, hvor de blev nærmer før narkotikabehandling niveauer.

Gene Specifik methylering og re-udtryk med 5-aza-dC behandling

Brug genom brede udtryk arrays vi tidligere har identificeret mønstre af genekspression efter 5-aza-dC behandling [22]. De samme gener blev igen undersøgt i denne undersøgelse, så karakterisering af histon modifikationer. I dette forsøg blev ekspression bestemt med kvantitativ PCR og gener blev derpå klassificeret i fem kategorier; ‘Altid-udtrykt “(ekspression detekteret ved alle tidspunkter),” opreguleret “(to gange i ekspression efter 5-aza-dC behandling),» langsigtet genaktiveret “(uopdaget i ubehandlede celler, men udtrykt efter behandling som samt fire og ti dage efter eksponering lægemiddel (baseret på en C

T-værdi på 40 til upåviselige transkripter)), ‘kort sigt genaktiveret “(samme som” langsigtet genaktiveret “med undtagelse af dag fire og /eller ti udtryk som var forpligtet til at være 100 gange over niveauet for ubehandlede celler), eller “andre” (en anden mønster af genekspression)

de tre gener, der blev genaktiveret i en kort periode kun (. CXCL6 og ZFP3 i HCT116-celler og CDKN2A i SW480-celler) blev alle hypermethyleret hele analyseret region af deres CpG-øer. Ekspressionsmønsteret af disse gener var markant forskellig i den anden af ​​de to cellelinier; her viste disse gener meget lidt eller lav methylering ved transkriptionsstartstedet (TSS) og blev enten udtrykkes kontinuerligt eller blev opreguleret (figur 2). De gener, der forblev stærkt udtrykte efter reaktivering (CDO1, HSPC105, MAGEA3) viste enestående methylering profiler og fremhævede en hypomethylated CpG nabostillet til transkriptionsstartsitet (TSS) som vist i figur 3. CpG island specifikke demethylering efter behandling var 10- 15% højst ,, derfor kun ubehandlede methyleringsmønstre er vist i figur 2 og 3. data for de fire tidspunkter er vist i fig S1 for MAGEA3 genet, som udviste den største gen associeret fald i DNA-methylering. Et eksempel på direkte sekventering kromatogrammer af MAGEA3 er vist i figur S2

A – CXCL6 CpG island methylering.; kort sigt v altid udtrykt. (B) – SW480 celler viste hypometylering og CXCL6 blev udtrykt på alle tidspunkter. (C) – Ensartet hypermethylering af HCT116 cellelinien var forbundet med en kortvarig reaktivering af ekspression. D, E, F – CDKN2A CpG Island methylering; kort sigt v konstant udtryk. SW480 celler vise CDKN2A hypermethylering og blev midlertidigt igen udtrykt, mens i HCT116 celler CDKN2A er -50% methylerede ved CpG websteder nær TSS, og blev udtrykt på alle tidspunkter. Asterisk angiver signifikant ændring sammenlignet med ubehandlede celler. G, H, I – ZFP3 CpG Island methylering; kort sigt v opreguleret udtryk. SW480 celler viste hypometylering på CpG steder nær TSS og udtryk blev opreguleret efter 5-aza-dC behandling. ZFP3 forbliver hypermethyleret i HCT116 celler og blev midlertidigt reaktiveres med 5-aza-dC behandling. J – Væsentlige ændringer i histon modifikationer sammenlignet med ubehandlede celler (p 0,05).

A, B, C – CDO1 CpG Island methylering; langsigtet v kort sigt udtrykkes. Sekventering analyse viste CpG sites nær TSS i SW480 celler har lavere methylering og vises langsigtet udtryk i forhold til HCT116 celler, som er ensartet hypermethyleret på CDO1 og erfarne en opreguleret mønster af udtryk. D, E, F – HSPC105 CpG Island methylering; altid udtrykt v langsigtet udtrykkes. Den SW480 cellelinje viser lokaliseret hypometylering på TSS og kan forblive udtrykkes ti dage efter behandling. Den HCT116 cellelinien hypomethylated på HSPC105 promotoren og kontinuerligt udtrykkes. G, H, I – MAGEA3 CpG Island methylering; altid udtrykt v langsigtet re-udtrykkes. SW480 celler viser lokaliseret hypometylering på TSS og er udtrykt ti dage efter behandling. HCT116 celler viser -50% methylering ved TSS og MAGEA3 udtrykkes på alle tidspunkter. J – Væsentlige ændringer i histon modifikationer sammenlignet med ubehandlede celler (p 0,05).

Gener bestemt til at være “altid udtrykt” vises højst 50% methylering på TSS som foreslår mono-allele methylering, og op-regulerede gener viste varierende mønstre af methylering. MLH1-genet blev udtrykt i begge cellelinier og methylering blev ikke påvist i TSS associeret CpG øen (data ikke vist). Omvendt blev en variant af DICER1 ikke udtrykkes enten cellelinje på noget tidspunkt som bestemt ved microarray analyse og fraværet af dets ekspression blev bekræftet ved kvantitativ PCR. DICER1 er ikke forbundet med et CpG island, derfor bisulfit sekventering analyse blev ikke udført. CDKN2A blev udtrykt i HCT116 og viste delvis methylering på TSS. Den tilsvarende region i SW480 celler hypermethyleret og udtryk blev klassificeret som kort sigt igen efter behandling.

Fortsat inkubation af celler i narkotika frie medier tilladt igen methylering af DNA, som vendte tilbage til de oprindelige niveauer promoter CpG øer . Genekspression blev ikke nødvendigvis påvirket af tilbagelevering af promotor methylering dog, og udtryk for CDO1, HSPC105 og MAGEA3 gener i SW480 celler fortsat høj ti dage efter 5-aza-dC behandling. Disse gener viste unikke CpG ø methylering mønstre at funktionen hypomethylated CpG sites støder op til TSS. Som methylering niveauer på promoter CpG øer ikke præcist afspejler udtryk for de undersøgte gener, vi søgte at undersøge mønstre af histon ændringer på de respektive CpG øer, der kan tegne sig for høje niveauer af udtryk.

Chromatin ændringer efter 5-aza-dC eksponering

chromatin Immunpræcipitation og q-PCR viste, at Histon H3Ac og H3K4me3 var træk forbundet med udtrykte gener såsom GAPDH og MLH1 og fortrængte gener var forbundet med H3K9me3 og mindre hyppigt H3K27me3 som var fraværende fra konstitutivt udtrykte gener .. chip resultaterne er opsummeret i figur 2 og 3, med p-værdier er anført i tabel 1. Specifikke ændringer i kromatin modifikation er vist i fig S3, S4, S5, S6.

ændringer i kromatin proteiner efter 72 timers eksponering var afhængige af genekspression status. Gener med større ekspression efter behandling steg i H3K4me3, mens H3Ac kun var forbundet med gener genaktiveret i længere perioder. Generelt de repressive H3K27me3 mærker blev reduceret efter behandling, med undtagelse af CXCL6 gen. En sammenligning af histon modifikationer i kortsigtede reaktiverede gener viste forbigående stigning af histon H3K4me3 og nedsat eller stabilt niveau af trimethyl-histon H3 lysin 9 og 27. På trods af dette, transkription af disse gener ti dage efter behandling var på et tilsvarende til ubehandlede celler. Den mest synlige forskel på kort og lang sigt reaktiveret gener var H3Ac modifikation. Gener anses for at være “langsigtet reaktiveret” afslørede en stigning på H3Ac, men ikke altid nå statistisk signifikans, efter behandling, som varede indtil ti dage efter lægemiddelbehandling. Der var også en tendens i langsigtede re-udtrykte gener, hvor en reduktion i H3K27me3 blev observeret op-regulerede gener (CDO1 i HCT116 celler og ZFP3 i SW480) og gener, som altid blev udtrykt viste en gevinst på aktive kromatin mærker og et tab af repressive histon ændringer efter 5-aza-dC eksponering.

diskussion

epigenetiske kontrol af genekspression medieres af DNA methylering og histon modifikationer. Ved at ændre DNA methylering og op-regulering af genekspression vi kan identificere mønstre af ændring i histon protein ændringer, der ledsager den lange og korte sigt reaktivering af epigenetisk tavshed gener. Af særlig relevans for denne undersøgelse var den tilsyneladende transkriptionelle opregulering af tavshed gener, der viste mindre end 15% DNA demethylering, hvor histon modifikationer vil sandsynligvis blive involveret i reguleringen af ​​genekspression i disse tilfælde.

Den virkning af DNA-methylering på genekspression

Uanset ekspressionsmønsteret under lægemiddelbehandling, omfanget af methylering af bestemte CpG-øer forblev relativt uændret i forhold til genomiske niveauer efter 5-aza-dC eksponering. Denne observation er blevet gjort tidligere, med methylering af gentagne sekvenser kan bidrage til denne uoverensstemmelse [22], [29]. En anden undersøgelse har vist, at DNA-methylering stiger ved promotorer af ikke-udtrykte gener, når inhiberet af doxycyclin i en tet-responsiv promotor-system [30]. Konstitutivt udtrykte gener blev hypomethylated på begge alleler, eller udviste CpG ø metylering på 50%, hvilket viser mono-allelisk methylering, såsom CDKN2A genet i HCT116-celler som tidligere vist [31]. Let demethylering af promoter CpG øer blev induceret med 5-aza-dC, men udtryk var ikke nødvendigvis begrænset i nogle gener, når methylering vendte tilbage til de oprindelige niveauer. Høj ekspression af langsigtede reaktiverede gener syntes at være afhængig af allerede eksisterende hypometylering på TSS uanset om de hosliggende bindingssteder for CpG blev hypermethyleret. Dette resultat indikerer mønsteret af methylering snarere end det generelle niveau for methylering tværs CpG øen er afgørende for at genaktivere lyddæmpede gener via interaktioner med andre epigenetiske faktorer. Hypomethylated CpG sites inden hypermethyleret promotorer er tidligere blevet identificeret i Oncostatin M receptor genet [27], men effekten af ​​denne hypometylering på transkription blev ikke undersøgt. Hvorfor udtryk for de langsigtede reaktiveret gener ikke forekomme i de ubehandlede celler, som viste en næsten identisk methylering mønster kan forklares ved ændringer i modifikationer på histonproteinerne.

Effekten af ​​histon ændringer på genekspression

Et øjebliksbillede af faktorer, der styrer genekspression blev opnået med udarbejdelse af CpG ø sekventering og kromatin immuno-nedbør resultater. Ved reaktivering af talrige gener og klassifikation af udtryk, kunne vi skelne mellem generne baseret på methylering og kromatin ændringer tilstedeværende. Forud for behandling, transkriptionelt inaktive gener blev karakteriseret ved højere niveauer af repressive modifikationer og lavere niveauer af aktiverende varemærker. Ved behandling med 5-aza-dC var der generelt en stigning til niveauet af H3K4me3 og H3K9me3, mens H3Ac steg kun i nogle af generne. Reduktioner til H3K27me3 fandt sted i gener, der oprindeligt viste dette træk. Med hensyn til kromatin modifikationer, det var under stoffri vækstperiode at histonacetylering blev den mest skelnes træk mellem kort- og langsigtede genaktiveret gener. Lang sigt reaktiveret genpromotorer blev i stigende grad forbundet med acetylering af histon H3 bistå med genaktivering dog kun nået betydelige niveauer efter ti dages stoffri vækst. Midlertidigt reaktiveret gener ikke tiltrække denne ændring på trods af en kort periode af udtryk. Det ser derfor ud, at indførelsen af ​​H3 acetylering er en afgørende faktor i at vende transkriptionel status som epigenetisk tavshed gen, som assisteres af lokaliseret DNA hypometylering. Med undtagelse af H3K27me3 på CDKN2A i SW480 celler, blev langtidsholdbare ændringer epigenetiske modifikationer ikke observeret i midlertidigt reaktiveret gener.

opregulering af ringe udtrykte gener var forbundet med øget H3 acetylering og H3K4me3, såsom den ZFP3 genet i SW480-celler. Methylering profiler som denne kan indikere en mellemting mellem altid-udtrykte gener, og de langsigtede reaktiveret gener. Co-eksisterende aktive og undertrykkende mærker kan tillade en begrænset niveau af transskription, hvilket tyder kontrol af ekspressionen af ​​disse gener er afhængig af ligevægt i begge typer af ændringer.

I de undersøgte i denne undersøgelse gener, roller histon H3 acetylering og H3K27me3 var tilsyneladende som aktivering og undertrykker mærker henholdsvis har dog effekten af ​​H3K4me3 og H3K9me3 ikke synes tilstrækkelig til at ændre genekspression på lang sigt. Efter 5-aza-dC eksponering blev H3K9me3 ofte forøget ved udtrykte gener, som tilslutter sig de seneste resultater, at det også kan kobles med genaktivering [29], [32], [33]. Tilsvarende blev H3K4me3 som associerer med aktive områder af genomet findes på inaktive gener, om end på et reduceret niveau. Observationer af denne art fremhæve den dynamiske karakter af kromatin og eventuelt foreslå en mellemform af undertrykkelse ligner bivalent kromatin omgivende udviklingsmæssige gener [34] eller den virkning nabolandet kromatin, der er blevet registreret på grund af variationer i klipning effektivitet under lydbehandling.

Sammenkædning DNA methylering, kromatin ændringer og genekspression

mønstrene udtryksformer af re-aktiveret og opreguleret gener kan i vid udstrækning forklares med kombinationen af ​​promotor methylering analyse og kromatin immuno-nedbør analyser. Ved observation og sammenligning af lange og korte sigt reaktiveret gener, vores resultater viser, at gener med en lokaliseret hypometylering på TSS er mere tilbøjelige til at opleve en stigning på histon H3 acetylering og forblive udtrykt efter 5-aza-dC eksponering. Derudover har vi observeret, at specifik genekspression blev reaktiveret uden væsentlig ændring i den tilhørende CpG øen methylering og dette var uafhængig af nærliggende hypermethylering inden for samme CpG øen.

En sekvens af begivenheder, der er involveret med epigenetisk reaktivering er blevet foreslået af Litt

et al.

[35]. Forfatterne anfører, at reaktivering af HPRT-genet krævede hemi-demethylering af promotoren, ‘åbning’ af kromatin struktur, transskriptionsfaktorbindende og samling af transkriptionskomplekset før syntese af den HPRT-RNA. Baseret på vores eksperimenter, kan vi udvide denne viden ved at foreslå, at mindre demethylering induceret af 5-aza-dC og øget H3K4me3 tillader initiering af transskription. Rolle H3K9 trimethylation er ikke klart, men kan være forbundet med reaktivering i nogle tilfælde. Et tab af undertrykkende mærker såsom H3K27me3 kan også øge transskription. Selvom det ikke er undersøgt her, det er muligt MBD2 bindende kunne gå tabt på dette punkt, som ikke længere ville afholde histonacetyltransferase fra område [36]. Transskription forlænges, hvis der opstår øget acetylering af histon H3, ellers udtryk er forbigående og genekspression vil sandsynligvis vende tilbage til en inaktiv tilstand.

Methyltransferase Inhibitors i behandling af tumorer

Tidligere undersøgelser har vist, gener anvendt i denne undersøgelse bukke under for methylering i andre maligniteter såsom visse former for brystkræft [24] og ovarie [37] cancer. Derfor kan den i dette studie reaktivering ikke være begrænset til kolorektal cancer, men også andre tumortyper hvor tilbageførsel af epigenetisk undertrykkelse kan være af terapeutisk fordel. Effekt af 5-aza-dC som behandling er begrænset til visse tumortyper dog hvad der forårsager et positivt resultat fra 5-aza-dC behandling er ukendt. Dens succes kan ligge med methylering mønster på i øjeblikket un-identificerede målgener og narkotika evne til at genaktivere tavse gener over en længere periode. Derfor tyder vore resultater, at undertrykte gener udviser lokaliseret TSS hypometylering kan reaktiveres med kombineret methyltransferase /histondeacetylaseinhibitor behandling. Øget acetylering på hypermethyleret transcription start sites, der fører til langsigtet reaktivering af anti-proliferative gener kan være gavnlige i behandlingen af ​​tumorer, når disse oplysninger er kendt. Denne mekanisme vil være et supplement til den rapporterede synergistisk apoptotiske effekt af methyltransferase og histondeacetylaseinhibitorer [28], [38].

Konklusion

Analyse af kromatin ved promotoren af ​​generne i denne undersøgelse tyder på, at den eksisterende hypometylering følgende (men ikke nødvendigvis fremkaldt af) 5-aza-dC behandling, hjælpemidler histon H3 acetylering, enten direkte eller indirekte. Kombinationen af ​​hypometylering af CpG sites på TSS og H3 acetylering resultat i stabil reaktivering af de undersøgte her gener. Resultaterne af denne undersøgelse fremhæve de epigenetiske træk, der skal ændres med hensyn til reversering af transkriptionel status af gener i behandlingen af ​​sygdom. En mere strategisk tilgang vil føre til udviklingen af ​​epigenetiske behandlingsformer snarere end brugen af ​​epigenetiske-modificerende stoffer som cytotoksiske behandlinger.

Støtte oplysninger

figur S1.

Methylering af MAGEA3 i SW480 celler behandlet med 5-aza-dC. Bisulfit sekventering PCR blev udført ved hvert tidspunkt og plottet at vise ændringer før og efter 5-aza-dC behandling, viste MAGEA3 gen den største demethylering af alle generne analyseret, med et fald på 10-15% på flere CpG sites nær TSS-genet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0023127.s001

(TIF)

Figur S2.

Methylering på MAGEA3 transkriptionsstartsitet. A – Promoter methylering tværs over MAGEA3 CpG øen. Den røde linje viser, at regionen sekvens vist i B og C. B – Methylering på MAGEA3 TSS i SW480 celler. Direkte sekventering af PCR-produkter bisulfit forårsager dual C og T toppe ved bindingssteder for CpG, og er repræsentative for methylerede og ikke-methylerede alleler hhv. Den CpG websted støder op til TSS viser en større andel af T alleler (der repræsenterer umethyleret cytosin), der indikerer hypometylering, mens nærliggende CpG websteder viser øget cytosin toppe og højere methylering niveauer. Pile viser bindingssteder for CpG, boxed Ts indikerer positionen af ​​ikke-CpG cytosin og understregede sekvens repræsenterer transkriptionsstartstedet. C – CpG steder i HCT116 cellelinie er større end 50% methylerede

doi: 10,1371 /journal.pone.0023127.s002

(TIF)

Figur S3..