PLoS ONE: Polyfunktionelle T-celle responser forstyrres af kræft i æggestokkene Ascites Miljø og kun delvist restaureret ved klinisk relevante Cytokines

Abstrakt

Baggrund

Host T-celle responser er forbundet med gunstige resultater i epitelial ovariecancer (EOC), men det er uklart, hvordan man bedst kan fremme disse reaktioner hos patienter. Mod dette mål vi evaluerede et panel af klinisk relevante cytokiner for evnen til at forbedre flere T-celle effektorfunktioner (polyfunctionality) i native tumor miljø.

Metodologi /vigtigste resultater

Eksperimenter var udføres med hjemmehørende CD8 + og CD4 + T-celler i bulk-ascites cellepræparater fra high-grade serøse EOC patienter. T-celler blev stimuleret med α-CD3 i nærværelse af 100% autologt ascitesvæske med eller uden exogent IL-2, IL-12, IL-18 eller IL-21, alene eller i kombination. T-celle-proliferation (Ki-67) og funktion (IFN-γ, TNF-α, IL-2, CCL4, og CD107a ekspression) blev vurderet ved flere parametre flowcytometri. Sideløbende hermed blev 27 cytokiner målt i dyrkningssupernatanter. Mens ascitesvæske havde variable virkninger på CD8 + og CD4 + T-celle-proliferation, det hæmmede T-cellefunktion i de fleste patientprøver, med CD107a, IFN-γ, og CCL4 viser den største inhibering. Dette var ledsaget af reducerede niveauer af IL-1β, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, og bFGF i kultursupernatanter. T-celleproliferation blev styrket ved exogent IL-2, men andre T-cellefunktioner var stort set upåvirket af enlige cytokiner. Kombinationen af ​​IL-2 med cytokiner indgreb komplementære signalveje, især IL-12 og IL-18, forøget ekspression af IFN-γ, TNF-α, og CCL4 i alle patientprøver ved at fremme polyfunktionelle T-celle responser. På trods af dette, andre funktionelle parametre generelt forblevet hæmmet.

Konklusioner /Betydning

EOC ascites miljø forstyrrer flere T-celle funktioner og eksogene cytokiner engagerende forskellige signalveje kun delvist vende disse effekter. Vores resultater kan forklare den begrænsede effektivitet af cytokin terapier for EOC til dato. Fuld restaurering af T-celle-funktion vil kræve aktivering af signalveje ud over dem, engageret af IL-2, IL-12, IL-18 og IL-21

Henvisning:. Tran E, Nielsen JS, Wick DA , Ng AV, Johnson LDS, Nesslinger NJ, et al. (2010) Polyfunktionelle T-celle responser forstyrres af kræft i æggestokkene Ascites Miljø og kun delvist restaureret ved klinisk relevante Cytokiner. PLoS ONE 5 (12): e15625. doi: 10,1371 /journal.pone.0015625

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: August 13, 2010; Accepteret: November 19, 2010; Udgivet: 22 December, 2010

Copyright: © 2010 Tran et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af British Columbia Cancer Foundation, United States Department of Defense, og naturvidenskab og Forskningsråd i Canada. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Talrige undersøgelser i de sidste ti år har vist, at immunsystemet påvirker kliniske resultater hos patienter med høj kvalitet serøs epitelial ovariecancer (i det følgende benævnt EOC). Specifikt er tilstedeværelsen af ​​tumor-infiltrerende CD8 + T-celler i forbindelse med forlænget sygdomsfri og samlet overlevelse [1], [2]. Desuden er forhøjede antal CD56 + T-celler i ascites rum korreleret med øget platin følsomhed [3]. For nylig ascitesvæske indeholder forhøjede niveauer af IL-17 (et cytokin overvejende produceres af Th17 og andre effektor-T-celler [4]) var korreleret med forøget total overlevelse [5]. Tilsammen antyder disse undersøgelser at øge den endogene T-celle respons på EOC kan være af klinisk gavn for patienterne. Imidlertid ovarietumoren miljø indeholder mange immunosuppressive celletyper og faktorer, der kan modsætte anti-tumor T-celle responser. Følgelig er forhøjede antal tumorassocierede regulatoriske T-celler (tregs) og makrofager forbundet med dårlig overlevelse i EOC [1], [2]. Mange opløselige immunosuppressive faktorer findes også i ascites, herunder IL-10, TGF-β, VEGF, B7-H1 /PD-L1, B7-H4, SDF-1, EBAG9 /RCAS1, Fas-ligand, og opløselig IL-2-receptor [1], [2].

heterogenitet af immunosuppressive mekanismer i EOC præsenterer en enorm udfordring for immunterapi, da det tyder på, at flere immunosuppressive mekanismer skal muligvis vendes til at genoprette T-celle funktion. For eksempel er Treg depletering blive evalueret som et middel til at øge immunitet over for flere humane cancere [6], herunder EOC [7], men i bedste fald ville kun vende én mekanisme af immunsuppression, efterlader andre immunologiske barrierer intakt. Snarere end at forsøge at deaktivere disse barrierer én efter én, ville en mere pragmatisk klinisk tilgang være at levere faktorer, som i store træk kan tilsidesætte immunosuppressive barrierer i tumoren miljø. Således identificere de signaler eller betingelser, der fremmer T-celle responser i EOC miljø kan føre til mere effektive immunterapeutiske strategier.

Til dette formål har vi tidligere udviklet en musemodel for EOC, der tillader funktionel vurdering af CD8 + T celle responser i ovarietumoren miljø [8]. Konkret har vi udviklet en murin EOC tumorlinie at udtrykke en CD8 + T-celleepitop fra modellen antigen ovalbumin. Mus bærende avancerede, bredt disseminerede tumorer med omfattende ascites blev behandlet ved adoptiv overførsel af CD8 + -T-celler specifikke for ægalbumin epitop. Bemærkelsesværdigt, adoptivt overførte CD8 + T-celler undergik kraftig proliferation ikke kun i lymfeknuder og perifert blod, men også i ascites og tumor rum. Faktisk på toppen af ​​reaktionen, de overførte T-celler udgør op til 40% af CD8 + T-celler i perifert blod, og op til 96% af CD8 + T-celler i ascites. Denne dybe proliferativ respons blev efterfulgt af hurtig og næsten fuldstændig tumorregression i størstedelen af ​​dyrene, hvilket viser, at T-cellerne var funktionelt aktive. Vigtigere, spredning og antitumoraktiviteten af ​​de overførte CD8 + T-celler var ganske afhængig af IL-2 /IL-15-signalering, hvilket fremgår af genetisk afbrydelse af IL-2-receptor-alfa (CD25) eller beta (CD122) underenheder [ ,,,0],8]. Selv i fastsættelsen af ​​avancerede tumorer i æggestokkene, CD8 + T-celler monteret potente anti-tumor svar, at IL-2 /IL-15 signalveje var intakte.

De foregående resultater rejst spørgsmålet om, hvorvidt cytokiner sådanne IL-2 kan tilsvarende over-ride immunosuppressive virkninger af ascites i human EOC. Forrige

in vitro Salg studier med humane EOC prøver har vist, at IL-2 delvis kan gendanne lymfokin-aktiverede dræber (LAK) celle cytotoksicitet i nærvær af 50% ascitesvæske, mens kombinationen af ​​IL-2 med TCR stimulation [9] eller IL-12 [10], [11] fuldt restaureret LAK cytotoksicitet. Dog er brug af 50% ascitesvæske alene ikke fuldt rekapitulere ovarietumoren miljø, som også indeholder immunosuppressive celletyper såsom tregs og MDSCs [1], [2]. Desuden er laks overvejende består af NK-celler, der kan blive berørt forskelligt af ascites i forhold til T-celler. Desuden er disse tidligere undersøgelser målte cytotoksicitet ved bulk LAK-cellepræparater og derfor ikke belyse virkningerne af cytokiner på forskellige T-celle-delmængder. Endelig

in vitro

cytotoksicitet er kun ét aspekt af T-celle funktion og ikke altid korrelerer med effektive T-celle responser

in vivo

[12].

Der er voksende forståelse for betydningen af ​​polyfunktionelle T-celler (dvs. T-celler, som samtidig kan udføre flere funktioner) i effektive immunresponser [13]. Specifikt polyfunktionelle T-celle-responser forbundet med beskyttende immunitet efter vaccination mod kopper (vacciniavirus) [14], gul feber [15], tuberkulose [16], [17], og leishmaniasis [18]. Forhøjede antal polyfunktionelle T-celler er også korreleret med gunstige resultater i en række forskellige indstillinger sygdom, herunder hiv /aids [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25] , [26], [27], [28], [29], hepatitis C [30], og lymfocytær choriomeningitisvirus [31]. I indstillingen af ​​cancer, har flere undersøgelser vist forbedrede antal tumorspecifikke polyfunktionelle T-celler i patienter, der responderede positivt på forskellige former for immunterapi, herunder adoptiv T-celleterapi, α-CTLA-4-antistof terapi og tumorvacciner [32] , [33], [34], [35], [36].

i den foreliggende undersøgelse vurderede vi for første gang virkningen af ​​den humane EOC ascites miljø på T-celle polyfunctionality. Vi evaluerede også evnen af ​​IL-2 og tre andre klinisk relevante cytokiner (IL-12, IL-18 og IL-21) til at gendanne et bredt udvalg af T-cellefunktioner. Vi fandt, at ascites inhiberede polyfunktionelle reaktioner fra både CD4 + og CD8 + T-celler, med visse funktioner, der viser større inhibering end andre. Endvidere blev kun en delmængde af T-cellefunktioner restaureret af exogene cytokiner leveres alene eller i kombination. Således vil fuldstændig genoprettelse af T-cellefunktion i EOC kræver aktivering af signalveje end dem beskæftiget med IL-2, IL-12, IL-18 og IL-21.

Resultater

EOC ascites forstyrrer flere T-cellefunktioner

Primære ascites prøver blev indsamlet fra patienter med høj kvalitet serøs EOC (tabel 1). At modellere det native ascites tumor miljø så tæt som muligt

in vitro

analyserede vi bulk-ascites cellepellets, som ud over CD8 + og CD4 + -T-celler, indeholdt residente tumorceller, tregs, B-celler, NK-celler, og CD14 + celler (tabel 2). Endvidere blev celler dyrket i 100% autologt ascitesvæske at medtage eventuelle opløselige faktorer, såsom TGF-β, IL-10, og VEGF (tabel 2), der kan påvirke T-cellefunktion. På grund af mangel på veldefinerede T-celle-antigener i kræft i æggestokkene, vi stimulerede kulturer med α-CD3 antistof, som skal stimulere både effektor og lovgivningsmæssige delmængder. Således blev hver patients T-celler analyseret i nærvær af den fulde komplement af naturligt forekommende tumorceller, immunosuppressive celler og opløselige faktorer.

Vi har for nylig demonstreret i en murin model for EOC, at ascites miljø kan være meget eftergivende til T-celleproliferation [8]. For at se, om dette var også tilfældet i humane EOC prøver, vi testede effekten af ​​ascites væske på T-celleproliferation. Som det ses i fig. 1A, ascitesvæske havde meget varierende virkninger på CD8 + T-celle-proliferation (som målt ved Ki-67-ekspression), der spænder fra stærke hæmning (1/5 patienter) til forøgelse af proliferation (2/5 patienter). Generelt blev lignende tendenser ses for CD4 + T-celler (data ikke vist). Således, som foreslået af vores murine undersøgelser [8], det humane EOC ascites miljø er ikke universelt undertrykkende og i nogle tilfælde kan forøge T-celleproliferation.

Bulk ascites-celler blev stimuleret med plade bundet α-CD3 i medier eller 100% autologe ascitesvæske i 48 timer. (A) Proliferation og funktion af CD8 + T-celler i nærvær af medie eller autolog ascitesvæske (øverste felt) blev vurderet ved at måle ekspression af Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α og IL-2 ved flowcytometri. (B) Virkning af IL-2 (andet panel), IL-12 (tredje panel), og IL-21 (fjerde panel) på CD8 + T-celle-proliferation og forskellige funktioner i nærvær af autolog ascitesvæske. Data er normaliseret til a-CD3 stimulerede celler i medier (dvs. medier værdier blev trækkes fra hver stimulering tilstand). * Der var en signifikant effekt af cytokin for at øge den angivne funktion sammenlignet med celler stimuleret i medier (Wilcoxon matchede par t-test, p 0,05).

Vi afgøres næste, om andre T-cellefunktioner blev tilsvarende påvirket af æggestokkene ascites. Flowcytometrisk analyse blev anvendt til at vurdere fem almindeligt anvendte markører af T-celle-funktion: IFN-γ, TNF-α, IL-2, CCL4, og CD107a [13], [14], [19], [20], [ ,,,0],21]. De første fire markører er cytokiner, der er involveret i T-celle-proliferation eller effektorfunktion, hvorimod CD107a udtrykkes på overfladen af ​​T-celler, som undergår cellulær degranulering og tjener således som en markør for cytotoksicitet [13]. I 4/5 patientprøver, ascitesvæske forårsagede en dramatisk inhibering af CD107a ekspression af CD8 + T-celler (fig. 1A), som blev ledsaget af reducerede niveauer af granzym B i kultursupernatanter (Supp. Fig. S1A), der angiver ascites miljø generelt inhiberer T-celle degranulering. CCL4 og IFN-γ-ekspression blev også inhiberet af ascites i størstedelen af ​​patientprøver (fig. 1a). T-celler der udtrykker IL-2 og TNF-α var relativt sjældne, og blev minimalt påvirket af ascitesvæske i de fleste tilfælde (fig. 1a). Lignende resultater blev set med CD4 + T-celler (data ikke vist). Interessant nok virkningerne af ascites på T-celleproliferation og andre T-cellefunktioner stort set afkobles. For eksempel med patientprøver IROC008 og IROC036, ascitesvæske forøget, både CD8 + og CD4 + T-celle-proliferation, men inhiberede ekspression af CD107a, CCL4, og IFN-γ (fig. 1A, og data ikke vist). Således ascitesvæsken har bredt variable virkninger på T-celle funktioner mellem patientprøver, i overensstemmelse med den heterogene karakter af EOC.

For yderligere at karakterisere effekten af ​​ascites væske på immunforsvaret, dyrkningssupernatanter fra de ovennævnte eksperimenter blev evalueret ved multiplex bead assays for ekspression af et bredt panel af cytokiner forbundet med immunologiske og inflammatoriske processer. Af 27 testede cytokiner, ni (IL-1p, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, og bFGF), blev inhiberet af ascitesvæske sammenlignet med medier i alle 5 patientprøver (Supp. fig. S1B). Ascitesvæske havde varierende virkninger på de resterende cytokiner (data ikke vist). Selvom multiplex perle analyser ikke giver oplysninger om den cellulære kilde (r) af cytokiner, resultaterne alligevel understrege de brede virkninger af ascites væske på cytokin miljø i EOC.

Selv om en systematisk evaluering af de utallige immunosuppressive faktorer i EOC [1], [2] var uden for rammerne af denne undersøgelse, vi gjorde undersøge den mulige indflydelse af tregs, TGF-β, IL-10, og VEGF. Procentdelen af ​​tregs varierede fra 2,5% til 6,8% af totale celler, men viste ingen signifikant korrelation med graden af ​​inhibering af T-celleproliferation, eller CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α og IL-2-ekspression; Ligeledes havde niveauerne af TGF-β, IL-10, og VEGF i ascitesvæske ikke signifikant korrelerer med graden af ​​T-celle-inhibering (tabel 2; Pearson korrelation p 0,05 for alle sammenligninger). Disse resultater understreger den komplekse immunobiologi af ovarietumoren miljø i, at graden af ​​immunsuppression korrelerede ikke med disse fælles immunosuppressive faktorer.

Eksogene cytokiner kun delvis genoprette T-cellefunktion i EOC ascites miljø

i vores musemodel for EOC, IL-2 /IL-15-signalering var kritisk for CD8 + T-celle-proliferation og funktion i ascites [8]. de foregående eksperimenter viste imidlertid, at langt størstedelen af ​​T-celler i EOC ascites ikke udtrykte detekterbare niveauer af IL-2. Dette førte os til at spekulere, at tilsætningen af ​​IL-2 til kulturer kan genoprette T-celleproliferation og funktion. For at teste dette, blev bulk-ascitesceller stimuleret med α-CD3 i nærværelse af 100% ascitesvæske med eller uden exogent IL-2, og T-celleproliferation og funktion blev målt 48 timer senere. I 4/5 patientprøver, IL-2 fuldstændigt vendt virkningerne af ascites på T-celleproliferation og faktisk inducerede responser større end dem, der ses i komplette medier (fig. 1B). Derimod IL-2 havde ringe virkning på ekspressionen af ​​CD107a, CCL4, IFN-γ, eller IL-2 for de fleste patientprøver, selvom det forårsagede en svag men statistisk signifikant forøgelse af TNF-α ekspression (fig. 1B). Således IL-2 alene forbedret T-celle proliferation, men generelt havde ubetydelige virkninger på andre funktioner.

Vi næste spurgte, om ansættelse af andre signalveje bedre kunne øge T-celle funktion. Henviser IL-2 aktiverer primært STAT5 pathway, den tilknyttede cytokin IL-12 aktiverer STAT4 pathway, som har vist sig at forbedre T-cellefunktion i forskellige fysiologiske indstillinger [37]. Ved tilsætning til EOC kulturer, IL-12 alene havde kun mindre virkninger på proliferation eller funktionen af ​​CD8 + T-celler i de fleste patientprøver (fig. 1B). Vi næste evalueret IL-21, som overvejende aktiverer STAT1 og STAT3 veje [38]. Svarende til IL-12, IL-21 havde kun beskedne virkninger på T-celle-proliferation eller funktion (fig. 1B). . Generelt blev lignende tendenser ses med CD4 + T-celler (data ikke vist)

ræsonnement, at en bredere grad af funktionel forbedring kan opnås ved samtidig at aktivere flere STAT pathways vurderede vi to kombinationer af cytokiner: a) IL-2 + IL-12, og b) IL-2 + IL-12 + IL-21. Vigtigt er, ville sidstnævnte kombination teoretisk aktivere alle STAT pathways relevante for CD8 + T-celle-reaktioner (dvs. STAT1, STAT3, STAT4, og Stat5). Generelt begge cytokinkombinationer induceret T-celleproliferation svarende til den, der ses med IL-2 (sammenlign fig. 2 med fig. 1B). Især dog CD8 + T-celler fra IROC028, som undlod at proliferere som respons på en enkelt cytokin (fig. 1B), prolifererede som reaktion på begge cytokinkombinationer (fig. 2). Desuden har begge cytokinkombinationer var beskedent mere effektiv end enlige cytokiner på at øge IFN-γ og TNF-α-produktion (fig. 2). På trods af dette, hverken cytokin kombination forøget ekspression af CD107a eller IL-2 (fig. 2). Lignende resultater blev set med CD4 + -T-celler, selv om virkningerne af cytokiner var generelt svagere (data ikke vist). Sammenfattende tilsætningen af ​​cytokinkombinationer indgreb med en bred vifte af STAT signalveje ikke fuldt ud at genoprette T-celle funktion i EOC ascites miljø.

Bulk ascites-celler blev stimuleret med plade bundet α-CD3 i medier eller 100% autologt ascitesvæske i 48 timer. Proliferation og funktion af CD8 + -T-celler i nærvær af medier, autolog ascitesvæske (øverste panel), eller ascitesvæsken i nærværelse af IL-2 + IL-12 (midterste panel), eller IL-2 + IL-12 + IL -21 (nederste panel) blev vurderet ved at måle ekspression af Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α og IL-2 ved flowcytometri. Data er normaliseret til a-CD3 stimulerede celler i medier (dvs. medier værdier blev trækkes fra hver stimulering tilstand). * Der var en signifikant virkning af cytokinet kombination til forøgelse af angivne funktion sammenlignet med celler stimuleret i medier (Wilcoxon matched pair t-test, p 0,05).

Endelig har vi vurderet, om aktivering af ikke -STAT signalveje yderligere forbedre T-cellefunktion. Til dette formål har vi vurderet cytokinet IL-18, som hører til IL-1 cytokin familie, aktiverer MyD88 /NFKB pathway, og kan direkte forbedre CD8 + T-cellereaktioner i en række forskellige indstillinger [39], [40] , [41]. IL-18 alene havde svage virkninger på T-celleproliferation og funktion (fig. 3A). Men når den kombineres med IL-2 + IL-12, IL-18 signifikant forøget ekspression af IFN-γ og, i mindre grad, TNF-α (Fig. 3A). Desuden er en kombination af IL-2 + IL-12 + IL-18 steg betydeligt mængden af ​​IFN-γ produceret på en per celle-basis, som vist ved forøget gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) (fig. 3B, C). Ikke desto mindre, at kombinationen af ​​IL-2 + IL-12 + IL-18 var ikke i stand til væsentlig grad at øge ekspression af CD107a eller IL-2 (fig. 3A) og kun beskedent forbedret granzym B frigivelse (Supp. Fig. S2A). Ligeledes denne kombination ikke genoprette ekspression af IL-1β, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB eller bFGF i kultursupernatanter (Supp. Fig . S2B). Denne kombination har dog svagt øge niveauet af IL-5 og IL-10 i dyrkningssupernatanter (Supp. Fig. S2C). Kombinationen af ​​IL-2 + IL-12 + IL-18 kun delvist genskaber T-celle funktionalitet i EOC miljø.

Bulk ascites-celler blev stimuleret med plade bundet α-CD3 i medier eller 100% autolog ascitesvæske i 48 timer. Proliferation og funktion af CD8 + T-celler i nærvær af medie eller autolog ascitesvæske (øverste felt) blev vurderet ved at måle ekspression af Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α og IL-2 ved flowcytometri. (A) Effekt af IL-18 (midterste panel) og IL-2 + IL-12 + IL-18 (nederste panel) på CD8 + T-celle-proliferation og forskellige funktioner i nærvær af ascitesvæske. Data er normaliseret til a-CD3 stimulerede celler i medier (dvs. medier værdier blev trækkes fra hver stimulering tilstand). * Der var en signifikant virkning af IL-2 + IL-12 + IL-18 til forøgelse den angivne funktion sammenlignet med celler stimuleret i medier (Wilcoxon matched pair t-test, p 0,05). (B) gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af IFN-y-positive CD8 + T-celler blev bestemt ved intracellulær IFN-γ-farvning. * Virkningen af ​​IL-2 + IL-12 + IL-18 var signifikant større end de andre to cytokinkombinationer (Wilcoxon matched pair t-test, p 0,05). (C) repræsentant flowcytometri plots viser virkningen af ​​cytokinkombinationer på IFN-γ produktion på en per celle-basis. Vist er middelværdien fluorescens intensitet (Y-akse) af IFN-γ produktion og procentdelen af ​​CD8 + -celler, der udtrykker IFN-γ (numre). Alle data er gated på CD8 + lymfocytter.

Eksogene cytokiner fremkalde nye polyfunktionel T-celle profiler

I teorien kunne den øgede aktivitet af cytokin kombinationer i forhold til enkelte cytokiner afspejler enten (a ) forskellige cytokiner stimulerer distinkte subpopulationer af T-celler, eller (b) cytokiner, der virker synergistisk til inducere enkelt T-celler til at udføre flere funktioner (dvs. induktion af polyfunktionelle T-celler). For at undersøge dette problem, brugte vi Boolean gate analyse til at undersøge de forskellige funktionelle permutationer vises af CD8 + og CD4 + T-celler under forskellige stimulation betingelser. Som det ses i toppanelet i fig. 4, når bulk-ascites-celler blev stimuleret i komplette medier, blev kun fem overvejende funktionelle permutationer ses blandt CD8 + -T-celler: (a) ikke-funktionelt (dvs. nul funktion) T-celler (data ikke vist); (B) monofunktionelle T-celler, der udtrykker CCL4 eller CD107a (permutationer 2 og 5), (c) bi-funktionelle T-celler, der udtrykker både CD107a og CCL4 (permutation 13), og (d) tri-funktionelle T-celler, der udtrykker CD107a, CCL4 og IFN-γ (permutation 24). I nærvær af 100% ascitesvæske, antallet af ikke-funktionelle T-celler øges, hvorimod de andre funktionelle permutationer blev reduceret med undtagelse af monofunktionelle T-celler, der udtrykker CCL4 (fig. 4, andet panel). Generelt tilsætning af enkelte cytokiner ikke væsentligt ændrer de funktionelle permutationer set med ascites alene, selv om IL-2 havde svage virkninger på adskillige permutationer (Supp. Fig. S3). I modsætning hertil tilsætningen af ​​cytokinkombinationer (enten IL-2 + IL-12 + IL-21 eller IL-2 + IL-12 + IL-18) markant nedsat antallet af nul- og monofunktionelle T-celler og genererede tre nye polyfunktionelle permutationer: a) CCL4 og IFN-γ (permutation 10); b) CCL4, IFN-γ, og TNF-α (permutation 17); og c) CCL4, IFN-γ, TNF-α, og CD107a (permutation 28) (fig. 4, tredje og fjerde panel). Lignende tendenser blev set for CD4 + -T-celler, selv om virkningerne var generelt svagere (data ikke vist). Således er disse kombinationer af cytokiner synes at virke synergistisk til at inducere polyfunktionelle responser af individuelle T-celler i modsætning til at stimulere flere subpopulationer af monofunktionelle T-celler.

Bulk ascites-celler blev stimuleret med plade bundet α-CD3 i medier eller 100% autologt ascitesvæske i 48 timer i nærvær eller fravær af den angivne cytokin kombination. Boolean gate analyse blev udført for at kvantificere antallet af T-celler, der udtrykker hver af 31 mulige funktionelle permutationer. Vist er resultaterne for CD8 + T-celler stimuleret i medier, ascitesvæsken eller ascitesvæske suppleret med cytokinkombinationer IL-2 + IL-12 + IL-21 eller IL-2 + IL-12 + IL-18. Frekvensen af ​​T-celler, der udtrykker en given permutation udtrykkes som procent af de samlede CD8 + -T-celler. * For det angivne permutation, effekten af ​​cytokinet kombinationen var signifikant større end den, der ses med medier (Wilcoxon matched pair t-test, p 0,05).

Discussion

Vi viser her, at ascites miljø i human EOC har variable virkninger på CD8 + og CD4 + T-celle-proliferation og faktisk kan endda øge proliferation i nogle tilfælde. Derimod ascites generelt inhiberer ekspression af IFN-γ, TNF-α, CCL4, og CD107a af T-celler, hvilket resulterer i en overvægt af nul- eller monofunktionelle T-celler. Desuden ascites miljø generelt inhiberede ekspression af IL-1β, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, og bFGF i kultursupernatanter. Selvom IL-2 kunne genoprette T-celleproliferation, det var stort set ineffektive på at øge andre T-cellefunktioner, som var andre enkelt agent cytokiner (IL-12, IL-18 og IL-21). Kombinationer af cytokiner, som aktiverer komplementære signalveje (især IL-2 + IL-12 + IL-18) var i stand til at forøge ekspression af IFN-γ, TNF-α, og CCL4 men havde ubetydelige virkninger på andre T-cellefunktioner. Således kan exogene cytokiner delvis genoprette T-celle-funktion i den humane EOC miljø; dog vil alternative strategier være forpligtet til fuldt ud at genoprette T-celle funktion.

En begrænsning af denne undersøgelse er den relativt lille stikprøve, som var nødvendig på grund af antallet af cytokiner og funktionelle udlæsninger involveret. På trods af den lille prøvestørrelse, der var en bemærkelsesværdig grad af lighed mellem de overordnede funktionelle profiler af alle fem patientprøver, både ved baseline og efter cytokin stimulation. Dette antyder, at de forskellige immunosuppressive mekanismer til stede i ovariecancer i sidste ende kan konvergere mod et fælles T-celle funktionel tilstand styret af et konserveret sæt af regulatoriske signaler.

Frigivelsen af ​​cytotoksiske granuler er en vigtig mekanisme, ved hvilken T-celler dræbe virus-inficerede og transformerede celler [42]. Vi fandt, at ascitesvæske stærkt hæmmet T-celle degranulering, og dette blev kun delvist gendannet ved exogene cytokiner (som det fremgår af beskeden forøgelse af granzym B release). Tidligere undersøgelser har vist, at kombinationen af ​​IL-2 med TCR-stimulering [9] eller IL-12 [10], [11] fuldt ud kunne gendanne LAK cytotoksicitet i nærvær af 50% ascitesvæske. Denne uoverensstemmelse med vores resultater kan afspejle de mere krævende dyrkningsbetingelser vi ansat, idet T-celler blev analyseret i tilstedeværelsen af ​​100% ascites væske og en komplet supplement af andre tumor-associerede celletyper.

Den manglende IL-2-produktion af både CD8 + og CD4 + T-celler i disse forsøg er også i overensstemmelse med en forringet anti-tumor respons. I vores musemodel for ovariecancer [8], tumor regression var ganske afhængig af IL-2 /IL-15-signalering. Ligeledes Gattinoni og kolleger påviste, at effektor CD8 + T-celler i stand til potent

in vitro

antitumor-cytotoksicitet og IFN-γ produktion, men ikke IL-2-produktion, havde begrænset antitumoraktivitet

in vivo Salg, hvorimod T-celler, der havde lav

in vitro

cytotoksicitet, men høj IL-2 produktion, medierede overlegne anti-tumor respons [12]. Som CD8 + T-celler generelt mister evnen til at producere IL-2 efter differentiering, til svigt af cytokiner forbedre IL-2-produktion tyder på, at de fleste tumor-associerede T-celler kan være terminalt differentierede effektorer [13]. Hvis det er tilfældet, skal rettes fremtidige indsats mod at isolere og udvide mindre differentierede delmængder af T-celler med større pluripotens.

Udover mislykkedes IL-2 produktion, fandt vi, at ascitesvæsken hæmmede udtryk for talrige andre cytokiner ( IL-1β, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, og bFGF) i kultursupernatanter. Selvom den multiplex cytokin assay anvendte vi ikke skelne hvilken celletype (r) inhiberes fra at producere disse cytokiner, mange af disse cytokiner er dokumenteret roller i T-celle-responser og dermed forventes deres reducerede niveauer at påvirke T-cellefunktion. Især er IL-17 produceret af Th17 delmængde af CD4 + -T-celler under inflammatoriske tilstande og er blevet korreleret med forbedret samlet overlevelse i EOC [5]. Da kombinationen af ​​IL-2 + IL-12 + IL-18 ikke har styrke IL-17 produktion, vil alternative strategier være forpligtet til at fremme denne effektor pathway i tumoren miljø. For eksempel IL-1β, IL-6, TGF-β, IL-23, og ICOS er alle blevet vist at påvirke differentieringen, ekspansion eller funktion af Th17 celler [4], [43], og dermed potentielt kunne manipuleres at fremme IL-17 produktion

in vivo

.

i modsætning til disse andre cytokine defekter, kombinationen af ​​IL-2 + IL-12 + IL-18 kraftigt forøget IFN-γ-produktion ved CD8 + T-celler (fig. 3B, C). IFN-γ spiller en central rolle i anti-tumor-immunitet ved at inhibere tumor proliferation og angiogenese, og opregulering tumorantigen præsentation. Endogen IFN-γ beskytter mod tumorudvikling og i en række tumormodeller, er kritisk for anti-tumor immunitet [44]. Desuden IFN-γ og IFN-γ-receptor-ekspression, såvel som adskillige gener nedstrøms for IFN-γ, er forbundet med øget overlevelse i human EOC [1]. Hvordan kan IL-2, IL-12 og IL-18 samvirkende forbedre IFN-γ produktion? Først, disse cytokiner gensidigt opregulere ekspression af deres respektive receptorer, hvilket resulterer i forøget følsomhed af T-celler til alle tre cytokiner [45], [46], [47], [48]. For det andet kan disse cytokiner medierer synergistiske og supplerende signaleringsbegivenheder [37], [49], [50]. For eksempel IL-2 og IL-12 synergistisk aktivere p38 MAPK-vejen kan forbedre IFN-γ-ekspression [51]. Ligeledes, IL-12 og IL-18 aktiverer transkriptionsfaktorer STAT4 og AP-1, henholdsvis som synergistisk kan øge IFN-γ promotoraktivitet [52]. Synes således vigtigt for maksimal ekspression af IFN-γ den koordinerede aktivering af både STAT og ikke-STAT signalveje. Det er dog bemærkelsesværdigt, at disse signaler ikke var tilstrækkelig til at genoprette ekspressionen af ​​mange andre cytokiner. Dette tyder på, at der fremover bør andre end IFN-γ cytokiner anvendes som udlæsninger, hvis man ønsker at optimere hele spektret af T-celle-funktioner til kræft immunterapi.

Kombinationen af ​​IL-2 + IL -12+ IL-18 inducerede også væsentlige ændringer i polyfunktionelle T-celle permutationer.