PLoS ONE: Ataksi Telangiectasia muterede og Rad3 Related (ATR) Protein kinase Hæmning Er Syntetisk Lethal i XRCC1 Mangelfuld kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Introduktion

Ataksi telangiectasia muteret og Rad3 Related (ATR) proteinkinase er en central sensor af enkeltstrenget DNA i forbindelse med strandede replikationsgafler og reparation mellemprodukter genereret under DNA-reparation. XRCC1 er en kritisk enzym i enkeltstrenget brud reparation og base excision reparation. XRCC1-LIG3 kompleks er også en vigtig bidragyder til ligering trin i nukleotid excision reparation respons.

Metoder

I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi syntetisk letalitet i XRCC1 mangelfuld og XRCC1 dygtige kinesisk hamster ovarie (CHO) og humane ovariecancerceller under anvendelse ATR-inhibitorer (NU6027). Derudover har vi også undersøgt muligheden for ATR-inhibitorer til at forstærke cisplatin cytotoksicitet i XRCC1 mangelfuld og XRCC1 dygtige CHO og menneskelige kræftceller. Klonogene assays, alkaliske COMET assays, γH2AX immuncytokemi, FACS for cellecyklus samt FITC-annexin V flowcytometrisk analyse blev udført.

Resultater

ATR hæmning er syntetisk dødbringende i XRCC1 defekte celler som fremgår af øget cytotoksicitet, akkumulering af dobbeltstrenget DNA-brud, G2 /M cellecyklusstop og øget apoptose. Sammenlignet med cisplatin alene, en kombination af cisplatin og ATR inhibitor resulterer i forøget cytotoksicitet i XRCC1 mangelfulde celler i forhold til XRCC1 dygtige celler.

Konklusioner

Vores data giver belæg for, at ATR hæmning er egnet til syntetisk letalitet ansøgning og cisplatin chemopotentiation i XRCC1 mangelfulde ovariecancerceller

Henvisning:. Sultana R, Abdel-Fatah T, Perry C, Moseley P, Albarakti N, Mohan V, et al. (2013) Ataksi Telangiectasia muterede og Rad3 Related (ATR) Protein kinase Hæmning Er Syntetisk Lethal i XRCC1 Mangelfuld æggestokkene Cancer Cells. PLoS ONE 8 (2): e57098. doi: 10,1371 /journal.pone.0057098

Redaktør: Todd W. Miller, Dartmouth, USA

Modtaget: November 8, 2012; Accepteret: 17 Januar 2013; Publiceret: 25 feb 2013

Copyright: © 2013 Sultana et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Målretning DNA-reparation for syntetisk letalitet er en spændende ny. strategi for personlig terapi i kræft i æggestokkene. DNA-reparation er væsentlig for forarbejdning DNA beskadigelse induceret af kemoterapi såsom platinating midler (carboplatin, cisplatin) [1]. Intra-strengede tværbinde DNA-addukter induceret af platinating midler, hvis ikke-udbedret, i sidste ende resultere i celledød [2], [3]. DNA intra-streng tværbindinger repareres overvejende af nukleotid excision reparation (NER) i celler [4], [5]. Platinating midler kan også generere ilt frie radikaler, der inducerer oxidative base-skader, der behandles af DNA-basen excision reparation (BER) pathway i celler [6], [7].

XRCC1 (røntgen reparation cross – komplementerende gen 1) proteinet er en kritisk faktor i BER og enkeltstrenget brud reparationsvej (SSBR). XRCC1-LIG3 kompleks er også en vigtig bidragyder til ligering trin i nukleotid excision reparation (NER) respons. XRCC1, en 70-kDa proteinet, har ingen kendt enzymatisk aktivitet (gennemgået i [8], [9], [10]). XRCC1 fungerer som en molekylær stillads protein og koordinerer DNA-reparation ved at interagere med flere komponenter af BER /SSBR såsom PARP-1 [Poly (ADP-ribose) polymeraser 1], DNA glycosylaser, AP endonuclease (APE1) og andre (anmeldt i [ ,,,0],8], [9], [10]). XRCC1 mangel på celler fører til ophobning af DNA enkelt strengbrud (SSB’er), inducere mutationer og resultere i forhøjede niveauer af udvekslinger søsterkromatid. XRCC1 mangel i cellelinier medføre overfølsomhed over for ioniserende stråling og kemoterapi [9]. I humane associationsstudier, kan kimlinie polymorfier i XRCC1 indflydelse kræftrisiko [11], [12] og indflydelse reaktion på platinbaseret kemoterapi [13], [14], [15], [16]. Ved human ovariecancer har vi for nylig påvist, at tumorer ofte over-express XRCC1 (48%) og signifikant associeret med højere trin (p = 0,006), serøse typen tumorer (p = 0,008), suboptimal de-bulking (p = 0,004 ), en fordobling af risikoen for død (p = 0,007) og progression (p 0,0001) [17]. I den multivariate analyse blev XRCC1 udtryk uafhængigt forbundet med overlevelse i æggestokkene kræftpatienter [HR 2.3, p = 0,002]. XRCC1 negative tumorer var forbundet med platin følsomhed (p 0,0001). Præ-klinisk vi bekræftede også, at XRCC1 negative celler er overfølsomme over for cisplatin i forhold til XRCC1 positive celler [17]. Overfølsomhed over for cisplatin i XRCC1 negative celler var associeret med akkumulering af DNA-strengbrud og G2 /M-cellecyklusstandsnings [17]. Vore data foreslår derfor, at XRCC1 er en lovende biomarkør i ovariecancer.

Ataxia telangiectasia muteret og Rad3 Relateret (ATR) proteinkinase er en central sensor af enkeltstrenget DNA i forbindelse med strandede replikationsgafler samt genereres under BER og dobbelt streng pause reparation som DNA reparation mellemprodukter. Aktiveret ATR igen phosphorylerer en række substrater involveret i celle cyklus regulering, DNA-replikation, DNA-reparation og apoptose (revideret i [18], [19], [20], [21], [22]). I prækliniske studier kan ATR hæmning resultere i cytotoksisk behandling sensibilisering [22], [23], [24]. Småmolekyleinhibitorer af ATR er i øjeblikket under udvikling til terapeutisk anvendelse i kræft [20], [21], [22].

evne PARP-inhibitorer til at fremkalde syntetisk letalitet i BRCA mangelfuld ovariecancer [25], [26], [27] tyder på, at yderligere faktorer inden BER /SSBR kan være egnede til sådanne individualiserede tilgange. XRCC1 er en kritisk faktor i BER, SSBR og NER. ATR er en vigtig sensor ifølge SSB’er. I den aktuelle undersøgelse har vi undersøgt og bekræftet syntetisk letalitet i XRCC1 deficiente celler behandlet med ATR-inhibitorer. Desuden sammenlignet med cisplatin alene, en kombination af cisplatin og ATR inhibitor behandlingsresultater i forøget cytotoksicitet i XRCC1 mangelfulde celler i forhold til XRCC1 dygtige celler.

Materialer og metoder

Forbindelser og reagenser

lille molekyle ATR-hæmmere NU6027 og VE-821 blev indkøbt fra Tocris Bioscience, UK og Tinib-Tools, Tjekkiet hhv. Forbindelserne blev opløst i 100% DMSO og opbevaret ved -20 ° C. Cisplatin (1 mg /ml) blev opnået fra Institut for Farmaci, Nottingham University Hospitals, UK

cellelinjer og kultur

Tidligere godt karakteriserede kinesisk hamster ovarie (CHO) celler.; CHO9 (Vild type), EM-C11 (XRCC1-mutant: C389Y substitution fører til XRCC1protein ustabilitet), EM-C12 (XRCC1-mutant: E98K substitution resulterer i reduceret XRCC1 protein integritet) [28] blev leveret af professor Małgorzata Z. Zdzienicka , Institut for Molekylær Cell Genetics, Nicolaus-Copernicus University i Torun, Bydgoszcz 85-094, Polen. Celler blev dyrket i Hams F-10 media (PAA, UK) [suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (PAA, UK) og 1% penicillin /streptomycin]. EM9-V (XRCC1 mutant) og EM9 celler stabilt transficeret med et menneskeligt XRCC1 ekspressionsvektor (EM9-XH celler) [29] blev leveret af professor Keith Caldicott, Genome Skader og stabilitet Center, University of Sussex, UK. Celler blev dyrket i DMEM-medium (PAA, UK) [suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (PAA, UK) og 1% penicillin /streptomycin]. Ovariecancerceller OVCAR-3 og OVCAR-4 blev dyrket i RPMI-medium (PAA, UK) [suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (PAA, UK) og 1% penicillin /streptomycin].

XRCC1 knockdown Brug af siRNA’er

Tre XRCC1 siRNA-konstruktioner (sekvenser er anført i tabel 1) og en negativ krypteret kontrol og siRNA for glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) (positiv kontrol) blev anvendt i disse studier. SiRNA konstruktioner blev indkøbt fra Ambion life technologies, UK. Den transfektion protokol var som tidligere beskrevet af Fan et.al [30]. Celler blev udpladet i 6-brønds plader (2 ml medium /brønd uden antibiotika). Ved 50% konfluens, blev transfektion opnået ved anvendelse af Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Kort fortalt, siRNA (100 pmol) og Lipofectamin (5 pi) blev hver for sig blandet med 250 pi Opti- MEM1 (GIBCO /Invitrogen) uden FBS. Efter den 5. minutters inkubation ved stuetemperatur blev siRNA og Lipofectamine løsninger kombineret og inkuberet i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur. Denne blanding blev derefter tilsat til udpladede celler, dyrket ved 37 ° C natten over, og mediet blev senere erstattet med frisk medium plus penicillin /streptomycin (1%). Når cellerne opnåede 100% konfluens, blev de trypsiniseret og efterfølgende overført til 75 cm

2 kolber til fortsat vækst og /eller behandling. XRCC1 Knockdown blev bedømt ved western blotting på forskellige tidspunkter efter transfektion (dag 3, 5 og 7).

Western blot-analyse

Proteinprøver blev fremstillet ved lysere celler i RIPA-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Nonidet p-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 1 mMEDTA, 0,1% SDS) indeholdende protease inhibitor (Sigma) og phosphatase inhibitor cocktail 2 og 3 (Sigma) og derefter taget til western blot analyser som tidligere [29] beskrevne. Primært antistof var et muse-anti -XRCC1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og kanin-anti-ATR (Novus Biologicals, USA). HRP konjugat sekundære antistof var et kanin-anti-mus og gede-anti-kanin henholdsvis (Dako, Glostrup, Danmark).

Klonogen Survival Assay

To hundrede celler per brønd blev podet i seks brønde plader. Celler lodes adhærere i 4 timer. NU6027 eller VE-821 blev tilsat i de angivne koncentrationer, og pladerne blev efterladt i inkubatoren i 10 dage for CHO-celler. For siRNA transficeret OVCAR-3 og OVCAR-4-celler, tre dage efter transfektion, NU6027 eller VE-821 blev tilsat ved angivne koncentrationer, og pladerne blev efterladt i inkubatoren i 14 dage. For cisplatin og ATR inhibitor kombinationsstudier blev celler indledningsvis behandlet med cisplatin i 16 timer og derefter forsigtigt vasket to gange med 1X phosphatbufret saltvand og inkuberet i frisk medium med eller uden NU6027 (4 uM for CHO-celler og 6 uM til OVCAR-3 celler ) i 10 dage (CH-celler) eller 14 dage (humane cancerceller). Efter inkubering blev medierne kasseret, fast (med methanol og eddikesyre blanding) farvet med krystalviolet og talt. Overlevende fraktion = [No. af dannede kolonier /(nr. af celler podet x udpladningseffektivitet)]. Alle klonogene assays blev udført tre gange.

Alkaline COMET Assay

Dette assay blev udført som tidligere beskrevet [31]. Kort fortalt blev sub-sammenflydende celler eksponeret for NU6027 (4 uM). Efter 24 timer blev celler ekstraheret og alkaliske comet assays blev udført. Alkali elektroforese buffer bestod af 200 mM NaOH, 1 mM EDTA og pH 13. Pladerne blev derefter farvet med SYBR® grøn (1:10,000 fortynding) (Molecular Probes) i 10 minutter og billeder blev visualiseret under et rhodaminfilteret med et Olympus BX40 mikroskop. Kometerne blev analyseret ved anvendelse Comet Assay III billedanalysesoftware (Perceptive Instruments, Suffolk, UK). I alt 200 komet billeder blev evalueret for oliven hale øjeblik.

γH2AX Immuncytokemi

Cellerne blev behandlet i 48 timer med NU6027 (4 uM for CHO celler og 6 uM for OVCAR-3 celler) og assayet blev udført som tidligere [31] beskrevne. For cisplatin og NU6027 kombinationsstudier, oprindeligt blev cellerne behandlet i 16 timer med cisplatin (1,5 uM for CHO-celler og 1 pM for OVCAR-3 eller OVCAR-4-celler) og derefter forsigtigt vasket to gange med 1X phosphatbufret saltvand og inkuberes i frisk medier med eller uden NU6027 (4 uM for CHO-celler og 6 uM til OVCAR-3 eller OVCAR-4-celler), og assayet blev udført som ovenfor. Hyppigheden af ​​celler indeholdende γH2AX foci blev bestemt i 100 celler pr slide i tre separate forsøg. Kerner, der indeholder mere end seks γH2AX foci blev betragtet som positive.

Flowcytometrisk Analyser (FACS) for cellecyklusprogression

Celler blev behandlet i 24 timer med NU6027 (4 uM for CHO celler og 6 uM for OVCAR-3 eller OVCAR-4-celler). Celler blev senere opsamlet ved trypsinering og centrifugering (1000 rpm i 5 minutter) og FACS-analyser blev udført som beskrevet tidligere [31]. Salg

Apoptose Detektion af FITC-annexin V flowcytometrisk analyse

celler blev behandlet i 48 timer med NU6027 (4 uM for CHO-celler og 6 uM til OVCAR-3 eller OVCAR-4-celler). Celler blev senere opsamlet ved trypsinering og centrifugering (1000 rpm i 5 minutter) og blev vasket to gange med kold PBS og derefter resuspenderet celler i 1X Binding buffer ved en koncentration på 1 × 10

6 celler /ml. Derefter 100 pi af opløsning (1 x 10

5-celler) blev overført til en 5 ml kultur rør og 5 pi FITC Annexin V og 5 pi PI blev tilsat. Cellerne blev derefter forsigtigt vortex og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur (25 ° C) i mørke. Efter inkubationen blev 400 pi bindingsbuffer tilsat til hvert rør og blev analyseret ved flowcytometri inden for 1 time. For cisplatin og NU6027 kombinationsstudier blev cellerne oprindeligt behandlet i 16 timer med cisplatin (1,5 uM for CHO-celler og 1 pM for OVCAR-3 eller OVCAR-4-celler) og derefter forsigtigt vasket to gange med 1X phosphatbufret saltvand og inkuberes i frisk medier med eller uden NU6027 (4 uM for CHO-celler og 6 uM til OVCAR-3 eller OVCAR-4-celler), og assayet blev udført som tidligere beskrevet. Dataene blev analyseret ved hjælp FlowJo7.6.1 software.

Evaluering af Drug Interaction (Kombination Index)

At undersøge synergistisk og additiv aktivitet, kombinationsindeks blev beregnet som tidligere [30] beskrevet. Dosis-respons-kurverne for cisplatin eller NU6027 alene blev først genereret. Virkningen af ​​den kombinerede behandling blev derefter analyseret for kombinationen af ​​lægemiddel A (cisplatin) og B (NU6027), ved anvendelse af følgende ligning: Ac /Ae + Bc /Be = D, hvor Ac og Bc svarer til koncentrationer af lægemidler anvendes i kombinationsbehandling, og Ae og Be svarer til de koncentrationer af lægemidler i stand til i sig selv at producere den samme størrelse af effekt. Hvis D (kombination indeks) er 1 effekten af ​​kombinationen er synergistisk, hvorimod hvis D = 1 eller D er 1 effekten er additiv eller antagonistisk henholdsvis [32]

Resultater

.

syntetisk letalitet

at evaluere syntetisk letalitet pre-klinisk, et panel af XRCC1 mangelfuld og XRCC1 dygtige kinesiske hamster ovarie og menneskelige æggestokkene kræft cellelinjer blev behandlet med småmolekyleinhibitorer af ATR (NU6027 og VE-821 ).

kinesisk hamsterovarie (CHO) celler.

CHO9 (vildtype), blev EM-C11 (XRCC1 deficient) og EM-C12 (XRCC1 deficient) undersøgt i klonogene overlevelse assays. Vi oprindeligt evalueret XRCC1 og ATR udtryk status i CHO9, EM-C11 og EM-C12-celler. Western blot-analyse i figur 1A viser, at EM-C11 og EM-C12 har ingen målbar XRCC1 protein ekspression sammenlignet med CHO9. EM-C11, EM-C12 og CHO9 er godt inde i ATR udtryk. Figur 1B viser, at EM-C11 og EM-C12-celler er følsomme for NU6027 behandling sammenlignet med CHO9 celler. Tilsvarende EM-C11 og EM-C12-celler er også følsomme over for VE-821 i forhold til CHO9 celler (Figur 1C). At undersøge om følsomheden af ​​XRCC1 deficiente celler til ATR inhibitorer kan korrigeres ved ekspression af vildtype XRCC1 protein i XRCC1 deficiente CHO-celler, udførte vi klonogene assays EM9-V (XRCC1 mutant) og EM9-XH (celler stabilt transficeret med en human XRCC1 ekspressionsvektor). Figur 1D viser, at EM9-V-celler er følsomme for NU6027 sammenlignet med EM9-XH.

Klonogene overlevelse assays for CH celler behandlet med NU6027 (B) og VE-821 (C) ved angivne koncentrationer (se metoder til detaljer). D. Klonogene overlevelse analyser for EM9-V og EM9-XH celler behandlet med NU6027. E. Alkaline COMET assay i CH celler behandlet med NU6027. EM-C11 og EM-C12 demonstrerede en højere gennemsnitlig hale øjeblik i forhold til CHO9 celler. F. EM-C11 og EM-C12 celler akkumulerer betydeligt højere γH2AX foci i forhold til CHO9 celler efter NU6027 behandling. Data repræsenterer middelværdier ± SEM (n = 6). Resultater blev analyseret ved anvendelse af Students t-test. * P. 0,05

Vi derefter foretaget funktionel analyse i celler. ATR-inhibering fører til DNA enkeltstrenget brud (SSB) akkumulering. Derfor blev Alkaline COMET assay udføres. Figur 1E opsummerer resultaterne for CHO9, EM-C11 og EM-C12 celler behandlet med 4 uM NU6027. Sammenlignet med prøver forbehandling, efter 24 timers udsættelse for ATR-inhibitor, EM-C11 og EM-C12 celler demonstrerer en signifikant højere betyde hale øjeblik i forhold til CHO9 (p 0,01). Dataene bekræfter SSB akkumulering efter ATR hæmning i XRCC1 manglende celler.

DNA dobbelt streng pauser (DSBs) inducerer fosforylering af H2AX på serin 139 (γH2AX). Ophobning af γH2AX foci i kernen er en markør for DSBs. Derfor blev γH2AX immunocytokemi udført i EM-C11, EM-C12 og CHO9 celler behandlet med 4 μΜ af NU6027. Kerner, der indeholder mere end seks γH2AX foci blev betragtet som positive. γH2AX immunocytokemi bekræftede, at XRCC1 mangelfuld EM-C11 og EM-C12 celler akkumuleret mere γH2AX foci på 48 timer (p = 0,02 og p = 0,05) sammenlignet med CHO9 celler (figur 1D).

Ophobning af DSBs kan forsinke cellecyklusprogression. FACS analyser blev derfor udført i EM-C11, EM-C12 og CHO9 celler behandlet med NU6027 (4 uM). Cellecyklusprogression blev evalueret og sammenlignet med kontrolprøver. Efter 24 timer, EM-C11 og EM-C12 blev vist at være standset i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus (p = 0,01 og p = 0,03) sammenlignet med CHO9 celler (figur 2A og 2B).

B. Kvantificering af forskellige faser af cellecyklus er vist for CH celle behandlet med NU6027. Data repræsenterer middelværdier ± SEM (n = 6). Resultater blev analyseret ved anvendelse af Students t-test. * P 0,05. C. FITC-Annexin V apoptose-assay er vist her. Andelen af ​​celler i tidlig fase apoptose er højere i XRCC1 deficiente celler behandlet med NU6027 sammenlignet med vildtype celler.

Akkumulering af DSBs, hvis ikke-udbedret, inducerer apoptose i celler. Derfor blev FITC-annexin V flowcytometrisk analyse udført for at kvantificere apoptose i celler behandlet med 4 pM af NU6027 og apoptotiske celler kvantificeret efter 48 timer. I EM-C11-celler andelen af ​​cellen i tidlig apoptose steg til 7,5% efter 48 timers behandling med NU6027 sammenlignet med 1,73% i ubehandlede celler. Ligeledes i EM-C12-celler, andelen af ​​tidlige apoptotiske celler steg fra 2,62% til 9,88%. På den anden side i CHO9 celler, var der ingen ændring i procentdelen af ​​tidlige apoptotiske celler (3,22% i ubehandlede og 3,38% efter 48 timers NU6027 behandling (figur 2C).

Dataene præsenteret i kinesisk hamster celler antyder, at XRCC1 deficiente celler er følsomme for ATR-inhibitorer. ATR inhibering fører til øget DSB akkumulering, G2 /M cellecyklus og apoptose. dette tyder på en syntetisk letalitet forhold mellem XRCC1 og ATR. for at bekræfte disse data længere vi undersøgt i human ovarie cancercellelinjer.

humane ovariecancerceller.

Vi genereret XRCC1 knockdown humane ovarie cancer cellelinjer under anvendelse tre siRNA-konstruktioner (Tabel 1). Efter transfektion cellelysater blev udtaget på dag 3, 5 og 7 for XRCC1 vælte ved Western blot analyse. Figur 3A bekræfter, at alle tre konstruktioner (siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3) inducerer effektiv knockdown (over 80%) af XRCC1 i OVCAR-3 celler på dag 3 sammenlignet med krypterede negativ kontrol og GAPDH positiv kontrol. I klonogene overlevelse assays, NU6027 behandling nedsat overlevelse i XRCC1 deficiente celler sammenlignet med dygtige celler (figur 3B). Lignende resultater blev også set i OVCAR-4-celler (figur S1 A). γH2AX immunocytokemi bekræftede, at XRCC1 deficiente celler akkumuleret mere γH2AX foci efter 48 timer (p = 0,05, p = 0,01 og p = 0,007) sammenlignet med scrambled kontrol (figur 3C). Endvidere ved 24 timer blev XRCC1 deficiente celler vist at være standset i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus (p = 0,05, p = 0,04 og p = 0,05) sammenlignet med CHO9 celler (figur 3D). I XRCC1 manglende celler andelen af ​​celler i apoptose steg betydeligt i forhold til scrambled kontroller upon NU6027 behandling (figur 3E).

B. Klonogene overlevelse assays for siRNA transficerede OVCAR-3 celler behandlet med NU6027 ved angivne koncentrationer er vist her (se metoder for detaljer). C. XRCC1 deficiente celler akkumulerer signifikant højere γH2AX foci sammenlignet med scrambled kontrolceller upon NU6027 behandling. Data repræsenterer middelværdier ± SEM (n = 6). Resultater blev analyseret ved anvendelse af Students t-test. * P 0,05, ** p 0,01. D. Kvantificering af forskellige faser af cellecyklus er vist for siRNA transficeret OVCAR-3 celler behandlet med NU6027 Her vises. Data repræsenterer middelværdier ± SEM (n = 3). Resultater blev analyseret ved anvendelse af Students t-test. * P 0,05. E. FITC-Annexin V apoptose assay for siRNA transficerede OVCAR-3-celler er vist her. Andelen af ​​celler i sen fase apoptose er højere i XRCC1 deficiente celler behandlet med NU6027 sammenlignet med scrambled kontrolceller.

Tilsammen data fra CHO-celler og humane cellelinier overbevisende dokumentation for, ATR-inhibitorer inducere syntetisk letalitet i XRCC1 manglende celler.

cisplatin Chemopotentiation

Vi har tidligere vist, at XRCC1 deficiente celler er følsomme over for cisplatin [17]. I den aktuelle undersøgelse, vi først bekræftet denne iagttagelse i XRCC1 mangelfuld EM-C11 og EM-C12 celler i forhold til CHO9 vildtypeceller (figur 4A). Vi derefter evalueret kombination strategier. Cytotoksiciteten af ​​cisplatin blev styrket ved NU6027 i XRCC1 mangelfuld CH celler i forhold til XRCC1 dygtige celler. For at vurdere interaktionen mellem NU6027 og cisplatin, blev kombinationsindeks beregnet som tidligere [32] beskrevne. Celler blev dyrket i nærværelse af stigende doser af cisplatin (interval 0,5-3 uM) i kombination med en koncentration på NU6027 stand til at inducere en 50% vækstinhibering. NU6027 forstærkede den cytotoksiske virkning af cisplatin på XRCC1 deficiente celler (tabel 2). Hvis kombinationsindeks (D) er 1 virkningen af ​​kombinationen synergistisk, hvorimod hvis D = 1 eller D er 1 effekten er additiv eller antagonistisk henholdsvis [32]. I den aktuelle undersøgelse, kombinationsindekset var en i EM-C11 og EM-C12-celler. Vi konkluderede, at forøgelse af cisplatin cytotoksicitet ved NU6027 i CHO-celler var additiv snarere end synergistisk. Vi fortsatte derefter med at gennemføre funktionelle analyser i celler. Cisplatin alene behandling steg DSB akkumulering i XRCC1 deficiente celler, som blev yderligere forøget med NU6027 (p = 0,01 og p = 0,02) (Figur 4B). DSB akkumulering set i XRCC1 deficiente celler var også forbundet med akkumulering af apoptotiske celler som vist i figur 4C.

X-aksen betegner, stigende koncentration af kun cisplatin. NU6027 blev fastsat til 4 uM. B. XRCC1 deficiente CH celler akkumulerer signifikant højere γH2AX foci sammenlignet med XRCC1 dygtige CH celler efter cisplatin behandling alene eller en kombination af cisplatin og NU6027. Data repræsenterer middelværdier ± SEM (n = 6). Resultater blev analyseret ved anvendelse af Students t-test. * P 0,05, ** p 0,01. C. FITC-Annexin V apoptose-assay er vist her. Andelen af ​​celler i tidlig fase samt sen fase apoptose er højere i XRCC1 deficiente celler behandlet med cisplatin alene eller en kombination af cisplatin og NU6027 sammenlignet med vildtype celler.

Vi derefter udført lignende undersøgelser i siRNA transficerede humane OVCAR-3 eller OVCAR-4-celler. Svarende til de resultater, der ses i CH celler, XRCC1 deficiente OVCAR-3 eller OVCAR-4-celler var følsom over for cisplatin. NU6027 forbedret cytotoksicitet af cisplatin i XRCC1 deficiente OVCAR-3-celler sammenlignet med XRCC1 dygtige celler (figur 5A). Lignende resultater blev også set i OVCAR-4-celler (figur S1 B). Kombinationsindeks undersøgelser (tabel 2) viste, at i de fleste celler var en, bortset fra OVCAR-3-celler behandlet med Si RNA_3 (D = 0,93) og OVCAR-4-celler SiRNA_1 (D = 0,99). Samlet set konkluderede vi, at humane ovariecancerceller den forstærkende virkning er sandsynligvis være additive. Cisplatin alene behandling steg DSB akkumulering i celler, som blev yderligere forøget med NU6027 (p = 0,02, p = 0,007 og p = 004) (figur 5B). DSB akkumulering set i XRCC1 deficiente celler var associeret med akkumulering af betydelige apoptotiske celler som vist i figur 5C.

B. XRCC1 deficiente celler akkumulerer signifikant højere γH2AX foci sammenlignet med XRCC1 dygtige celler efter cisplatin behandling alene eller en kombination af cisplatin og NU6027. Data repræsenterer middelværdier ± SEM (n = 6). Resultater blev analyseret ved anvendelse af Students t-test. * P 0,05, ** p 0,01. C. FITC-Annexin V apoptose-assay er vist her. Andelen af ​​celler i sen fase apoptose er højere i XRCC1 deficiente celler behandlet med cisplatin alene eller en kombination af cisplatin og NU6027 sammenlignet med vildtype celler.

Dataene præsenteret her ikke blot tilvejebringer yderligere bevis for, at XRCC1 mangelfuld celler er følsomme over for cisplatin kemoterapi, men også tyder på, at ATR hæmning additivt forbedrer cisplatin toksicitet i XRCC1 mangelfulde celler i forhold til XRCC1 dygtige celler.

konklusioner

ATR protein kinase er et centralt sensor single -stranded DNA forbundet med strandede replikering gafler og reparation mellemprodukter genereres under BER og DSB reparation. ATR-aktivering regulerer flere cellulære processer, herunder cellecyklusregulering, DNA-replikation, DNA-reparation og apoptose. XRCC1 er afgørende for BER og SSBR og bidrager til ligering trin af NER respons. Vi antaget, at ATR-inhibering kan være syntetisk dødelig i XRCC1 manglende celler.

I den aktuelle undersøgelse har vi bekræftet, at ATR inhibitorer er syntetisk dødelig i XRCC1 deficiente celler. Vi har indgået syntetisk letalitet af følgende grunde. Første, CHO-celler samt humane cancerceller deficiente i XRCC1 var meget følsomme over for ATR-inhibitorer. For det andet, funktionelle analyser viste, at ATR inhibering i XRCC1 deficiente celler førte til en ophobning af DNA DSB’er, G2 /M cellecyklusstop og forøget apoptose. Disse data er i overensstemmelse med en undersøgelse af Peasland et al [22], som påviste, at NU6027 er syntetisk letal i celle behandlet med en PARP-inhibitor, der blokerer BER. Desuden forfatterne viste også, at EM9 kinesisk hamster celler, der mangler XRCC1 er også følsomme over NU6027 [22]. De data, herunder vores, giver derfor overbevisende dokumentation for, at ATR hæmning er syntetisk dødbringende i BER manglende celler. Vi præsenterer en arbejdsgruppe model for ATR hæmning som en syntetisk dødelighed strategi i XRCC1 manglende celler. Kort fortalt ATR inhibering fører til SSB akkumulering. Celler, som mangler XRCC1 er ude af stand til at behandle SSB’er som til sidst omdannes til giftige DSBs på replikationsgafler. Overvældende DSBs ikke blot kan mætte DSB-reparation, men ATR inhibering er også kendt at modulere DSB-reparation direkte [33], [34] bidrager til syntetisk letalitet observeret i celler.

Vi fandt også, XRCC1 deficiente celler er følsomme til cisplatin. Den cisplatin følsomhed i XRCC1 defekte celler observeret i vores undersøgelse er i overensstemmelse med en nylig undersøgelse i HepG2 celler, hvor cisplatin følsomhed blev demonstreret efter XRCC1 udtømning [35]. Vi har ikke observere nogen potensering af cisplatin cytotoksicitet ved ATR-hæmmer i XRCC1 vild type celler. Dette er i modsætning til tidligere prækliniske studier, hvor ATR inaktivering (genetisk eller med inhibitorer) har vist øget platin følsomhed i et panel af cellelinier [22]. en begrænsning af vores undersøgelse er, at vores undersøgelse var begrænset til nogle få celletyper kun. Ikke desto mindre vores data antyder, at genetisk baggrund (såsom XRCC1 status) kan påvirke platin følsomhed. Afslutningsvis har vi vist et syntetisk dødelighed ansøgning om ATR-hæmmere i XRCC1 manglende celler. ATR inhibering kan også påvirke platin følsomhed i XRCC1 deficiente celler.