PLoS ONE: 21-Benzyliden Digoxin: En proapoptotiske cardenolide af kræftceller, der opregulerer Na, K-ATPase og Epiteliale Tight Junctions

Abstrakt

cardiotoniske steroider bruges til behandling af hjertesvigt og arytmi og har lovende anticancer effekter. Det prototypiske cardiotonisk steroid ouabain kan også være et hormon, der modulerer epitelcelle adhæsion. Cardiotoniske steroider består af et steroid kerne og en lactonring, og deres biologiske virkninger afhænger bindingen til deres receptor, Na, K-ATPase, hvorigennem de inhiberer Na

+ og K

+ iontransport og aktivere af adskillige intracellulære signalveje. I denne undersøgelse har vi tilføjet en styren gruppe lactonringen af ​​cardiotoniske steroider digoxin, til opnåelse af 21-benzyliden digoxin (21-BD), og undersøgte virkningerne af dette syntetiske cardiotonisk steroid i forskellige celle-modeller. Molekylær modellering viser, at 21-BD binder sig til sit mål Na, K-ATPase med lav affinitet, vedtage en anden farmakofore kropsbygning, når bundet til sin receptor end digoxin. Følgelig 21-DB, ved relativt høje uM mængder hæmmer aktiviteten af ​​Na, K-ATPase a

1, men ikke a

2 og a

3 isoformer. Derudover, 21-BD målretter andre proteiner uden for Na, K-ATPase, inhibering af multilægemiddelresistens eksportør Pdr5p. Ved anvendelse på hele celler ved lave uM koncentrationer, 21-BD producerer flere effekter, herunder: 1) opregulering af Na, K-ATPase-ekspression og aktivitet i HeLa og RKO cancerceller, som ikke findes for digoxin, 2) celle specifikke ændringer i cellelevedygtighed, hvilket reducerer det i HeLa og RKO kræftceller, men stigende det i normale epitelceller MDCK celler, som er forskellig fra den respons på digoxin, og 3) ændringer i celle-celle interaktion, ændre den molekylære sammensætning af tight junctions og opløftende transepithelial elektrisk modstand på MDCK-monolag, en effekt, der tidligere fundet til ouabain. Disse resultater viser, at modifikation af lactonringen af ​​digoxin tilvejebringer nye egenskaber til stoffet, og viser, at den strukturelle ændring, kan anvendes til konstruktion af cardiotoniske steroider med nye egenskaber

Henvisning:. Rocha SC, Pessoa MTC, Neves LDR, Alves SLG, Silva LM, Santos HL, et al. (2014) 21-Benzyliden Digoxin: En proapoptotiske cardenolide af kræftceller, der opregulerer Na, K-ATPase og Epiteliale tætte forbindelser. PLoS ONE 9 (10): e108776. doi: 10,1371 /journal.pone.0108776

Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA

Modtaget: April 7, 2014 Accepteret: August 25, 2014; Udgivet: 7 okt 2014

Copyright: © 2014 Rocha et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af FAPEMIG (Fundação de Amparo en Pesquisa do Estado de Minas Gerais) APQ-01.114-12, APQ-02.596-12 , CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) 472.394 /2012-6 og NIH DK081431. Forfatterne er taknemmelige for den finansielle og strukturelle støtte, der tilbydes af University of São Paulo gennem NAP-CatSinQ (Research Core i katalyse og Chemical Synthesis). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cardiotoniske steroider er almindelige stoffer i planteriget, der giver en konkurrencefordel mod plyndring, enten til den plante, der syntetiserer dem, eller til de dyr, der ophobes dem fra [1] kost. Nogle eksperimentelle beviser viser, at dyr endogent kan syntetisere kardiale steroider og at disse stoffer spiller en vigtig rolle ved reguleringen af ​​blodtryk, celleproliferation og celledød [2], [3]. Den grundlæggende struktur af cardiotoniske steroider består af et steroid rygrad med et cis /trans /cis-konfiguration og en lacton del i position 17β, også kendt som aglycon. Desuden har disse forbindelser ofte have et sukkerindhold fastgjort i position 3β af steroidkernen, for hvilke de er almindeligt kendt som hjerteglykosider. Arten af ​​lactonringen adskiller cardenolider, der har en umættet butyrolacton ring, fra bufadienolides, som udgør en α-pyron ring. Den eneste strukturelle forskel mellem de to vigtigste cardenolider, der anvendes terapeutisk, digoxin og digitoxin, er en enkelt ekstra hydroxylgruppe (-OH) på digoxin, som i væsentlig grad ændrer dets farmakokinetik. Digitoxin, er mere lipofile, viser stærk binding til plasmaproteiner, næsten udelukkende metaboliseres i leveren og udviser en meget lang halveringstid. I modsætning hertil digoxin viser svage binding til plasmaproteiner, ikke metaboliseres i udstrakt grad og udskilles i et primært uændret form gennem nyrerne [2], [3].

Den væsentligste farmakologiske effekt af terapeutiske doser af digoxin og digitoxin er deres positive inotrope virkning. Dette medieres gennem inhibering af myocardial celle Na, K-ATPase, som resulterer i en stigning i de cytosoliske niveauer af Na

+ og sekundært Ca

2+, som følge af reduktion i transporten af ​​Na

+ afhængige Na

+ /Ca

2+ veksler. Den forøgede Ca

2+ i myocardial cellecytosolen fører til yderligere fyldning af reticulum med Ca

2+, som vil være let tilgængelige for frigivelse ved stimulering til at producere forbedret muskelkontraktion [3] – [5 ]

i forbindelse med cellebiologi, der er to områder, hvor kardiale steroider er af potentiel interesse:. kræft og celleadhæsion. Begge disse fænomener er nært beslægtede, som vist ved tabet af celleadhæsion der finder sted i cancer proliferation og metastase. Virkningen af ​​kardiale steroider på celleadhæsion er dårligt forstået, og er fokus for intens forskning [6] – [8]. Siden 1960’erne har flere interessante antitumorvirkninger blevet observeret for digitalis [9], [10], samt for andre cardenolider [11] – [15] og de tilhørende hjerteglykosider, de bufadienolides [16] – [19].

Menneskelig kræft overvejende påvirker epitel [20], hvilke celler er meget polariseret og bundet til hinanden gennem forbindelsesepitoper komplekser, herunder tætte forbindelser (TJs). Denne sidste struktur giver epitel deres evne til at fungere som effektive barrierer i adskillelsen af ​​biologiske rum [21]. Tab af TJs er involveret i kræft progression og metastase [6], [22], for eksempel et fald i ekspressionen af ​​tight junction protein claudin (CLdN) -7, er involveret i formidlingen af ​​brystkræftceller [23] . Endvidere betydningen af ​​Na, K-ATPase for dannelsen af ​​forbindelsesepitoper komplekser er blevet veletableret [24], [25], som er kravet i celle-celle-kontakter for den polariserede ekspression af Na, K-ATPase i lateral plasmamembran epitelceller [26]. Interessant, β

1-underenheden af ​​Na, K-ATPase selv fungerer som et celleadhæsionsmolekyle i astrocytter [27] og epithel [28] – [31]

Et fald i celleoverfladeekspression af. den β

1 underenheden er blevet forbundet med epitel-til-mesenchymal overgang, en proces involveret i tumorindtrængen og metastase [25], [32]. Behandling med flere typer af kardiale steroider forårsager forskellige effekter på cellernes vejkryds. Høje koncentrationer af ouabain (≥300 nM) og andre hjerte-steroider forstyrre stramme, adherens og kommunikerende vejkryds samt desmosomer af epitelceller [24], [33], [34]. Tværtimod lave koncentrationer af ouabain (10 nM) øge forsegling af TJs [35], accelerere cellepolaritet (som bestemt ved udvikling af den primære cilier [36]) og øge celle kommunikation gennem kommunikerende junctions [30].

Selvom undersøgelser af biologiske effekter af tilgængelige hjerte- steroider på tumorceller udvikler sig hurtigt, er dette ikke tilfældet for nyligt syntetiserede cardiotoniske steroider. Nogle syntetiske cardiotoniske steroider er blevet testet for deres anticanceraktivitet [17], [37] – [44]. Oleandrin og 9-hydroxy-2 “oxovoruscharin, en hemi-syntetisk cardenolide, er under kliniske forsøg og har vist anticancer aktivitet både

i

vitro

i

vivo

, i multiresistens kræftceller kulturer [15], [43], [44]. Andre studier viste, at adskillige modifikationer af sukkerdelen af ​​digoxin og digitoxin, kan øge anticancervirkning af disse forbindelser [45] -. [48]

Flere forfattere har beskrevet syntesen af ​​digoxin derivater, hvori tilsætningen af styren grupper til lactonringen delen produceret nogle interessante biologiske aktivitet [49], [50]. Men der er endnu ingen rapporter om anticanceraktivitet eller virkningerne af disse digoxin derivater på Na, K-ATPase-aktivitet.

Formålet med dette arbejde var at undersøge de biologiske virkninger af 21-benzyliden digoxin (21 -BD), et digoxin-derivat med en yderligere styren gruppe i C21 carbon af lactonringen, i cancer og normale celler.

Materialer og metoder Salg

Generel fremgangsmåde til syntese af 21- benzyliden digoxin

benzaldehyd (0,18 ml, 1,8 mmol), digoxin (0,469 g, 0,6 mmol), vandfrit K

2 CO

3 (0,249 g, 1,8 mmol) og 60 ml methanol blev tilsat i en rundbundet kolbe. Efter omrøring i 6 timer ved 70 ° C blev opløsningsmidlet inddampet i en rotationsinddamper. Det rå produkt blev fortyndet med 20 ml vand og ekstraheret med varmt ethylacetat (3 x 30 ml). Det organiske lag blev vasket med saltvand, tørret over vandfrit Na

2SO

4 og koncentreret under vakuum. Det rå produkt blev derefter oprenset via silicasøjlekromatografi (CH

2Cl

2 /MeOH 11:01). Efter oprensning blev det rene produkt fortyndet i tetrahidrofurano (THF), udfældet med hexan og koncentreret under reduceret tryk til opnåelse 21-BD (0,325 g, 0,37 mmol, 62%) som et hvidt fast stof.

Cellekultur Salg

HeLa (human cervix carcinoma, ATCC CCL2) og RKO-AS45-1 (coloncarcinom, ATCC CRL-2579) celler blev dyrket i RPMI eller DMEM /HAM F-10 (01:01) medium (Sigma , St. Louis, MO, USA). CHO-K1 (ATCC CCL61) og MDCK-II-celler (canine renal; ATCC CCL-34) blev dyrket i DMEM. Alle medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone) (cDMEM), 60 mg /ml streptomycin og 100 mg /ml penicillin. Celler blev podet ved en tæthed på 5 x 10

5 celler /cm

2 og inkuberet i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Dyrkningsmediet blev skiftet hver 48 timer for at undgå næringsstof udtynding.

insektcellekultur og virusinfektioner

Sf-9-insektceller blev dyrket i Graces medium med 3,3 g /l lactalbuminhydrolysat, 3,3 g /l yeastolat, og suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 0,25 ug /ml Fungizone. Celler blev dyrket i suspensionskulturer og blev overført til 150 mm vævskulturplader før infektion. Infektioner blev udført som tidligere beskrevet [51]. Efter 72 timer ved 27 ° C blev celler skrabet fra dyrkningspladerne, centrifugeret ved 1.500 x

g

i 10 minutter og suspenderes i 10 mM imidazol-hydrochlorid (pH 7,5) og 1 mM EGTA. Celler blev homogeniseret på is under anvendelse af en Potter-Elvehjem homogenisator, og lysatet blev centrifugeret i 10 minutter ved 1.000 ×

g

. Supernatanten blev fjernet, centrifugeret i yderligere 10 minutter ved 12.000 ×

g

, og den endelige pellet blev suspenderet i 250 mM sucrose, 0,1 mM EGTA og 25 mM imidazol HCI, pH 7,4.

Cytotoksicitetsassay

Forbindelse cytotoksicitet virkning blev vurderet under anvendelse af MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) tetrazoliumsalt kolorimetri (Sigma, St. Louis , MO, USA). Kort fortalt blev cellerne udpladet i 96-brønds plader (1 x 10

5 celler /brønd) og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C til konfluens. Derefter blev brøndene vasket med dyrkningsmedium og digoxin eller 21-BD blev tilsat ved forskellige koncentrationer (0,05-500 uM). Efter inkubation i 24 eller 48 timer blev pladerne behandlet med MTT. Aflæsninger blev udført i en Spectramax M5E mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ved 550 nm. Cytotoksicitet blev scoret som procentdelen af ​​reduktion af absorbans, i forhold til ubehandlede kontrolkulturer [52]. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. Resultaterne blev udtrykt som middelværdien af ​​LC

50 (den lægemiddelkoncentration, der reducerede cellelevedygtigheden til 50%).

Apoptose Assay

Comet assay.

encellede gelelektroforese assay (comet assay) blev udført ifølge tidligere offentliggjorte protokoller [53], [54]. Til dette blev CHO-K1-celler behandlet med 20, 35 eller 50 uM digoxin eller 21-DB, som er fusioner, som ikke påvirker cellelevedygtighed ifølge MTT-assayet. Cellerne blev podet i plader med 24 brønde. Den næste dag blev cellerne vasket to gange med PBS og inkuberet 3 timer med de tilsvarende forbindelser i dyrkningsmedier uden serum. De negative og positive kontrolgrupper blev behandlet med PBS, og methylmethansulfonat (400 pM) hhv. Efter 24 timer blev cellerne vasket to gange med PBS og fritliggende anvendelse af en trypsin-EDTA-opløsning. Trypsin blev inaktiveret med 3,0 ml komplet medium, efterfulgt af centrifugering (5 min, 150 x

g

). Pelleten blev derefter resuspenderet i 500 pi PBS, og 30 pi alikvoter af cellesuspensionerne blev blandet med 70 pi agarose med lavt smeltepunkt (0,5%). Disse blandinger blev anbragt på objektglas forhånd overtrukket med normal smeltepunkt agarose (1,5%) og dækket med dækglas. Dækglassene blev fjernet efter fem minutter, og objektglassene blev nedsænket natten over i lysis opløsning (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 10 mM, pH 10; Triton X-100 1% og DMSO 10%). Derefter blev objektglassene vasket med PBS og opretholdt i 40 min i en horisontal elektroforese kasse fyldt med kold alkalisk puffer (EDTA 1 mM, NaOH 300 mM, pH 13). Elektroforese blev udført ved 0,86 V /cm og 300 mA (20 minutter) og objektglassene blev efterfølgende neutraliseret (0,4 M de Tris, pH 7,5), fikseret med methanol og farvet med ethidiumbromid. Visuelle analyser blev udført under fluorescens [55], [56].

phosphatidylserin translokation.

HeLa-celler blev udsået i 60 mm petriskåle med en diameter på sammenløb og inkuberet natten over i cDMEM. De blev derefter behandlet med 2 pM digoxin eller 50 uM 21-BD i cDMEM til 6, 12 eller 24 timer. Efter inkubation blev suspenderede celler udvundet fra mediet ved centrifugering ved 150 x

g

, 20 ° C i 5 minutter. Vedhæftede celler blev opnået ved en mild protease behandling 1 ml Accutase plus 3 ml PBS), centrifugeret som angivet ovenfor og tilsat til cellerne opnået fra medierne. Annexin-V bundet til den ydre blad af plasmamembranen blev målt med en comercial kit (annexin-V-Fluos Stainig kit, Roche, Tyskland) efter fabrikantens anvisninger. Kort fortalt blev cellesuspensionen inkuberet med en blanding af Annexin-F-FITC og propidiumiodid i saltvand buffer i 15 min. Cellesuspension blev analyseret ved flowcytometri (FACSCalibur flowcytometer, FOW Jo software).

transepithelial elektrisk modstand (TER)

MDCK-celler blev dyrket på Transwell permeable understøtninger (3415, Corning Inc., NY, USA) den transepithelial elektrisk modstand blev målt med en EVOM og EndOhm-6-systemet (verden Precision Instruments, Sarasota, FL, USA). Afsluttende værdier blev opnået ved at trække modstanden i badopløsningen og den tomme insert. Resultaterne udtrykkes i ohm · cm

2 (Ω · cm

2) som en procentdel af kontrol.

Immunofluorescens

Efter TER målinger MDCK monolag blev vasket tre gange med iskold PBS /Ca

2+, fikseret med 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved 4 ° C, permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i 5 min, blokeret i 30 min med 3% BSA og behandlet for 1 time ved 37 ° C med en specifik primært antistof. Monolagene blev derefter skyllet 3 gange med PBS /Ca

2+, inkuberet med passende FITC eller trict-mærkede antistoffer i 30 minutter ved stuetemperatur og skyllet som ovenfor angivet. Filtre med cellerne blev udskåret med en skalpel og monteret i Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Præparaterne blev undersøgt med et Leica konfokal SP5 mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). De optagne billeder blev importeret til FIJI, udgave 2.8 (National Institutes of Health, Baltimore, USA), for at opnå maksimal fremskrivninger og ind i GNU Image Manipulation Program (GIMP) at normalisere lysstyrke og kontrast i billeder og konstruere figurer.

immunblotting

Western blot analyse af hel-celle-proteinekstrakter blev udført som tidligere [57] beskrevne. Kort fortalt blev MDCK og HeLa-celler vasket med PBS og solubiliseret med radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer [10 mM piperazin

N

,

N ‘

bis (2-ethansulfonsyre), pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM ethylendiamin-tetraeddikesyre (EDTA), 1% Triton X-100, 0,5% natrium deoxicholate, og 10% glycerol] indeholdende proteaseinhibitorer (Complete Mini, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Indholdet af cellelysatet protein blev målt (BCA proteinassay reagens, Pierce Chemical, Rockford, IL) og forberedt til SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) ved kogning i prøvepuffer. De opløste proteiner blev electrotransfered til en polyvinylidendifluoridmembran (Hybond-P, GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Storbritannien). Proteinerne af interesse blev derefter detekteret med det specifikke polyklonale eller monoklonale antistoffer, der er angivet i hvert tilfælde, efterfulgt af arts-egnede peroxidasekonjugerede antistoffer (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) og kemiluminescerende detektion (ECL plus; GE Healthcare).

Påvisning af Na, K-ATPase og claudin ekspression via real-time kvantitativ RT-PCR

for real-time kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR), blev totalt RNA ekstraheret fra cellen prøver under anvendelse af TRIzol (Life Technologies, USA). Koncentrationen blev estimeret via spektrofotometri med en NanoDrop ND2000 (Thermo Scientific, USA). Alle revers transkriptase reaktioner blev udført under anvendelse af 5 ug RNA med Superscript III (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger. Alle RNA-prøver blev revers transkriberet samtidigt for at minimere inter-assay variation forbundet med reverse transkriptionsreaktion. Real-time kvantitativ PCR blev udført på en ABI Prism 7500 hurtig rækkefølge detection system (Applied Biosystems) under anvendelse Go Taq qPCR Master Mix (Promega, USA). Følgende primere og koncentrationer blev anvendt (Murphy et al, 2004): Na, K-ATPase α

1 subunit (Genbank NM_000701): Fw (300 nM): 5′-TGTCCAGAATTGCAGGTCTTTG-3, Rv (300 nM ): 5′-TGCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT-3 ‘; Na, K-ATPase-β

1 subunit (Genbank NM_001677): Fw (300 nM): 5′-ACC AAT CTT ACC ATG GAC ACT GAA-3 ‘, Rv (300 nM): 5’-CGG TCT TTC TCA CTG TAC CCA AT-3 ‘; CLdN-2 Fw GGTGGGCATGAGATGCACT, Rv CACCACCGCCAGTCTGTCTT; CLdN-4 Fw TGCACCAACTGCGTGGAGGATGAG, Rv ACCACCAGCGGGTTGTAGAAGTCC. Det påførte PCR-betingelser var som følger: 50 ° C i 2 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min. Hver af disse primersæt gav et unikt PCR-produkt, hvilket bekræftes af de opnåede smeltekurver. PCR assays blev udført tredobbelt, og dataene blev samlet. Relativ kvantitativ måling af målgen niveauer blev udført ved anvendelse af ΔΔCt fremgangsmåden ifølge Livak et al. [58]. Som endogene husholdning kontrol gener, vi anvendte glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH, Genbank NM_002046) og ribosomale 18S subunit gener (Genbank NR_003286) [59]. Følgende primere og koncentrationer blev anvendt: GAPDH Fw (300 nM): 5’- ATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3 ‘, GAPDH Rv (300 nM): 5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′, 18S Fw (300 nM): 5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA- 3 ‘, 18S Rv (300 nM): 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’.

Molekylær modellering analyser

Oprindeligt, digoxin, ouabain og 21-BD (figur 1A) blev dannet og raffineret via den semi-empiriske PM6 metoden [60] gennemført i Gauss 09 W software [61]. Den krystallografiske struktur af Na, K-ATPase (målprotein) kompleksdannet med ouabain blev opnået fra Protein Data Bank (PDB ID: 4HYT [62] med en 3,40 Å opløsning, under anvendelse af α

1 underenhed af Na, K- ATPase). Magnesiumionen og tre interstitielle vandmolekyler blev holdt i bindingsstedet. Dernæst blev en stiv re-dock af ouabain gennemføres med validere vores system. Efterfølgende digoxin og 21-BD blev forankret mod ATPase. De docking analyser blev udført ved hjælp Autodock Vina 1.0.2 [63]. Den anvendte søgealgoritme blev gentaget Local Search Global Optimizer til global optimering. I denne proces blev en række trin med mutation og lokal optimering (den Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno [BFGS] metoden) udføres, og hvert trin fulgte Metropolis kriterium [64]. I denne undersøgelse blev et gitter kasse konstrueret udforske alle aktive steder, der blev defineret som en terning med den geometriske center i ouabain, med dimensioner på 20 × 20 × 24 Å, fordelte punkter på 1 Å og X, Y og Z-koordinaterne for -27,065, 20,469 og -69,469 hhv. Alle molekylære modellering tal blev bygget ved hjælp af DS Visualizer 3.1 [65].

(A) Kemisk struktur af ouabain, digoxin, og 21-BD. (B) Venstre: hele strukturen i Na, K-ATPase (PDB: 4HYT) viste i fast bånd repræsentation, hvor alfa-helix, beta-sheets og drejninger er i rød, blå og grå, henholdsvis; højre: højdepunkt bindingsstedet med ouabain vist i rør repræsentation. Stiplede røde linjer angiver hydrogenbindinger. Kun polære hydrogenatomer blev viste en bedre visualisering. Farmakofore konformation af, (C) digoxin og (D) 21-BD; polære og ikke-polære interaktioner er afbildet af magenta og grønne farver, hhv. Stiplede linjer angiver hydrogenbindinger. Restkoncentrationer interaktioner farvekodet som angivet i den indsatte skala.

Udarbejdelse af Pdr5p plasma membraner

Plasmamembraner der indeholder overudtrykte Pdr5p protein blev fremstillet ud fra den

Saccharomyces cerevisiae

mutantstamme AD124567 som tidligere rapporteret [66].

Fraktionering af cellelysater og fremstilling af membranfraktioner

i alt 2,5 x 10

5-celler blev dyrket i 75 cm

2 kultur flasker og behandlet med digoxin og 21-BD. Efter 48 timers behandling blev cellerne vasket tre gange med kold PBS og skrottet fra kulturen flaske med en gummispartel i et membranpræparat buffer (6 mM Tris [pH 6,8], 20 mM imidazol, 0,25 M saccharose, 0,01% SDS, 3 mM EDTA og 2 mM PMSF). Cellerne blev homogeniseret i en potter-Elvehjem homogenisator under anvendelse ti stokes i is. Derefter blev de sonikeret i en ultrasonisk celle disruptor på is i 10 sekunder ved 45% kraft. Prøven blev underkastet centrifugering ved 20.000 x g i 90 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev kasseret, og pelleten resuspenderes i 250 pi membranpræparat puffer. Endelig blev denne prøve lydbehandlet i 10 s ved 25% effekt indtil fuldstændig homogenisering.

Na, K-ATPase præparat fra rotter hjernehalvdele

hjernehalvdele fra voksne Wistar hanrotter blev hurtigt opsamlet efter diethylether anæstesi og halshugning. De protokoller, der anvendes til brug for rotter blev godkendt af Institutional Kommissionen for Etik i brug af dyr, proces kode DFBCICB011 og var i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, udgivet af US National Institute of Health (NIH publikation nr . 85-23, revideret i 1996). Hjernen væv, der anvendes som en kilde til ouabain-følsom (α

2 /α

3) Na, K-ATPase-isoformer, blev homogeniseret i 250 mM bufret saccharose, 2 mM dithiothreitol, 0,1 mM PMSF og 5 mM Tris /HCl (pH 7,4) med en motordreven Teflon Potter-Elvehjem homogenisator. Efterfølgende blev chaotrope behandling med 2 M KI udført i 1 time under konstant omrøring efterfulgt af centrifugering tre gange ved 100.000 ×

g Salg i 1 time. Den endelige pellet blev resuspenderet i 250 mM sucrose, 0,1% natriumdeoxycholat og 20 mM maleat /Tris (pH 7,4), derefter opbevaret natten over ved -20 ° C og underkastet differentiel centrifugering efter optøning [67]. Pellets blev resuspenderet i den samme buffer uden PMSF og opbevaret i flydende N

2.

Na, K-ATPase-præparat fra mus nyre

nyrevæv blev isoleret fra voksne mus og var homogeniseret i 250 mM sucrose, 0,1 mM EGTA og 25 mM imidazol-HCI, pH 7,4, under anvendelse af en motordreven Teflon Potter

–

Elvehjem homogenisator. Prøven blev derefter udsat for centrifugering ved 4.500 x

g Salg i 10 min. Den resulterende supernatant blev centrifugeret ved 70.000 ×

g

i 1 time. Den endelige pellet blev resuspenderet i den homogenisering opløsning og anvendes til Na, K-ATPase-aktivitet-assays. Alle forsøgsprotokoller involverer mus blev godkendt af University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care og brug Udvalg.

NTPase assays

enzymatiske aktiviteter blev analyseret ved hjælp af ATP som substrat i standard medium (50 pi slutvolumen) indeholdende 100 mM Tris-HCI pH 7,5, 4 mM MgCl

2, 75 mM KNO

3, 7,5 mM NaN

3, og 0,3 mM ammoniummolybdat i nærvær af 3 mM ATP. Reaktionen blev initieret ved tilsætning af 13 ug /ml af plasmamembranen præparater, derefter holdt ved 37 ° C i 60 minutter og standset ved tilsætning af 1% SDS, som tidligere beskrevet [68]. Det frigivne uorganiske phosphat (Pi) blev målt som beskrevet andetsteds [69]. Brug af stamopløsninger i DMSO, 21-BD og digoxin blev tilsat op til en 5% volumen /volumen slutkoncentration. Forskellen i ATPase-aktivitet i nærvær eller fravær af 3 uM oligomycin svarede til en Pdr5p-medieret ATPase-aktivitet.

Måling af virkningen af ​​21-BD på Na, K-ATPase-aktivitet

de hjernehalvdel præparater blev inkuberet ved 37 ° C i 2 timer i medium indeholdende 87,6 mM NaCl, 3 mM KCI, 3 mM MgCb

2, 3 mM ATPNa

2, 1 mM EGTA, 10 mM natriumazid og 20 mM maleinsyre /Tris (pH 7,4), og cellen membranpræparater blev inkuberet ved 37 ° C i 1 time i 120 mM NaCl, 20 mM KCI, 2 mM MgC

2, 3 mM ATPNa

2 og 50 mM HEPES, (pH 7,5), både i fravær og nærvær af 1 mM ouabain eller stigende koncentrationer af 21-BD og digoxin. Na, K-ATPase-aktivitet blev bestemt ved måling af Pi frigøres efter en kolorimetrisk fremgangsmåde beskrevet tidligere [69], og specifikke aktivitet blev betragtet som forskellen mellem totalt og ouabain-resistent ATPase aktivitet [70].

Ouabain bindende Salg

HeLa-celler blev udpladet på 24 multi-brønds plader ved konfluens og dyrket natten over. Monolag blev derefter hurtigt vasket tre gange med kaliumfrit saltvandsbuffer (140 mM NaCl, 1,8 mM CaCI

2, 5 mM sucrose, 10 mM Tris-HCI pH 7,4 ved stuetemperatur) og inkuberet 30 min med total binding opløsning (0,1 × 10

-6

3H-ouabain plus 0,9 × 10

-6 kold ouabain i kalium fri saltvand buffer) under forsigtig omrøring og ved stuetemperatur. Derefter monolag blev vasket fire gange, 1 minut hver, med iskold 0,1 M MgCl

2 og opløst med 400 pi SDS 1%.

3H-aktivitet blev målt i prøver af 350 pi ved scintillationstælling. Total

3H-ouabain binding blev konkurreret ved tilsætning af den nødvendige mængde af 21-BD til den totale binding løsning at nå de angivne koncentrationer i resultaterne. En undergruppe af monolag udsattes for konkurrerede bindende opløsning (total binding opløsning plus 0,5 × 10

-4 M kold ouabain) for at måle uspecifik binding og trække det til den totale binding værdier.

Statistiske analyser

statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism software, blev udgave 5. resultaterne udtrykt som gennemsnit ± fejl standard af middelværdien. Statistisk signifikans i en envejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af en Bonferroni s udvalgte par sammenligning test, blev fastsat til

P

0,05 (*),

P

0,01 (**), eller

P

. 0,001 (***) vs. kontrol tilstand, og “n” er antallet af uafhængige forsøg

Resultater

Vi syntetiserede 21-BD via et enkelt stereo selektiv vinylogt aldolreaktion, ifølge Xu et al. [50], og karakteriseret det endelige produkt gennem traditionelle NMR, HRMS og IR-analyse (figur 1A, Figur S1 og Data S1).

For at udføre den molekylære modellering analyser vi startede med den geometriske optimering af ligander, gennem en semi-empirisk tilgang, til at korrigere geometriske parametre såsom bond længder og forbedre strukturen. Den fornyede dock struktur opnået med softwaren Autodock Vina, viser, at den raffinerede og den krystallografiske ligand deler den samme kropsbygning på det aktive sted, med en kvadratrodsafvigelsen værdi på 2,24 Å for den bedste løsning, hvilket indikerede nøjagtigheden af anvendte metode (se figur S2A). Figur 1B viser en simulering af kupering af ouabain til dets bindingssted i Na, K-ATPase α

1 isoformen. Som vist, at enzymet bevarer de sekundære strukturelle elementer i ATPase familien (Figur 1B, venstre), og at det aktive site er sammensat af Gln111, Glu117, Pro118, Asn122, Leu125, Glu312, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Phe783, Phe786, Leu793, Ile800, Arg880 (figur 1B, til højre) efter aftale med kendte strukturer [71].

Efter disse molekylære modellering analyser vi forankret ouabain, digoxin og 21-BD til Na, K-ATPase ( Figur S2B og figur 1C og D). Simuleringer resulterede i bindende energier for ouabain, digoxin, og 21-BD af -9,8, -1,9, og -10,0 kcal /mol, hhv. Disse data antyder, at 21-BD kan have en lignende bindingsaffinitet til Na, K-ATPase end ouabain og digoxin. Men begge disse sidste forbindelser udviser forskellige farmakofore konformationer i bindingsstedet, hovedsageligt på niveau med lactonringen. Figurerne 1C og D fremhæve de vigtigste intermolekylære vekselvirkninger mellem ligander og målproteinet. Digoxin bindes til enzymet via hydrogenbinding med Thr797, Asp884 og Lys905 aminosyrer. Den elektrostatiske og hydrofobe interaktion forekomme med Glu117, Asn120, Asp121, Asn122, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Arg880, Asp884, Tyr901, Glu908 og Gln111, Leu125, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793, Arg886, Phe909, Arg972 henholdsvis (figur 1C). I modsætning til naturlige hjerteglykosider, 21-BD-komplekser til Na, K-ATPase gennem Gln111, Glu312, og Thr797 hydrogenbinding. Desuden den aromatiske ring når en hydrofob lomme dannet hovedsageligt af Cys104, Val322, Ala323, Glu327, Ile800 (figur 1D). Desuden farmakofore konformation er helt forskellig fra den af ​​de naturlige glycosider, hvis aromatisk del binder til vandmolekyler og magnesiumioner.

For direkte at bestemme binding af 21-BD til ouabain site af Na, K ATPase, vi først testet, hvis det syntetiske steroid kunne konkurrere med

3H-ouabain binding i HeLa-celler, der udtrykker α

1 isoformen af ​​Na, K-ATPase [72]. Som vist i fig.