PLoS ONE: berberine Mål AP-2 /hTERT, NF-KB /COX-2, HIF-1α /VEGF og cytochrom-c /Caspase Signaling at undertrykke humane cancercellelinier Growth

Abstrakt

Berberin (BBR), en isoquinolinderivat alkaloid isoleret fra kinesiske urter, har en lang historie af anvendelser til behandling af flere sygdomme, herunder kræft. Imidlertid er de præcise mekanismer for handlinger BBR i human lunge kræftceller fortsat uklare. I denne undersøgelse undersøgte vi de molekylære mekanismer, hvormed BBR hæmmer cellevækst i humane ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler. Behandling med BBR fremmes cellemorfologi ændring, inhiberede cellemigration, proliferation og kolonidannelse, og induceret celle apoptose. Yderligere molekylære mekanisme undersøgelse viste, at BBR samtidig målrettet multiple cellesignalerende veje til at inhibere NSCLC cellevækst. Behandling med BBR hæmmede AP-2α og AP-2β udtryk og ophævede deres bindende for hTERT initiativtagere, og derved hæmmer hTERT udtryk. Knockdown af AP-2α og AP-2β ved siRNA betydeligt forøgede BBR-medieret inhibering af cellevækst. BBR undertrykte også den nukleare translokation af p50 /p65 NF-KB-proteiner og deres binding til COX-2-promotoren, der forårsager hæmning af COX-2. BBR nedregulerede også HIF-1α og VEGF-ekspression hæmmede Akt og ERK-phosphorylering. Knockdown af HIF-1α af siRNA betydeligt forøgede BBR-medieret inhibering af cellevækst. Desuden BBR behandling udløste cytochrom-c-frigivelse fra mitokondrie inter-membran plads i cytosol, fremmet kløvning af caspase og PARP, og påvirkede ekspression af BAX og Bcl-2, for derved at aktivere apoptotiske vej. Taget sammen viste disse resultater, at BBR inhiberede NSCLC cellevækst ved samtidig målretning AP-2 /hTERT, NF-KB /COX-2, HIF-1α /VEGF, PI3K /AKT, Raf /MEK /ERK og cytochrom-c /caspase signalveje. Vores resultater giver ny indsigt i forståelsen af ​​anticancer mekanismer i BBR i human lungecancer terapi

Henvisning:. Fu L, Chen W, Guo W, Wang J, Tian Y, Shi D, et al. (2013) Berberin Mål AP-2 /hTERT, NF-KB /COX-2, HIF-1α /VEGF og cytochrom-c /Caspase Signaling at undertrykke humane cancercellelinier Growth. PLoS ONE 8 (7): e69240. doi: 10,1371 /journal.pone.0069240

Redaktør: Gutian Xiao, University of Pittsburgh Cancer Institute, USA

Modtaget: April 26, 2013; Accepteret: 6 Juni 2013; Udgivet: 15 Juli 2013

Copyright: © 2013 Fu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Natural Science Foundation of China (81071687, 81272195), staten “863 Program” Kina (SS2012AA020403), den ph.d.-programmer Foundation of Undervisningsministeriets Kina (20110171110077), og staten Key Laboratory of Oncology i det sydlige Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærede tilhørsforhold (er) til “Guangzhou Double Bioproduct Inc” i konkurrerende interesser sektion af online håndskrift. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft indtager førstepladsen blandt kræftrelaterede dødsfald i verden [1]. Forekomsten af ​​ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), en vigtig form for lungekræft, har været stigende med betydelig sygelighed og dødelighed. Behandling, såsom kemoterapi og strålebehandling er de vigtigste terapi strategier for lungekræft [2]. I de senere år terapier selektivt målcelle-signalveje, såsom EGFR, VEGF, KRAS, BRAF, ALK, HER2, MET, TITF-1, p53, LKB1 og mange andre, forudsat ikke kun en bedre forståelse af NSCLC carcinogenese, men også anvendes som prognostiske faktorer eller mål for individualiserende terapi [3]. Men overlevelse forbliver fattige. Fremskridt i lungekræft biologi og genetik førte til udviklingen af ​​små molekyler fytokemikalier, især fytokemikalier udvundet af kinesiske urter, som har virkning på kræft celleproliferation, angiogenese og apoptose [4]. Således kan optimering af anvendelsen af ​​konventionelle og nye terapeutiske fytokemikalier forbedre resultatet af behandling for lungekræft.

kinesiske urter er blevet anvendt i vid udstrækning og med succes i århundreder i behandling af forskellige former for sygdomme [5]. Fytokemikalier fra kinesiske urter har vist lovende for forebyggelse af kræft med sikkerhed og effekt [6]. Berberin (BBR) er en isoquinolinderivat alkaloid isoleret fra rhizomet, rødder og dæmme bark af en række kinesiske urter,

Berberis

arter, såsom

Hydrastis

canadensis

(goldenseal),

Cortex phellodendri

(Huangbai) og

rhizoma Coptidis

(Huanglian) [7]. Berberine har en lang historie for at blive brugt som et terapeutisk middel til behandling af en række sygdomme, herunder cancer. Det er blevet rapporteret, at BBR ved at udvise flere farmakologiske aktiviteter, herunder antiinflammatorisk [8], anti-hypertensive [9], kolesterolsænkende [10], anti-diarré [11,12], antimikrobiel [13,14 ] aktiviteter og anti-tumor effekt af BBR var mere og mere fremhævet i de sidste mange årtier [15,16]. BBR har vist sig at udvise anti-spredning virkninger mod kræftceller af forskellig oprindelse, herunder glioblastom [17], melanom [18], tyktarmskræft [19], brystkræft [20,21], prostatacancer [22] og så videre . I human lungekræft, er det blevet vist, at BBR forbedret cyto-toksicitet af stråling både

in vivo

og

in vitro Salg modeller via induktion af autofagi [23], og BBR udviste en beskyttende virkning på strålingsinduceret lungeskade gennem intercellulære adhæsion molekylær-1 og transformerende vækstfaktor-beta-1 [24]. BBR også effektivt inhiberede motilitet og invasion evne lungecancer-cellelinie A549 på en dosis- og tidsafhængig måde under ikke-cytotoksiske koncentrationer på grund af nedsat produktion af urokinase-plasminogen aktivator og matrixmetalloproteinase-2 [25]. Endvidere blev BBR rapporteret at inhibere vækst og inducere apoptose i humane lungecancerceller, og administrationen af ​​BBR ved oral sondeernæring hæmmede væksten af ​​tumor xenografter i athymiske nøgne mus [26]. Selvom tegn på antitumor virkninger af BBR ekspanderer, usikkerheden af ​​mekanismerne i BBR i NSCLC stadig.

Menneskelig telomerase revers transkriptase (hTERT) har vist sig at være en vigtig del af den menneskelige telomerase, som syntetiserer telomere DNA, forlænger kromosom ender og vedligeholder kromosomal stabilitet endelig fører til cellulær immortalisering [27]. hTERT udtrykkes ikke i de fleste humane somatiske celler, men det er almindeligt overudtrykt i en lang række humane cancere, herunder lungecancer [28]. Den forhøjede ekspression af hTERT er nødvendigt at transformere normale humane celler til kræftceller. Transkriptionel regulering af hTERT-genet er den vigtigste mekanisme for cancer-specifik aktivering af telomerase, og et antal faktorer er blevet identificeret til direkte eller indirekte regulerer hTERT-promotoren [29]. Den aktiverende enhancer-bindende protein-2 (AP-2) har vist sig at transkriptionelt kontrollere ekspressionen af ​​hTERT. AP-2 transkriptionsfaktor familien indeholder et sæt udviklingsmæssigt regulerede, retinsyre inducerbare gener består af fire relaterede faktorer-AP2α, AP2β, AP2γ, og AP2δ [30]. Ved binding til hTERT-promotor, AP-2 faktorer udøver deres biologiske virkninger ved aktivering af en række tumorrelaterede gener og signalveje, herunder hTERT, PI3K /Akt, og Raf /MEK /ERK [31].

Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) er blevet anerkendt som en af ​​de vigtigste initiatorer i udviklingen og progressionen af ​​vaskularisering systemet [32]. Pigment epitel-afledt faktor (PEDF), en potent inhibitor af angiogenese samt en neuro-beskyttende faktor, modvægt virkningen af ​​VEGF [33]. VEGF og PEDF både besidder flere biologiske aktiviteter og funktioner og de har et omvendt forhold til hinanden, især i cancer [34]. Udtrykket af VEGF og PEDF reguleres af en krop af eksterne faktorer, hvoraf hypoxi er bedst karakteriseret mægler. Hypoxi-inducible factor-1α (HIF-1α) er en transkriptionsfaktor som spiller en afgørende rolle i carcinogenese. Aktiviteten af ​​HIF-1α opreguleres ved en række ikke-hypoksiske signaler, herunder aktivering af flere onkogene veje såsom Src, HER-2, Ha-Ras, og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signalering [35]. Ved binding til hypoksi-responsive elementer på VEGF-promotoren, HIF-1 fører til den transkriptionelle aktivering af VEGF-genet [36].

COX-2 er et inducerbart enzym, der omdanner arachidonsyre til prostaglandiner, og det er almindeligt overudtrykkes i en lang række humane cancere [37]. Den forøgede ekspression af COX-2-protein og sekventielle PGE2 produktion har vist signifikant forbedre carcinogenese og inflammatoriske reaktioner ved opregulering EGFR, PI3K, og ERK1 /2 signalering [38]. COX-2-ekspression er transkriptionelt styres af bindingen af ​​flere transaktivatorer og coaktivatorer til de tilsvarende anlægsområder i dets promotor. Blandt de kendte flere regulatoriske elementer distribuerer i kernen promotorregionen af ​​COX-2 transkriptionsstartstedet, NF-KB-bindingssted er afgørende for COX-2-promotoraktivitet [39,40].

PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK er to klassiske celle signalveje og spiller en central rolle i reguleringen af ​​celle genekspression, vækst overlevelse. Unormal PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK-signalering kan medføre øget eller ukontrolleret celleproliferation, modstandsdygtighed over for apoptose og til kemoterapi, strålebehandling, og målretning terapier i tumorer. Aktiveringen af ​​HIF-1-proteinet kan lettes ved PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK-signalering. Som de opstrøms signalmolekyler af HIF-1-protein, kan ERK også spille sin rolle i mediering af virkningen af ​​BBR på inhiberingen af ​​vækst celler [41].

induktion af apoptose betragtes som en af ​​de mulige mekanismer for inhibering af udviklingen af ​​kræft. Caspase aktivering spiller en central rolle i udførelsen af ​​apoptose. De aktiverede caspaser spalte en række målproteiner, hvorved deaktivere vigtige cellulære processer og nedbryde strukturelle komponenter i cellen. Frigivelse af cytochrom-c fra den mitokondriske inter-membran plads i cytosolen er betingelsen for caspase-afhængig apoptose pathway. Cytochrom c binder til Apaf-1 i fravær af dATP, og komplekset binder pro-caspase-9 til dannelse apoptosome, som spalter pro-caspase til caspase 9, og til gengæld aktiverer effektor caspase-3 [42].

i denne undersøgelse undersøgte vi de detaljerede underliggende mekanismer i BBR hæmme NSCLC cellevækst i NSCLC

in vitro

. Vores resultater giver ny indsigt i at udforske de potentielle terapeutiske strategier og nye mål for menneskelig lungekræft.

Resultater

BBR ændrede celle morfologi og hæmmede celle migration

Vi analyserede først effekt af BBR på cellemorfologi i A549 og H1299-celler. Behandling med BBR på 100 uM BBR reduceres effektivt celle-til-celle-kontakt og førte til en lavere spredning med færre dannelse af fi lopodia i sammenligning med DMSO kontrolgrupperne (figur 1A). Vi testede også virkningen af ​​BBR på cellemigrering ved anvendelse af en sårhelende assay. Som vist i figur 1B, blev den del af såret rummet mellem cellelag efter foretager en ridse besat fuldstændigt ved de migrerende celler efter 48 timer i kontrolgruppen. Imidlertid blev det tomme rum af cellerne ikke er optaget af de migrerende celler behandlet med 20 pM BBR. Disse resultater viste mulighederne i BBR ændre celle morfologi og hæmme celle migration i lunge kræftceller

(A) Ændringerne i cellemorfologi og spredning i A549 og H1299 celler behandlet med 100 pM BBR for blev observeret 48 h og celler blev fotograferet under anvendelse af et mikroskop udstyret med digitalkamera. (B) Cellemigrering analyseret ved en sårhelende assay. Cellerne blev dyrket til fuld konfluens. Cellemonolagene såret med en steril pipettespids, og vasket med medium for at fjerne løsnede celler fra pladerne. Celler blev efterladt enten ubehandlet eller behandlet med 20 pM BBR. Efter 48 timer blev sårhullet observeret, og celler blev fotograferet.

BBR undertrykt celleproliferation og kolonidannelse

Berberin er blevet vist at inducere vækstinhibering og apoptose af ikke-lille celle humane lungecancer-celler via p53 signalvej [43]. Vi analyserede næste kvantitativt virkningen af ​​BBR på celleproliferation i lungekræft A549 og H1299-celler ved MTT-assayet. Behandling med BBR i en dosis på 10 uM til 200 uM inhiberede cellelevedygtighed på en dosis-afhængig måde. IC

50 værdier af BBR for A549 og H1299 celler er 67,1 uM og 59,2 uM (figur 2A). Vi har også testet effekten af ​​BBR på tumorcelle clonogenicity i A549-celler (figur 2B). Behandling med BBR markant inhiberede kolonidannelse, hvilket resulterer i et signifikant fald i både kolonidannelse ratio (Figur 2C) og koloni størrelse (figur 2D).

(A-C) Humant A549 og H1299-celler blev behandlet med BBR i de angivne doser. 48 timer efter behandling blev cellelevedygtigheden bestemt ved en MTT assay. IC50-værdierne for BBR for A549 og H1299-celler blev beregnet (A). Tumorcellen A549-induceret kolonidannelse blev ligeledes analyseret (B), og den kolonidannelse rate (C) og koloni størrelse (D) blev beregnet. Celler behandlet med DMSO blev anvendt som referent gruppe med cellelevedygtighed sat til 100%. Den procentvise cellelevedygtighed i hver behandlingsgruppe blev beregnet i forhold til celler behandlet med kontrol DMSO-vehikel. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± SD af tre prøver. *, P 0,05, signifikante forskelle mellem behandlingsgrupper og DMSO kontrolgrupper.

BBR hæmmede AP-2 /hTERT signalering

hTERT har været betragtet som kendetegnende for carcinogenese og udtryk for hTERT er stramt kontrolleret af transkriptionel faktor AP-2. For at bestemme om BBR målretter AP-2 /hTERT signalering behandlede vi A549-celler med BBR (20 uM eller 100 uM) og undersøgt ekspressionen af ​​AP-2α, AP-2β og hTERT proteiner og mRNA’er ved Western blot og RT-PCR , henholdsvis. Behandling med BBR ført til en markant hæmning af ekspressionen af ​​AP-2α, AP-2β og hTERT på protein (figur 3A) og mRNA-niveauer (figur 3B). Salg

(A-C) humane NSCLC A549-celler blev behandlet med BBR i de angivne doser. 48 timer efter behandling blev den AP-2 og hTERT-proteiner (A) og mRNA (B) analyseret ved Western blotting og RT-PCR, hhv. GAPDH blev anvendt som kontrol for prøve lastning. Bindingen af ​​AP-2 til hTERT-promotor-probe (C) blev analyseret ved en streptavidin-agarose-pulldown-assay. (D) A549-celler blev transficeret med en AP-2 siRNA eller en AP-2-udtrykkende vektor til 24 timer, og derefter behandlet med BBR (100 uM). 48 timer efter behandling blev proteinekspression og cellelevedygtigheden bestemt ved Western-blot og MTT-assay, hhv. Den procentvise cellelevedygtighed i hver behandlingsgruppe blev beregnet i forhold til celler behandlet med vehikelkontrollen. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD af tre separate forsøg. *, P 0,05, signifikante forskelle mellem behandlingsgrupper og DMSO kontrolgrupper.

Da hTERT udtryk stramt styres af bindende aktivitet af AP-2 familie på hTERT-promotor, vi næste udført streptavidin-agarose pull-down assay at undersøge effekten af ​​BBR på AP-2a og AP-2p bindende aktiviteter på hTERT promotor. Som vist i figur 3C, BBR behandling effektivt ophævet AP-2α og AP-2β binding til biotin-mærket hTERT-promotor DNA-probe (figur 3C).

For at bekræfte den rolle, AP-2 signalering i BBR- medieret celleproliferation inhibering, transficerede vi A549-celler med AP-2α eller AP-2β siRNA (100 nM) og derefter behandlet dem med BBR (100 uM) i 48 timer. Resultaterne viste, at transfektion med AP-2α eller AP-2β siRNA effektivt nedreguleret ekspressionen af ​​AP-2α eller AP-2β-protein og betydeligt inhiberet cellelevedygtighed (figur 3D). Knockdown af AP-2α eller AP-2β ved siRNA også markant forøget BBR-medieret hæmning af cellelevedygtighed sammenlignet med transfektion med kontrol siRNA (si-NC) (figur 3D). Disse resultater bekræfter, at virkningen af ​​BBR på celleproliferation inhibering medieret mindst til dels gennem AP-2 /hTERT signalvejen i lungecancerceller.

BBR inhiberede NF-KB /COX-2 signalering

høj ekspression af COX-2 er impliceret i cancer cellevækst, migrering og angiogenese. At bestemme virkningerne af BBR på COX-2-signalering i lungecancerceller, vi næste analyseret ekspressionen af ​​COX-2-protein i A549-celler behandlet med BBR ved Western blot. Behandling med BBR i en dosis på 20 uM ikke signifikant inhiberet COX-2-protein-ekspression, mens dosis på 100 uM markant nedsat COX-2-protein-ekspression i A549-celler (figur 4A).

(A) humane A549-celler blev behandlet med BBR i de angivne doser. 48 timer efter behandling blev COX-2-protein analyseret ved Western blotting. GAPDH blev anvendt som kontrol for prøve lastning. (B) A549-celler blev forbehandlet med COX-2-selektiv inhibitor celecoxib (CB, 20 uM) i 24 timer og derefter behandlet med BBR (20 uM). 48 timer efter behandling blev cellelevedygtigheden bestemt ved MTT-analyse. Den procentvise cellelevedygtighed i hver behandlingsgruppe blev beregnet i forhold til celler behandlet med vehikelkontrollen. (C) A549-celler blev behandlet med BBR i de angivne doser. 48 timer efter behandling blev binding af p50 og p65 til COX-2-promotor-probe analyseret ved en streptavidin-agarose-pulldown-assay. (D) A549-celler blev behandlet med BBR (100 nM). 48 timer efter behandlingen, blev virkningen af ​​BBR på NF-KB p65 og p50 translokation analyseret ved immunofluorescens assay. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD af tre separate forsøg. *, P 0,05, signifikante forskelle mellem behandlingsgrupper og DMSO kontrolgrupper.

ekspressionen af ​​COX-2 er stramt reguleret af bindende aktivitet af p50 /p65 NF-KB på COX-2-promotor struktur. Derefter bestemte vi, om BBR-induceret hæmning af tumorcelleproliferation og COX-2-ekspression medieres af inhibering af bindingen af ​​NF-KB til COX-2-promotoren i A549-celler. Streptavidin-agarose pull-down assay viste, at BBR i en dosis på 100 uM markant inhiberede NF-KB P50 og p65 binding til COX-2-promotor-probe i sammenligning med kontrolgruppen (figur 4B). Derimod har BBR i en dosis på 20 og 100 uM ikke påvirke P50 og p65 proteinniveauer i helcellelysater (figur 4A).

translokation af NF-KB p65 og p50 i cellekerner og cytoplasma spiller en central rolle i regulering af COX-2-genekspression. Dernæst udføres immunofluorescensbestemmelse at evaluere effekten af ​​BBR på NF-KB p65 og p50 translokation i A549-celler. Konstitutiv translokation af NF-KB p65 og p50 til cellekernerne blev detekteret (figur 4C). Behandling med BBR (100 uM) fremmes effektivt translokation af NF-KB-p65 og p50 fra cellekerner til cytoplasma. Resultaterne antyder, at inhiberingen af ​​tumorcellevækst ved BBR kan også medieres ved modulering af NF-KB /COX-2-signalvejen i lungecancerceller.

BBR inhiberede HIF-1α /VEGF, PI3K /AKT , Raf /MEK /ERK-signalering

HIF-1α /VEGF /PEDF signalering er tæt forbundet med kræft cellevækst, migration og angiogenese. Derefter bestemte vi effekten af ​​BBR på ekspressionen af ​​HIF-1α, VEGF og PEDF på protein og mRNA-niveauer i lunge cancerceller ved RT-PCR og Western blot hhv. Behandling af A549-celler med BBR inhiberede signifikant ekspressionen af ​​HIF-1α og VEGF, men ikke PEDF, på protein (figur 5A) og mRNA-niveauer (figur 5B).

A549-celler blev behandlet med BBR i de angivne doser. Ved 48 timer efter behandlingen, udtrykket af HIF-1α, VEGF og PEDF på protein (A) eller mRNA-niveauer (B), samt total og phosphoryleret Akt og ERK1 /2 proteiner (D), blev bestemt. A549-celler blev behandlet med HIF-1α-specifikke siRNA (si-HIF) (C) eller Akt-selektiv inhibitor LY294002 (LY, 30 uM) eller ERK-selektiv inhibitor U0126 (U, 50 uM) (E) for 24 timer, henholdsvis og derefter behandlet med BBR. 48 timer efter behandling blev cellelevedygtigheden bestemt ved MTT-analyse. Den procentvise cellelevedygtighed i hver behandlingsgruppe blev beregnet i forhold til celler behandlet med vehikelkontrollen. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD af tre separate forsøg. *, P 0,05, signifikante forskelle mellem behandlingsgrupper og DMSO kontrolgrupper.

For at validere effekten af ​​BBR på HIF-1α /VEGF /PEDF signalering, vi transficeret A549 celler med HIF-1α siRNA (100 nM) og derefter behandlet dem med BBR (100 uM) i 48 timer. Som vist i figur 5C, knockdown af HIF-1α af siRNA udvidet betydeligt BBR-medieret inhibering af celleproliferation i sammenligning med transfektion med den kontrol siRNA. Disse resultater bekræfter, at virkningen af ​​BBR på celleproliferation inhibering også medieres delvist gennem HIF-1α /VEGF /PEDF signalvejen i lungecancerceller.

PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK-signalering spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​tumorcelleproliferation og overlevelse. For at bestemme hvorvidt BBR-medierede cellevækstinhiberingen er også gennem inaktivering af PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK signalvej, analyserede vi virkningen af ​​BBR på phosphorylering af Akt og ERK i A549-celler ved Western blot. Som vist i figur 5D, behandling med BBR faldt betydeligt niveauerne af phosphoryleret Akt og ERK1 /2-proteiner, hvorimod niveauerne af total Akt og ERK1 /2-protein ændrede sig ikke.

BBR aktiveret caspase-afhængig apoptotisk pathway

Vi har også afgøres, om en forbedring af cellevækst hæmning fremkaldt af BBR er forbundet med stigningen i apoptose i lunge kræftceller. Behandling med BBR i doser på 20 uM og 100 uM inducerede 26% og 50% apoptotiske celler i A549 og 28% og 60% apoptotiske celler i H1299 celler (figur 6A). For at bekræfte virkningen af ​​BBR på apoptose, næste detekterede vi ekspressionen af ​​nogle pro-apoptotiske og anti-apoptotiske proteiner, caspase-3/7/9 PARP, BAX og Bcl-2 i A549-celler ved Western blot-analyse. BBR markant øgede ekspressionsniveauerne for spaltet caspase-3/7/9 spaltet PARP og BAX proteiner, men faldt Bcl-2-proteinniveauer sammenlignet med kontrolgruppen (figur 6B).

A549 og H1299-celler blev behandlet med BBR (20 uM eller 100 uM). 48 timer efter behandling blev apoptose bestemt ved en FACS-analyse (A). Niveauerne af den spaltede caspase-3, 7, 9, spaltet PARP blev BAX og Bcl-2-proteiner i A549-celler analyseret ved Western blot (B). Frigivelsen af ​​Cyt-c i A549-celler blev analyseret ved immunofluorescens imaging analyse at overvåge Cyt-c-frigivelse fra den inter-mitokondrie plads i cytosolen (C). Den apoptose er repræsenteret ved relative procentdele af apoptotiske celler versus der i DMSO-behandlede celler. *, P. 0,05, væsentlige forskelle mellem de BBR-behandlede grupper og DMSO-behandlede grupper

cytochrom-c (Cyto-c) udgivelse er en vigtig begivenhed i caspase-afhængige apoptose pathway . Dernæst udføres immunofluorescens imaging (IF) -analyse at overvåge ændringer i den subcellulære lokalisering af Cyto-c i A549-celler for at bestemme, om BBR kunne inducere Cyto-c-frigivelse. Behandling med BBR (20 uM eller 100 uM) markant udløste frigivelse af Cyto-c fra den inter-mitokondrie plads i cytosolen (figur 6C). Disse resultater viser, at BBR kan lette nedstrøms Cyto-c-afhængige apoptosome montering og caspaseaktivering i cytosolen i lungecancerceller.

Diskussion

I denne undersøgelse vurderede vi responset af humane lunge kræftceller A549 og H1299 til BBR, en isoquinolinderivat alkaloid isoleret fra kinesiske urter. Vi fandt, at BBR forbedret cellevækstinhiberingen og apoptose induktion i en dosisafhængig måde, mens disse virkninger ikke blev observeret i normale humane bronchiale epithelceller (data ikke vist). Vores resultater viste, at antitumorvirkningen af ​​BBR medieres gennem modulering af AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF /PEDF, NF-KB /COX-2, PI3K /Akt, Raf /MEK /ERK, caspase /cytochrom C og BAX /Bcl-2-afhængig signalering.

hTERT har været betragtet som vartegn carcinogenese. AP2 /hTERT signalering blev vist at være vigtige i ikke-småcellet lungecancer [44]. Inhiberingen af ​​hTERT-ekspression viste sig at bidrage til at forhindre proliferation og angiogenese og at inducere apoptose af cancerceller [45]. I vores undersøgelse påviste vi, at effekten af ​​BBR på tumorcelleproliferation inhibering medieres delvist gennem AP-2 /hTERT signalering. Behandling med BBR undertrykt ekspressionen af ​​AP-2a og AP-2b og reducerede deres protein overflod i cellekerner og derved mindske bindingen af ​​AP-2a og AP-2b til hTERT-promotoren og nedregulering af ekspressionen af ​​hTERT i BBR- behandlede celler.

forøget forhold af VEGF /PEDF er påkrævet for angiogenese og tumorvækst [46]. HIF-1α /VEGF /PEDF pathway eksisterer som et kritisk trin i lungekræft angiogenese og tumormetastase [47]. Vores undersøgelse viste, at BBR inhiberede HIF-1α udtryk, derved inhiberede VEGF /PEDF-forhold i lungecancerceller. Det er muligt, at BBR inhiberede HIF-1α protein akkumulering i lungecancerceller, og derefter undertrykt ekspressionen af ​​de beslægtede gener, som er involveret i tumorcelleproliferation. Således er vores resultater viser, at HIF-1α signalering bidrager, i det mindste delvis, til BBR-induceret cellevækstinhiberingen.

COX2 spiller en central rolle i tidlige stadier af lunge carcinogenese [48]. Her viste vi, at BBR spillede sin anti-proliferativ rolle delvist gennem hæmme COX-2-ekspression. Vi fandt, at BBR inhiberede COX-2-ekspression ikke kun på protein, men også på mRNA-niveau, hvilket antyder, at BBR kunne udøve antitumorvirkning delvist gennem undertrykkelse af COX-2-signalering. Vi fandt også, at hæmning af COX-2-ekspression ved behandling af BBR delvist medieres af stimulering af NF-KB translokation fra nukleare til cytosolen og ved at hæmme bindingen af ​​NF-KB til COX-2-promotoren.

PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK signalering spiller en central rolle i reguleringen af ​​celle genekspression, vækst overlevelse. Forholdet mellem Raf /MEK /ERK og PI3K /AKT til lungekræft er stadig en intens forskningsområde dag [49,50]. Vores forskning vist den vigtige rolle, PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK signalvejen i BBR-medieret celleproliferation inhibering. BBR kan fungere gennem inaktivering PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK signalvej, inhibering af phosphoryleringen af ​​Akt og ERK-proteinerne, og nedregulering HIF-1α signalering til at inhibere tumorcellevækst.

Apoptose spiller en afgørende rolle i respons kræft til kemoterapi og strålebehandling. I denne undersøgelse har vi påvist, at induktionen af ​​apoptose i humane lungecancer-celler ved BBR blev medieret af cytochrom-c og caspase-afhængig apoptoseveje. Vi fandt, at BBR inducerede aktivering af caspase og PARP-proteiner, og fremmet frigivelse af cytochrom-c fra mitokondrier til cytosolen. Vore resultater antyder derfor antitumorvirkningen af ​​BBR i lungecancerceller er associeret med den øgede aktivering af cytochrom-c og caspase-afhængig apoptotiske vej.

Sammenfattende vi demonstreret, at BBR udviste antiproliferative og pro -apoptotic aktiviteter i NSCLC-celler gennem samtidige modulering af AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF, NF-KB /COX-2, Raf /MEK /ERK, PI3K /AKT og caspase /cytochrom-c signalveje. Disse resultater giver ny indsigt i at udforske de nye potentielle terapeutiske strategier og nye mål for lungekræft behandling.

Materialer og metoder

Cell kultur

Den menneskelige lungecancer cellelinier A549 og H1299 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler blev dyrket som monolag i RPMI 1640 dyrkningsmedier suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 100 ug /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin og holdt i en inkubator med en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 ved 37 ° C.

Reagenser og antistoffer

Berberin (BBR), U0126, LY294002 og celecoxib blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO) og opløst i en lille mængde DMSO før tilsætning til komplet celledyrkningsmedium. Streptavidin-agarose blev købt fra Sigma (St. Louis, MO). Antistoffer mod GAPDH, VEGF, PEDF, HIF-1α, p50, p65, COX-2 blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer mod AP-2α, AP-2β, hTERT, cytochrom-c, PARP, caspase-3/7/9, BAX, Bcl-2, Akt, ERK1 /2, phosphrylated Akt eller ERK1 /2 blev indkøbt fra Cell Signaling ( Beverly, MA).

sårheling assay

sårhelende assay blev udført for at opdage celle migration. Cellerne blev dyrket til fuld konfluens i seks-brønds plader og inkuberet natten over i sult medium. Cellemonolag blev såret med en steril 100 pi pipettetip, vasket med sult medium for at fjerne løsnede celler fra pladerne. Cellerne blev behandlet med angivne doser af BBR i fuld medium og holdt i en CO

2 inkubator. Efter 48 timer blev mediet erstattet med PBS, blev såret konstaterede forskelle og celler blev fotograferet under anvendelse af et Olympus mikroskop udstyret med digitalkamera.

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse MTT-assay (Roche Diagnose, Indianapolis, IN). Kort fortalt blev lungekræft cellelinier podet ved 4 × 103 celler /brønd i 96-brønds plader. Celler blev dyrket natten over, og derefter blev cellerne skiftet til frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af BBR opløst i DMSO (slutkoncentration, 0,1%). Efter at cellerne var inkuberet i 48 timer blev cellevæksten målt. Virkningen på cellelevedygtighed blev vurderet som procent cellelevedygtighed sammenlignet med vehikelbehandlede kontrolceller, som vilkårligt blev tildelt 100% levedygtighed. BBR koncentration, der kræves for at forårsage 50% cellevækstinhibering (IC50), blev bestemt ved interpolation fra dosisresponskurver.

Forankringsuafhængig kolonidannelse assayet Salg

A549-celler udpladet i 6-brønds plader blev behandlet med BBR. Efter 24, blev cellerne vasket med PBS og trypsiniseret. Derefter celler (8 × 10

3 /ml) blev blandet i 1,0 ml 0,3% McCoys 5a agar indeholdende 10% FBS. Kulturerne blev holdt i en 37 ° C, 5% CO

2 inkubator i 14 dage. Mediet blev kasseret, og cellerne blev omhyggeligt vasket med PBS to gange.