PLoS ONE: En syntetisk Podophyllotoxin Afledte Udøver Anti-Cancer effekter ved at inducere mitosestandsning og proapoptotiske ER Stress i Lung Cancer Præklinisk Models

Abstrakt

Nogle potente kemoterapi narkotika, herunder tubulin-bindende midler var blevet udviklet fra natur planter, såsom podophyllotoxin og paclitaxel. Men dårlig cytotoksisk selektivitet, alvorlige bivirkninger, og begrænsede effektivitet er stadig de store bekymringer i deres terapeutiske anvendelse. Vi udviklede en fuldsyntetisk Podophyllotoxin derivat opkaldt Ching001 og undersøgte dens anti-tumor vækst effekter og mekanismer i lungekræft prækliniske modeller. Ching001 viste en selektiv cytotoksicitet til forskellige lungecancer-cellelinjer, men ikke til normale lungeceller. Ching001 inhiberede polymerisation af mikrotubulus resulterer i mitosestandsning som tydeligt ved akkumulering af mitose-relaterede proteiner, survivin og aurora B, hvilket fører til DNA-beskadigelse og apoptose. Ching001 aktiverede også pro-apoptotisk ER stress signalvejen. Intraperitoneal injektion af 2 mg /kg Ching001 inhiberede signifikant tumorvækst på A549 xenograft, mens injektion af 0,2 mg /kg Ching001 faldt lungen kolonisering evne A549-celler i eksperimentel metastase assay. Disse anti-tumor vækst og lunge kolonisering inhiberingsvirkninger var stærkere end paclitaxel behandling ved den samme dosering. De xenograft tumor væv pletter yderligere bekræftet, at Ching001 induceret mitose anholdelse og tumor apoptose. Derudover hæmatologi og biokemiske analyser af blodprøver samt væv undersøgelser indikerede, at Ching001 behandling ikke viste synlige organ- toksicitet i forsøgsdyr. Vi forudsat prækliniske dokumentation for, at nye syntetiske mikrotubuli hæmmer Ching001, hvilket kan udløse DNA skader og apoptose ved at inducere mitosestandsning og ER stress, er en potentiel anti-cancer stof til videre lægemiddeludvikling

Henvisning:. Chen JY, Tang YA, Li WS, Chiou YC, Shieh JM, Wang YC (2013) En syntetisk Podophyllotoxin Afledte Udøver Anti-Cancer effekter ved at inducere mitosestandsning og proapoptotiske ER Stress i lungekræft prækliniske modeller. PLoS ONE 8 (4): e62082. doi: 10,1371 /journal.pone.0062082

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: December 31, 2012; Accepteret: 17 Marts 2013; Udgivet: 30 april, 2013 |

Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud CMNCKU10107 fra Chi Mei Medical center, Taiwan (JMS) og NSC 101-2325-B-006-008 fra National Science Rådet, Taiwan (YCW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nogle potente kemoterapi narkotika var blevet afledt af naturens planter. For eksempel, podophyllotoxin, en aktiv komponent oprenset fra

Podophyllum peltatum

[1] – [3], anvendes som en standard behandling for kønsvorter [4]. Podophyllotoxin inhiberer mikrotubulus polymerisation fører til mitose svigt og cellecyklusstandsning [5] – [7]. Semisyntetiske derivater af podophyllotoxin, f.eks etoposid og teniposid, anvendes for tiden anticancerlægemidler for leukæmi, lymfom, glioblastom, lunge- og testikelcancere [8]. Mange andre anticancerlægemidler afledt fra naturlige urter også besidder evnen til at inhibere mikrotubulusdynamik [2], [9]. For eksempel, taxol (eller paclitaxel) og vinca alkaloid forbindelser er naturlige produkter oprenset fra

Taxus brevifolia

eller

Catharanthus roseus

hhv. Tidligere undersøgelser afslørede, at paclitaxel og vinca alkaloid forbindelser kan afbryde mikrotubulusdynamik [9] – [13]

Selvom mange tubulin bindemidler var blevet udviklet, stærk cytotoksicitet dybt normale celler, depression af knoglemarv og øge risikoen for. sekundær akut myeloid leukæmi begrænse deres kliniske effektivitet [1], [14] – [16]. Således udvikling af nye midler med bedre cytotoksisk selektivitet og begrænsede bivirkninger er vigtig for anti-cancerbehandling. Vi udviklede en hidtil ukendt fuldsyntetisk podophyllotoxin derivat med høj renhed og godt udbytte opkaldt Ching001, og fandt, at Ching001 udviste kraftig cytotoksicitet specifikt i lungekræft cellelinier, men ikke i normale lungeceller. Ching001 hæmmede mikrotubuli polymerisering og anholdt cellecyklus ved mitose. Ching001 induceret apoptose gennem induktion af DNA-beskadigelse og aktivering af ER stress signalering. Ching001 viste tumorvækst hæmning og forhindre tumor kolonisering uden synlige bivirkninger i xenograftmodeller, hvilket tyder på, at det kunne blive yderligere testet som en roman anti-tumor reagens.

Resultater

Ching001 Viser Selektiv cytotoksicitet Mod Kræft men ikke Normale lungeceller

Ching001 er en fuldt syntetisk forbindelse, og dens struktur er vist i fig. 1A. Cytotoksiciteten af ​​Ching001 i forskellige lungecancer-cellelinjer og MRC5 normal lunge cellelinje blev analyseret. IC50 beregnes ved regressionsanalyse af forskellige cellelinjer var: CL1-0, 1,99 uM; CL1-5, 1,90 uM; A549, 1,21 uM; H1299, 2,58 uM; og MRC5, 8,27 pM til Ching001 behandling ved 48 timer (fig. 1B). Ching001 viste en selektiv cytotoksicitet til lungecancerceller men ikke til normale humane MRC5 lungeceller.

(A) Strukturen af ​​Ching001 forbindelse. (B) Cytotoksicitetsassay af normal lunge MRC5 og forskellige lungecancerceller blev overvåget ved trypanblåt-farvning. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af Ching001 i 48 timer. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem de normale MRC5 celler og cancerceller. ***

P

0,001. (C) Flowcytometrianalyse af cellecyklusfordeling af lungekræft cellelinier behandlet med varierende doser af Ching001 og for forskellige varigheder. (D) Immunofluorescens for α-tubulin (grøn) og DAPI nuklear farvning (blå) efter 1 uM Ching001 behandling i 2 til 8 timer i S-fase synkroniseret lung cancercellelinjer. DMSO blev anvendt som kontrol opløsningsmiddel. Scale barer: 10 um

Ching001 Forhindrer mikrotubulus polymerisation og Forsinkelser M-fase Progression

Da podophyllotoxin er kendt for at målrette mikrotubuli, kan dens strukturelle analog Ching001 også målrette mikrotubuli.. Mikrotubulisamlingsassay viste, at 1 pM Ching001 behandling faldt den uopløselige polymeriseret form af mikrotubulus inden 6 timer (fig. S1A). Den immunfluorescens af α-tubulin viste signifikant forstyrrelse af mikrotubuli organisation sammenlignet med opløsningsmiddel kontrol DMSO i både A549 og CL1-5 lungekræft celler (Fig. S1B). Disse resultater tyder på, at mikrotubuli er den potentielle mål for Ching001.

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​Ching001 på cellecyklusprogression. Flowcytometri analyser indikerede, at G2 /M-fase population af de behandlede lungecancerceller, herunder H1299, A549, CL1-0, og CL1-5, forøget dosisafhængigt med 0,5 til 1 pM Ching001 behandling i 6 timer. G2 /M cellecyklus population yderligere steget dramatisk, ledsaget af fremkomsten af ​​sub-G1 fraktion ved forlænget Ching001 behandling i 12 timer (fig. 1c). Flowcytometrianalyse og proliferation assay af S-fase synkroniseret lungecancerceller også bekræftet, at Ching001 behandling standset cellecyklusprogression ved G2 /M-fase derfor inhiberede proliferation (Fig. S2).

For yderligere at dissekere virkningen af Ching001 under G2 /M arrest, immunfluorescens for mikrotubulus blev udført i S-fase synkroniseret lungecancerceller behandlet med Ching001 (fig. 1D). DMSO-behandlede celler begyndte at indtaste pro-metafase efter 2 timer og skred frem til anafase ved 4 timer efter frigivelse fra S-fase. Cellerne fortsatte med at telofase ved 6 timer og nåede sent cytokinese at fuldføre mitose ved 8 timer. Imidlertid Ching001-behandlede celler trådte M-fase ved 2 timer og forblev i metafase selv ved 8 h (fig. 1d).

For at tilvejebringe molekylære tegn på M-fase-standsning, udførte vi western blot-analyser af nøgle proteiner regulerer cellemitose herunder aurora B, survivin og phosphorylerede mitotisk protein monoklonale 2 epitoper (p-MPM2) [17] – [19]. Resultaterne viste, at aurora B, survivin og p-MPM2 forblev høj efter Ching001 behandling sammenlignet med DMSO-kontrol, hvilket indikerer M-fasen (fig. 2A). Desuden viste immuncytokemi farvning, at omkring 15% af DMSO behandlede celler var i M-fase ved deres ekspression af både aurora B og survivin, mens Ching001 behandling signifikant forøget M-fase-cellepopulation, der co-udtrykkes aurora B og survivin (fig. 2B). Tilsammen viste disse resultater, at Ching001 anholdelser cellecyklusfremadskriden ved M-fase.

(A) Western blot-analyser af mitose-relaterede proteiner efter 1. pM Ching001 behandling for angivne tidspunkter i lungekræft cellelinier. (B) dysregulering af M-fase-cellecyklus induceret af Ching001. Lung cancer cellelinjer blev analyseret med survivin (grøn), aurora B (rød), og DAPI (blå) efter 1 uM Ching001 behandling i 24 timer. DMSO blev anvendt som kontrol opløsningsmiddel. Scale barer: 30 pm

Ching001-induceret mitosestandsning Fører til DNA-skader og apoptose for lungekræft Cells

Det var blevet rapporteret, at fejl i mitose generere skader og fragmentering af det. DNA [20]. Vores Western blot-analyser viste en forøgelse af DNA-skader markør γ-H2AX i cancerceller efter Ching001 behandling (fig. 3A), hvilket blev bekræftet ved immunofluorescens for γ-H2AX (fig. S3). For yderligere at undersøge, om DNA-skader fremkaldt af Ching001 behandling i sidste ende resulterer i apoptose, blev PS translokation detekteret ved immunfluorescens efter Ching001 behandling (fig. 3B). Desuden blev apoptose-induceret DNA-stige-assay udført (fig. 3C). En stærk PS translokation på 24 timer og induktion af apoptotiske DNA stiger ved 48 h i Ching001-behandlede H1299, A549, CL1-0 og CL1-5 celler tyder på, at DNA-skader fremkaldt af mitose fejl under Ching001 behandling i sidste ende resulterer i apoptose.

(A) Western blot analyser for DNA skader markør γ-H2AX efter en uM Ching001 behandling ved angivne tidspunkter. (B) Immunofluorescens for tidlig apoptotisk markør PS translokation efter Ching001 behandling i 24 timer. Scale bars: 30 uM. (C) Den apoptotiske-specifikke DNA-fragmentering blev påvist ved DNA-stige analyser efter Ching001 behandling i 48 timer.

Ching001 inducerer Pro-apoptotisk ER Stress signalvejen

Især aktiviteten af eR stress induceret caspase-4 blev forøget i en tidsafhængig måde i H1299 og A549 lung cancer cellelinier efter Ching001 behandling (fig. 4A). For at undersøge mekanismerne i Ching001 behandling på pro-apoptotisk ER stress induktion, western blot for apoptose-regulerende proteiner, herunder ER stress signaleringsveje blev udført. Aktivering af ER stress var tydeligt ved den øgede ekspression af p-PREK, p-eIF2α, p-JNK, GADD153 og caspase-4 efter Ching001 behandling (fig. 4B). Desuden Ching001 behandling faldt ekspressionen af ​​anti-apoptotisk faktor Bcl-2 og forøgede ekspressionen af ​​pro-apoptotisk faktor Bax, der fører til apoptose via spaltning af apoptose bøddel caspase-3 (fig. 4A). Disse resultater viste, at Ching001 induceret apoptose, i det mindste delvist, via ER stress-signalvejen.

(A) caspase-4-aktivitet forøget tidsafhængigt efter 1 pM Ching001 behandling i både A549 og H1299 lungecancer celle linjer på angivne tidspunkter. **:

P

0,01, ***:

P

0,001. (B) Western blot-analyser af ER stressrelaterede signalering proteiner (blots over prik linie) og apoptose signalering proteiner (blots under prik linie) efter Ching001 behandling på de angivne tidspunkter.

Ching001 Exhibits

i

vivo

xenotransplantat Growth inhibition af mitosen og apoptose uden Induktion af apoptose i omgivende væv af xenotransplantat

tumor xenograft-assay blev udført for at teste tumorvækstinhibering evne Ching001

i

vivo

. Intraperitoneal injektion af 0,4 mg /kg Ching001 i fem gange under den indledende behandlingsforløb viste tumorvækstinhibering virkning, som svarede til 4 mg /kg behandling med paclitaxel, en kendt mikrotubulus-inhibitor (fig. 5A, venstre panel). Tumoren vækstrate blev yderligere hæmmet ved behandling med 2 mg /kg Ching001. Ingen signifikant organ vægttab hos behandlede dyr sammenlignet med kontrolgruppen blev fundet (Fig. 5A, højre panel).

(A) ICR-nøgne mus der bærer de etablerede A549 tumorer (-50 mm

3) blev behandlet med Ching001 (0,4 mg /kg eller 2 mg /kg) via intraperitoneal injektion på day1, Day3, day5, Dag 7, og Day9 (som angivet ved pilespidser). En kendt mikrotubulus-inhibitor, paclitaxel (4 mg /kg), blev anvendt til sammenligning. Tumoren volumener (til venstre) og kropsvægt (til højre) blev målt på hver anden dag indtil day35. Points, betyder; barer, ± SEM. *:

P

0,05, **:

P

0,01, ***:

P

0,001. (B) Den aktiverede caspase-3 IHC-farvning af tumorvævet af ICR-nøgne mus taget fra opløsningsmiddel kontrolgruppe og Ching001 behandling (2 mg /kg) -gruppe. Original forstørrelse × 200. (C) Vævet immunofluorescens af survivin (grøn), aurora B (rød), og DAPI (blå) tumor xenograft fra opløsningsmiddel kontrolmus og Ching001 behandlede mus (2 mg /kg). Pilene angav de mitotiske celler i opløsningsmiddel kontrol tumor. Det udvidede tal repræsenterer afvigende kromosomer efter Ching001 behandling. Scale barer:. 30 um

For at undersøge om Ching001 induceret tumor apoptose

i

vivo

, immunhistokemi (IHC) farvning af aktiveret caspase-3 blev udført. Vi fandt en forøget ekspression af aktiveret caspase-3 i tumor-xenotransplantater fra Ching001 behandlede gruppe sammenlignet med opløsningsmiddel behandlede gruppe (fig. 5B). Derudover Ching001 behandlede tumorceller syntes at have skrumpede i nucleus og boblet i udseende, der repræsenterer apoptotisk celledød i xenograft knude (fig. S4A), mens der blev observeret hverken histologisk eller apoptotisk fænotype i omkringliggende raske væv af xenograft (fig. S4b ). For at undersøge om Ching001 induceret mitose anholdelse

i

vivo

, væv immunfluorescens af survivin og aurora B blev udført. Resultaterne viste en stigning på celle befolkning, der co-udtrykte survivin og aurora B i Ching001 behandlet tumorvæv sammenlignet med opløsningsmiddel behandlede væv (fig. 5C). Vigtigere blev observeret, afvigende kromosom konfiguration i Ching001 behandlede xenograft (forstørret indsat i fig. 5C). Disse

i

vivo

resultater bekræfter med

i

vitro

data, Ching001 inducerer mitose anholdelse, kromosom skader, og apoptose.

Ching001 Forhindrer Cancer etableringsevne

i

vivo

uden at påvirke Normal Vital Funktion

for at verificere

i

vivo

kolonisering hæmning potentiale Ching001 blev eksperimentelle metastaser dyreforsøg udført. A549 lungecancerceller blev intravenøst ​​injiceret i halen-vene i mus. Musene modtog 0,2 mg /kg Ching001, en tiendedel af den anvendte dosering for anti-tumor vækst dyreforsøg, intraperitonealt hver anden dag fra dag 1 til dag 35. DMSO tjente kontrol som opløsningsmiddel og 0,2 mg /kg paclitaxel var inkluderet som en positiv kontrol. Desuden blev A549-celler forbehandlet med 1 uM Ching001 før hale-vene injektion også udført. Haematoxylin og eosin (H 0,05. (B) De hæmatologi og biokemiske analyser af blod fra testede mus. I hæmatologiske tests blev WBC, RBC og blodplader testet. I biokemiske analyser, GOT, GPT, albumin og total-bilirubin anvendes som indikatorer for leverfunktionen; BUN og kreatinin som indikatorer for nyrefunktionen. Data indikerer, at Ching001 behandling forårsagede ingen tilsyneladende ændring på lever- og nyrefunktion sammenlignet med DMSO-behandlede dyr.

Diskussion

At udvikle anti-cancer medicin med bedre effekt og begrænset side -effects, vi designet en fuldt syntetisk forbindelse Ching001 og undersøgt dens anti-tumor aktiviteter

i

vitro

i

vivo

i lungekræft model . Ching001 viste specifikke cytotoksicitet mod forskellige menneskelige lungekræft cellelinier ved doser i sub-mikromolære område med ingen tilsyneladende cytotoksicitet over normal human lunge cellelinje. Dyreforsøg har vist, at Ching001 hæmmede tumorvækst og kolonisering

i

vivo

uden væsentlige bivirkninger i testede mus. Den molekylære rolle Ching001 på tumorvækst inhibering medieres, i det mindste delvis af mikrotubulus de-polymerisation fører til mitose arrest og DNA-beskadigelse. Disse begivenheder sammen med ER stress induktion, i sidste ende førte til apoptose af lunge kræftceller

i

vitro

i

vivo

(fig. 7 ).

Hurtig cellecyklusprogression er en af ​​funktionerne i florerede kræftcelle. Inhibering af mikrotubulus-polymerisation af Ching001 arresterer M-fase cellecyklusprogression og fører til DNA-beskadigelse. Desuden Ching001 behandling udløste aktivering af ER stress signalvejen gennem aktivering af PERK og caspase-4-signalering kaskade. Langvarig M-fase-standsning og aktiveret ER stress signalering efterfølgende inducere apoptose i cancercellen behandlet med Ching001.

Vores western blot-analyser detekteret en vedvarende ekspression af p-MPM2 repræsenterer indgangen til M-fase-cellecyklus [18], [19], hvilket indikerer, at Ching001 behandlede celler forladt G2 og forud til M-fasen. Desuden aurora B og survivin styre arrangementet og adskillelse af kromosom under mitose. Nedbrydning af aurora B og survivin ved M-fase letter slutningen af ​​mitose [17]. Vi observerede en øget co-ekspression af aurora B og survivin i både celle- og animalske prøver, hvilket tyder på, at Ching001 hæmmer exit fra M-fasen. Vores α-tubulin immunfluorescens af S-fase synkroniserede celler demonstrerede en cellecyklusstandsning ved metafase. Alle sammen, vores resultater understøtter den hypotese, at Ching001 anholdelser cellecyklus ved M-fase, som kan skyldes inhibering af mikrotubulus-polymerisation og afbrydelse af spindel mikrotubulus organisation. Forlænge M-fase-standsning i celler resulterer i svigt af kromosom adskillelse og efterfølgende død fra mitose [21]. Vores nuværende cellulære og dyr resulterer godtgøre, at Ching001 behandling inducerer M-fasen efterfulgt af DNA-beskadigelse og apoptotisk celledød.

Svigt af nuklear migration og division kunne forstyrre homøostase af ER [22]. ER transmembrane sensorer kendt som PERK og IRE1α vil derefter aktiveres ved phosphorylering, som efterfølgende aktiverer caspase-4 [23]. Ching001 behandling forøget ekspression af ER stress markører og apoptose markører på 6-12 t. Disse resultater antydede, at Ching001-induceret cancercelle apoptose kan være forårsaget samtidigt via induktion af mitose defekter og ER stress aktivering ved tidlige tidspunkter. Derudover blev ingen tilsyneladende aktivering af iboende apoptose signalering protein caspase-9 og ydre apoptose signalering protein caspase-8 observeret efter Ching001 behandling (data ikke vist), hvilket antyder, at Ching001 induceret kræftcelle apoptose er via ER stress. Dæmpning af ER-medieret apoptose induceret af Ching001 i ER sensorer slået ned celler er værdig til yderligere undersøgelse

Podophyllotoxin er det naturlige produkt analog af Ching001 [5] -. [7]. Podophyllotoxin afledte forbindelser anvendt i klinisk behandling af kræft ofte viser resistens på grund af afvigende ekspression og mutation af specifikke p-tubulin isotyper under behandlingen [24]. Derudover er også rapporteret paclitaxel modstand at korrelere med forøget ekspression af p-glycoproteiner [25], [26]. Det er værd at nævne, at Ching001 behandling viste en lignende cytotoksisk virkning i forskellige lungecancer-celler, som udtrykker forskellige niveauer af p-glycoproteiner (fig. 1B og fig. S6). Derudover viste Ching001 behandling en stærk cytotoksisk aktivitet mod en etoposid-resistent human epidermal cancer cellelinje (fig. S7). Hvorvidt Ching001 er et potent stof til behandling af taxanes- eller etoposid-resistente celler garanterer yderligere undersøgelser.

Som konklusion, Ching001 udviser anti-tumor vækst og kolonisering inhiberingseffektivitet uden skadelige virkninger i vores prækliniske tests. Disse resultater fremhæve den terapeutiske potentiale af Ching001 i kræftbehandling. Syntetisk Ching001 forbindelse høj renhed og udbytte med kræft celle-specifikke cytotoksicitet er en potentiel kandidat til at blive testet som en ledende farmaceutisk stof til kræftbehandling.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyr blev opnået fra National Laboratory Animal center (Kina, Taiwan) med godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), National Cheng Kung University (IACUC godkendelse nr 98.099) og blev opretholdt i patogen frie betingelser. godkendelse Undersøgelsen af ​​den fornyede bestyrelsen institution og etiske udvalg blev bekræftet af National Cheng Kung University.

Cell Line, Cell Culture, og synkronisering

Normalt humant lunge epitel celle MRC5 og human lunge adenocarcinom celle linjer CL1-0, og CL1-5 blev opnået fra Dr. PC Yang (Department of Internal Medicine, National Taiwan University Hospital, Taiwan) [27]. De humane ikke-småcellet lungekræft cellelinier H1299 og A549 blev opnået fra American Type Cell Culture. De humane epidermal kræft cellelinier KB og KB-7D celler blev leveret af Dr. Jang-Yang Chang fra National Health Research Institute, Tainan, Taiwan. KB-cellelinien blev oprindelig købt fra American Type Cell Culture og KB-7D er et etoposid-resistent cellelinje afledt fra KB-cellelinien [28]. Alle celler blev dyrket i DMEM (Gibco, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) med 10% FBS (Gibco) og 1% penicillin /streptomycin (Gibco) og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2 fugtig atmosfære. For at synkronisere cellerne ved S-fasen, blev cellerne behandlet med 2 mg /ml aphidicolin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 24 timer og frigives i cellecyklus før Ching001 behandling.

forbindelser, der anvendes

podophyllotoxin derivat, Ching001, blev udarbejdet af medforfatter W.-S. Li. Anmodning om stoffet skal sendes til [email protected].

cytotoksicitetsanalyse

Celler (3 × 10

4) blev podet på 6-brønds petriskåle og forskellige koncentrationer af Ching001 (0,5, 1, 3, 5 uM) blev tilsat til hver brønd i 48 timer. Celleantal og levedygtighed blev bestemt ved trypanblåt-farvning og celletælling.

mikrotubulisamlingsassay

mikrotubulisamlingsassay blev udført ifølge den tidligere undersøgelse [29]. Celler (1 x 10

6) podedes på 100 mm dyrkningsskåle og behandlet med 1 uM Ching001 eller DMSO kontrol i 6 til 48 h. Supernatantfraktionen af ​​totale cellelysater blev opsamlet som opløselige ap-tubulin dimerer og kvantificeres ved Bradford assay. Pelleten blev opsamlet som uopløseligt protein indeholdende polymeriserede mikrotubuli, som blev kogt med protein prøvebuffer for at opløse proteiner. Ca. 50 ug opløseligt protein lysater blev anvendt som ladningskontrol, og tilsvarende volumen af ​​uopløselige proteinlysater blev anvendt til α-tubulin immunblotting. Alle antistoffer og deres anvendte reaktionsbetingelser er anført i tabel S1.

flowcytometri

CL1-0, CL1-5, A549, og H1299 celler (1 x 10

6) var opsamlet efter 6 og 12 timer behandling med 0,5 pM eller 1 pM Ching001, vasket to gange med Hanks balancerede saltopløsning (Sigma-Aldrich) og -20

oC ethanol fiksering natten over. Celler blev inkuberet med DNA-interkalator propidiumiodid (Sigma-Aldrich) ved 37

oC i 1 time med 1 ug /ml RNase A og 0,1% Triton-X100. Ca. 3 × 10

påvistes 4 celler ved hjælp FACScalibur instrument (BD Biosciences, San Jose, CA) at analysere fordelingen cellecyklus.

Immuncytokemi Farvning

Celler (1 x 10

4) blev podet i kammerskiver og behandlet med Ching001 eller DMSO-kontrol i 48 timer. De behandlede celler blev hybridiseret med α-tubulin antistof og DAPI efter fiksering. Antistoffer af survivin og aurora B blev anvendt til mitotisk cellefarvning. Anti-PS-antistof blev anvendt til påvisning af tidlige stadium af apoptose. Celler blev derefter fotograferet under et Olympus FV1000 konfokalt mikroskop. Detaljerede procedurer og antistoffer er beskrevet i tabel S1.

Western blot analyse

Prøver indeholdende lige store mængder af protein (50 ug) blev separeret på en 10% SDS-PAGE og elektroblottet på Immobilon-P membraner (Millipore). Western blot blev udført for at måle protein ekspressionsniveau. Detaljerede procedurer og antistoffer er beskrevet i tabel S1.

DNA Ladder Assay

Celler (1 x 10

6) blev behandlet med DMSO kontrol eller 3.-5 uM Ching001 for 24 til 48 h blev DNA ekstraheret under anvendelse af DNA ekstraktionsbuffer (0,2 uM phosphat-citratbuffer, pH 7,8; ​​37

oC, 1 time reaktion), efterfulgt af RNase A og proteinase K-behandling. Agarosegelelektroforese blev anvendt til DNA-stige-analyser.

Caspase-4 aktivitetsassay

Caspase-4-aktivitet blev udført ved caspase-4-aktivitet assaykit (GeneTex, Irvine, CA). Kort fortalt, blev ca. 200 ug totale cellelysater med DMSO kontrol eller Ching001 behandling i 6 til 48 timer anvendes til assayet. Aktiviteten af ​​caspase-4 blev bestemt ved spaltning af LEVD-AFC substrat og detekteret ved ELISA-læser (Ex /Em: 400/505).

Kvantitativ revers transkriptase-polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

mRNA ekspressionen af ​​p-glycoprotein familiens gener

ABCB1

ABCG2

blev påvist ved QRT-PCR i både normale og cancer lunge cellelinjer. Totalt RNA blev ekstraheret fra forskellige humane lunge cellelinjer under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). Omkring 4 ug af RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af SuperScript revers transkriptase (Invitrogen). Kvantitativ RT-PCR blev udført for at detektere mRNA-ekspression niveauet af målgener ved at bruge StepOnePlus ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) med

GAPDH

som intern kontrol. Primerne til

ABCB1

er: sense 5′-AAATTGGCTTGACAAGTTGTATATGG-3 ‘, antisense 5′-CACCAGCATCATGAGAGGAAGTC-3’; for

ABCG2

: sense 5′-TCATCAGCCTCGATATTCCATCT-3 ‘, antisense 5′-GGCCCGTGGAACATAAGTCTT-3’; for

GAPDH

: sense 5’GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ‘, antisense 5’TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’. CDNA-prøver blev amplificeret ved anvendelse af SYBR Green (Applied Biosystems) og termisk cykling tilstand består af 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 45 cykler ved 95 ° C i 3 sek og 60 ° C i 30 sek. Cyklus tærskel (Ct), blev fraktioneret cyklusnummer ved hvilken mængden af ​​amplificeret mål nået en fast tærskelværdi bestemt. De normaliserede forhold mellem målgener blev beregnet ved hjælp af ACt [ACt = Ct

-target gen – Ct

-GAPDH]. Data blev præsenteret som fold forskelle i forhold til IMR90 normal lunge celle gener udtryk baseret på beregninger af 2

-ΔΔCt. (ΔΔCt = ACt

-lung cellelinje – ACt

-IMR90)

MTT Cytotoksicitet Analyse

Forskellige koncentrationer af Ching001 blev tilsat til hver plade og inkuberet i 48 timer. Cell levedygtighed under forskellige koncentrationer af forbindelse behandling blev bestemt ved 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT, Sigma, St. Louis, MO) assay. I den ubehandlede kontrol blev 0,1% DMSO-holdigt medium anvendes.

In vivo

Tumor xenograft Formation Assay

ICR-Foxn1 nøgne mus (5 uger gamle) blev erhvervet fra National Laboratory Animal center med godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), National Cheng Kung University (IACUC godkendelse nr 98.099), og opvokset i en SPF-miljø. A549-celler (5 x 10

6) blev subkutant injiceret som xenograft i mus og lades vokse op til 50 mm

3 tumor nodule inden for 2 uger. Mus blev derefter injiceret intraperitonealt med 0,4 mg /kg, eller 2 mg /kg Ching001 eller 4 mg /kg paclitaxel som positiv kontrol eller kontrol opløsningsmiddel (ethanol: Cremophore: ddH

2O = 02:01:07) på dag 1, 3, 5, 7, 9. volumenet af xenograft og vægten af ​​mus blev målt og kvantificeret under 35 dages lægemiddelbehandling. Xenotransplantatet volumen blev beregnet som (længde x bredde firkant) /2 i mm

3. Større organer, herunder hjerte, lunge, lever, nyre og xenograft knude blev dissekeret og farvet med H . E for yderligere bekræftelse

In vivo

Eksperimentel Metastase Assay

BALB /c mus blev erhvervet og opvokset efter opnåelse passende institutionel review board tilladelse, som beskrevet ovenfor. A549 (1 × 10

6) celler blev intravenøst ​​injiceret i halen-vene af BALB /c-mus, som derefter blev intraperitonealt givet DMSO kontrol, 0,2 mg /kg Ching001 eller 0,2 mg /kg Paclitaxel hver anden dag i fem uger .