PLoS ONE: Hydrogenperoxid Alters Splejsning af opløselig guanylylcyclase og selektivt Modulerer Angivelse af Splejsning Tilsynsmyndigheder inden humane cancerceller

Abstrakt

Baggrund

Opløselig guanylylcyclase (SGC) spiller en central rolle i nitrogenoxid (NO) -medieret signaltransduktion i kardiovaskulære, nervøs og gastrointestinale systemer. Alternativ RNA splejsning har vist sig som en potentiel mekanisme til at modulere sGC udtryk og aktivitet. C-α1 sGC er en alternativ splejset form, der er resistent over for oxidation-induceret proteinnedbrydning og demonstrerer præferentiel subcellulære fordeling til den oxiderede miljø af endoplasmatisk reticulum (ER).

Metode /vigtigste resultater Salg

her rapporterer vi, at splejsning af C-α1 sGC kan moduleres ved H

2 behandling i BE2 neuroblastom og MDA-MD-468 adenocarcinom humane celler. Desuden viser vi, at H

2 behandling af MDA-MD-468 celler selektivt nedsætter protein niveauer af PTBP1 og hnRNP A2 /B1 splejsning faktorer identificeret som potentiel α1 gensplejsning regulatorer af

in silico

analyse. Vi demonstrerer endvidere, at nedregulering af PTBP1 af H

2 sker på proteinniveauet med variabel regulering observeret i forskellige brystkræftceller.

Konklusioner /Betydning

Vores data viser, at H

2 regulerer RNA-splejsning for at inducere ekspression af oxidationsbestandige C-α1 sGC underenheden. Vi rapporterer også, at H

2 behandling selektivt ændrer ekspressionen af vigtige splejsning regulatorer. Denne proces kan spille en vigtig rolle i reguleringen af cellulære tilpasning til betingelserne for oxidativ stress

Henvisning:. Cote GJ, Zhu W, Thomas A, Martin E, Murad F, Sharina IG (2012) Hydrogenperoxid Alters Splejsning af opløseligt guanylylcyclase og selektivt Modulerer Angivelse af splejsning Tilsynsmyndigheder inden humane cancerceller. PLoS ONE 7 (7): e41099. doi: 10,1371 /journal.pone.0041099

Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: November 16, 2011; Accepteret: 21 Juni 2012; Udgivet: 20 juli 2012

Copyright: © 2012 Cote et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud RO1 HL088128 og 3R01HL088128 og AHA South Central Affiliate Grant-in-Aid 09GRNT2060182 til EM og afdelinger nystartede midler til IS De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Alternativ splejsning udvider transkriptom mangfoldighed [1], [2] og tillader celler at opfylde kravene i en foranderlig ekstracellulære miljø. Fælles stressfaktorer såsom varme-shock, aminosyre sult eller ethanol toksicitet er blevet påvist at regulere alternativ splejsning [3], [4]. Oxidativ stress ofte fortsætter i cellulær mikromiljø, når der er en ubalance i produktion og afskaffelse af reaktive ilt arter (ROS). Denne ubalance er forbundet med en overflod af patologiske tilstande, herunder carcinogenese, hjerte-kar-sygdomme og neurodegeneration [5], [6], [7], [8], [9]. Nyere undersøgelser viser, at den alternative splejsning kan påvirkes af ændringer i oxidativ balance. Hypoksiske og hypoxi /reoxygenering betingelser, der ændrer ROS homeostase, er blevet demonstreret at modificere splejsning af et antal gener i normale væv og cancercellelinjer [10], [11], [12], [13], [14]. Desuden nye data viser, at ROS også kan ændre overflod af splejsning faktorer eller ændre deres aktivitet. Lave koncentrationer af hydrogenperoxid (H

2), et allestedsnærværende ROS molekyle, er blevet demonstreret at inducere phosphorylering af splejsning faktor hnRNP C fører til modulering af dets RNA-bindende affinitet [15]. Øget hnRNP-C-ekspression findes også i intimahyperplasi og åreforkalkning, som foreslås at være forbundet med stigninger i H

2 niveauer produceret af aktiverede vaskulære endotel [16].

Opløselig guanylyl cyclase (sGC) er et nøgleenzym af nitrogenoxid (NO) signalvejen og spiller en vigtig rolle i kardiovaskulær, neuronal og gastrointestinale funktioner [17]. Aktiv sGC protein er et jernholdigt hemholdigt heterodimer sammensat af a- og p-underenheder, som aktiveres som reaktion på bindingen af NO til sin hæmdel. Hem oxidation foreslås at være en af de mekanismer, der er ansvarlige for svækkelse af NO /cGMP signalering i tilstande af oxidativ stress [18]. SGC-specifik inhibitor 1H- [1], [2], [4] oxadiazolo [4,3, -a] quinoxalin-1-on (ODQ) oxiderer sGC jernholdigt hæm til ferri formularen undertrykke bindingen af NO. Eksponering af celler og væv til ODQ udløser sGC nedbrydning som følge af destabilisering af sGC heterodimer gennem ubiquitinering og målrettet proteasomalaktivitet nedbrydning [18]. Vi har tidligere identificeret en hidtil ukendt alternativt splejset isoform af sGC, C-α1, som er fuldt funktionel trods en omfattende deletion i N-terminus [19]. Overraskende C-α1 splejset form var signifikant mere resistent over for proteinnedbrydning induceret af behandling med ODQ [19] og havde en anden cellulær lokalisering til differentiering af stamceller end den kanoniske α1 sGC [20]. Nylige undersøgelser af Kraehling et al. afslørede, at i modsætning til den kanoniske α1 sGC isoform, den C-α1 isoform tendens til at lokalisere til den mere oxideret miljø af det endoplasmatiske reticulum (ER) inde i cellen [21]. Disse observationer har ført os til at foreslå, at ekspressionen af den alternative C-α1 protein isoform kan være fremkaldt af oxidativ stress som en del af tilpasningen mekanisme til at bevare sGC aktivitet i oxidative betingelser.

I nærværende undersøgelse, vi undersøgte hvis splejsning af α1 sGC genet kan moduleres af ROS, specielt ved behandling med H

2. Vi fandt, at H

2 inducerer ekspressionen af C-α1 udskrift og C-α1 protein i humane cancerceller udtrykker α1 /β1 sGC. I et forsøg på at få indsigt i den reguleringsmekanisme, vi undersøgte ekspressionsniveauerne af flere RNA-bindende proteiner potentielt involveret i splejsning af C-α1 splejsning variant. Vores undersøgelser viser, at H

2 behandling selektivt nedsætter udtryk for formodede α1 sGC splejsning regulatorer PTBP1 og hnRNP A2 /B1. Endvidere viser vi, at H

2-induceret nedbrydning af PTBP1 afviger i forskellige brystcancercellelinier. Til vores viden, dette er en første rapport viser, at H

2-induceret oxidativ stress påvirker alternativ splejsning af sGC og selektivt modulerer proteinniveau af større splejsning faktorer.

Resultater

2 ekspressionen af C-α1 sGC splejse variant

for at undersøge om alternativ splejsning af GUCY1A3 (α1 sGC subunit gen) reguleres som respons på oxidativ stress, vi behandlede menneske brystcarcinoma MDA468 og menneskelige neuroblastom BE2 cellelinjer med 1 mM H

2. MDA468 og BE2 celler endogent udtrykker α1 og β1 sGC. H

2-koncentration blev valgt baseret på tidligere observationer der viser, at interaktionen med serumproteiner i celledyrkningsmedier, absorption af cellulære membraner og neutralisering ved enzymatiske bestanddele af cellulære anti-oxidativ forsvar forbruge af eksogent tilsat en betydelig del H

2 [22], [23]. MDA468 og BE2 celler viste en signifikant stigning i C-α1 sGC alternative transcript ekspression ved H

2 behandling (fig. 1 A, B). Den relative stigning i C-α1 isoform i forhold til α1 transskript var større i BE2 celler, i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser [19]. Resultaterne indikerede, at GUCY1A3 splejsning ændres for at tillade anerkendelse af C-α1 specifik 3′-splejsningssted i exon 4 som svar på H

2 eksponering. Selv i nogle forsøg niveauet af C-α1 blev forøget med ODQ, hverken cellelinje viste statistisk signifikante ændringer i C-α1 udskrift niveau tyder på, at ODQ behandling alene ikke tilstrækkelig til at påvirke splejsning regulering

:. RT PCR påvisning af α1 (øverst) og C-α1 (nederste bånd) sGC transkripter efter behandling med H

2 (1 mM) eller ODQ (20 uM) som angivet. RT-PCR-produkter adskilles på 3% agarosegel og farvet med ethidiumbromid. Øvre bånd repræsenterer meddelelsen koder kanoniske α1-protein (Transkripter 1-4, 270 bp); midterste bånd er et ikke-specifikt produkt; nederste bånd indikerer C-α1 sGC udskrift (Transcript 5, 94 bp). Biologiske triplikater repræsentative for tre uafhængige eksperimenter er vist. B: Ratio (middelværdi ± SD) af den relative forekomst af C-a1 og a1 transkripter kvantificeret ved densitometri. * P 0,05 ved t-test. C: Western blot-detektion af α1 (øverst) og C-α1 (nederst) proteiner. MDA468-celler blev behandlet med 1 mM H

2 som angivet i nærvær eller fravær af MG132 (10 uM). Viste blots er repræsentative for fire uafhængige forsøg med lignende resultater. D: Forholdet mellem den relative forekomst af C-a1 og a1 proteiner kvantificeret ved densitometri. Data er vist som gennemsnit ± SD fra fire uafhængige forsøg.

Næste, vi evaluerede tidsforløbet af ændringerne i overflod af α1 og C-a1 sGC proteiner i respons på H

2. Sammenfaldende med stigninger i GUCY1A3 splejsning vi observeret en tidsafhængig modulering af α1 og C-a1 sGC proteinniveauer. Som vist i fig. 1C og D, H

2 forøgede relative indhold af C-α1 protein i MDA468 celler. At vurdere bidraget af proteasom-afhængig nedbrydning i regulering af a1 sGC splejsede former, udførte vi eksperimentet i nærværelse af MG132, en potent celle-permeable proteasominhibitor. Vi fandt, at forbehandling med MG132 ikke påvirkede hastigheden af ophobning af C-α1 splejsning variant eller niveauet for den kanoniske α1 sGC underenhed. Disse data antyder, at den observerede stigning i C α1-protein overflod (fig. 1D) sandsynligvis skyldes en forøget C-α1 ekspression, og ikke til en selektiv nedbrydning af kanoniske α1 sGC. Af note er, at MG132 behandling også forhøjede niveauer af et ukendt polypeptid genkendt af anti-a1 antistoffer med molekylvægt lavere end C-α1 sGC (fig. 1D). Som identiteten af dette protein er endnu ikke fastslået, blev dens intensitet ikke inkluderet i densitometrianalyse.

Sammen vores resultater foreslog, at H

2 inducerer præferentiel splejsning og ekspressionen af C-α1 sGC splejse form vores celle modeller.

i silico

analyse identificerer potentielle a1 sGC (GUCY1A3) splejsning regulatorer

for at få den første indsigt i potentielle mekanismer α1 sGC splejsning regulering, vi udførte

i silico

analyse ved hjælp af flere bioinformatiske værktøjer [24]. C-α1 splejsningsvariant genereres ved anvendelse af en alternativ 3′-splejsningssted 179 basepar nedstrøms for den konstitutive stedet (fig. 2A, fig. S1). Konstitutive og alternative splejsningssites til exon 4 af α1 sGC blev defineret med UCSC Genome Bioinformatik værktøj og deres relative konsensus værdi undersøges med human Splejsning Finder [25], [26]. Alternativ splejsning af exon 4 spiller en central rolle i GUCY1A3 udskrift mangfoldighed; foruden den konstitutive site, exon indeholder 2 alternative donorsteder og 2 alternative acceptorsites (se fig. 2A og fig. S1). Med undtagelse af den konstitutive 5′-splejsningssted donor, den relative konsensus styrken af alle de områder viste sig at være lav (fig. S1). Dette er et fælles træk ved alternativt forarbejdede exoner, som menes at lette reguleringen af serin-arginin rige (SR) og heterogene nukleare ribonukleoprotein (hnRNP) proteiner [2]. Den ASD, Alternativ Splejsning /Splejsning Rainbow værktøj fra Europæiske Molekylærbiologiske Laboratorium [27], blev brugt til at analysere den relevante exon og proksimale intronsekvenser for potentielle SR og hnRNP regulatorer af exon 4 splejsning. Vi genererede en sammensat oversigt over regulator bindingssteder ved anvendelse af de afledte værdier for individuelle SR og hnRNP proteiner (tabel S1). Denne analyse identificerede en forholdsvis jævn fordeling af SR bindingssteder hele exon 4 og de flankerende regioner. Samtidig viste den konstitutive 3′-splejsningssted intronområde en tæt top af hnRNP-bindingssteder (fig. 2A). En nærmere undersøgelse identificeret i denne sekvens flere overlappende bindingssteder for hnRNP 2A /B1, polypyrimidine-tarmkanalen-bindende protein 1 (hnRNP I, PTBP1), SRp20, SRp40 og Hu-antigen R (HUR, ELAVL1) splejsning regulatorer (fig. S1) . Placeringen af disse lokaliteter foreslået, at tilsvarende splejsning faktorer kan påvirke brugen af begge kanoniske og alternative splejsningssteder, fremme generation af C-α1 sGC udskrift

A:. Skematisk fremstilling af GUCY1A3 alternativ splejsning til generere C-α1. Den relative fordeling af forudsagte SR og hnRNP bindingssteder er vist. B: Western-analyse af PTBP1, hnRNP2A /1B, Hur og SR proteiner udtryk i kontrol og H

2-behandlet (1 mM, 24 timer) MDA468 celler. C: H

2 dosisafhængig vurdering af PTBP1 og hnRNP A2 /B1 proteinniveauer i MDA468 celler. Viste Western blots er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg med lignende resultater. D, F: densitometrianalyse af PTBP1 og hnRNP A2 /B1 proteinniveauer normaliseret på β-actin. Data er vist som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg.

2O selektivt ændrer

2 udtryk for splejsning faktorer

Det er velkendt, at udtrykket niveauer og den relative støkiometri splice faktorer modulere alternativ splejsning [28]. Derfor undersøgte vi effekten af H

2 eksponering på protein niveauer i splejsning faktorer, som vores

i silico

analyse som potentielle sGC regulatorer. Som vist i fig. 2B, eksponeringen af MDA468 celle til H

2 selektivt faldt protein niveau PTBP1 og hnRNP A2 /B1 splejsning repressorer. H

2 ikke påvirke niveauet for HUR regulator og kun lidt ændrede niveauer af SRp40 protein fra SR familie af splejsning forstærkere. Både PTBP1 og hnRNP A2 /B1 proteiner faldt på en dosis-afhængig måde i MDA468 celler (fig. 2 C, D og F). Vores data viser, at den observerede H

2-afhængige skifte i splejsning af GUCY1A3 gen falder sammen med de ændringer i niveauet af regulerende splejsning faktorer. Men den nøjagtige mekanisme og bidraget fra specifikke splejsning faktorer i reguleringen af sGC splejsning skal stadig bestemmes,.

Indsigt i mekanismen for H

2-induceret PTBP1 proteinnedbrydning

Næste vi undersøgt potentielle mekanismer hnRNP regulering af H

2. Vi valgte at fokusere på PTBP1 da dette grundigt undersøgt RNA-bindende protein spiller en vigtig rolle i forskellige trin af cellulær mRNA-processering, herunder splejsning, regulering af stabilitet, lokalisering og oversættelse [29]. Desuden PTBP1 har vist sig at være afgørende i reguleringen af cellevækst og cancer celler overlevelse [30], [31], [32]. Evnen af H

2 for at reducere PTBP1 niveauer foreslog, at, desuden kan det spille en rolle i reguleringen af cellulære tilpasning til oxidative betingelser. Men effekten af forhøjede ROS niveauer på PTBP1 udtryk er aldrig tidligere blevet undersøgt.

Vi først undersøgt, hvis H

2 ændrer PTBP1 mRNA steady state-niveauerne. RT-qPCR analyse udført med RNA-prøver isoleret fra MDA468 celler behandlet med forskellige H

2 koncentrationer blev ikke fundet nogen ændringer i PTBP1 mRNA-niveauer (fig. 3C), hvilket indikerer, at PTBP1 sandsynligvis vil blive styret på proteinniveau. For at undersøge rollen af proteasomalaktivitet nedbrydning, monitorerede vi dynamikken i ændringer i PTBP1 protein som respons på H

2 behandling over en 16 timers periode i nærværelse eller fravær af proteasominhibitor MG132. Vi fandt, at PTBP1 protein blev reduceret på en tidsafhængig måde starter ved 8 timer efter eksponering (fig. 3 A, B). Interessant nok blev den proteinnedbrydning ikke forhindret, men tværtimod udbygges ved MG132 behandling. Dette var særlig tydeligt ved 16-timers og senere tidspunkter (fig. 3A og data ikke vist). Mens MG132 behandling viste, at proteasomet havde nogen direkte virkning på PTBP1 nedbrydning, det faktum, at dets hæmning accelererer nedbrydningen indebærer en indirekte rolle i regulering, sandsynligvis gennem stabilisering af et ukendt protease eller protein cofaktor. Forbehandlingen af MDA468 celler med cycloheximid (CHX, inhibitoren af

de novo

proteinsyntese) også forhindrede ikke PTBP1 falde, hvilket indikerer, at H

2 blev induktion af en allerede eksisterende proteinnedbrydning pathway (fig. 3D). Det er tidligere blevet påvist, at cellulær apoptose fører til PTBP1 nedbrydning gennem Capase-3-aktivering [33]. Således har vi undersøgt muligheden for, at caspase-3 kan spille en rolle i H

2-induceret PTBP1 falder. Vi fandt imidlertid, at tilsætningen af caspase-3-inhibitor IV (Ac-DMQD-CHO, Calbiochem) forhindrede ikke H

2-induceret PTBP1 nedbrydning (resultater er ikke vist), hvilket indikerer, at caspase-3 er ikke involveret i denne proces. For at bestemme om andre udefra kommende kilder, foruden direkte tilsætning af H

2 løsning, kan påvirke stabiliteten af PTB1, vi anvendte glukose oxidase (GO) til cellekulturmedier. I overensstemmelse med den direkte rolle i H

2 i induktion af PTBP1 nedbrydning, steady-state produktion af H

2 af GO behandling gengivet effekten.

A : PTBP1 nedbrydning forekommer i tidsafhængig måde og ikke hindres af proteasominhibitoren MG132. MDA468-celler blev behandlet som i fig. 1C med 1 mM H

2 i nærvær eller fravær af MG132 (10 uM). Western blot-analyse blev udført for at visualisere ekspressionen af PTBP1. β-actin tjente som en loading kontrol. Biologiske dubletter for hver behandling er vist; blots er repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater. B: densitometrianalyse af PTBP1 proteinniveauer normaliseret på β-actin. Gennemsnit for repræsentative biologiske dubletter for hver behandling, er vist. C: H

2 eksponering påvirker ikke PTBP1 mRNA-niveauer. MDA468 celler blev behandlet med angivne koncentrationer af H

2 i 24 timer. Relative forekomst af PTBP1 mRNA i prøver blev analyseret ved RT-qPCR analyse. Gennemsnitlig ACt ± SD for biologiske tredobbelte vises. D: PTBP1 nedbrydning afhænger af thiol oxidation og er ikke reddet ved inhibering af

de novo

proteinsyntese. Western blot-analyse udført på MDA468 cellelysater behandlet i 24 timer med inhibitor af proteinsyntese cycloxemide (2 ug /ml) og forskellige faktorer inducerende oxidativ stress: 1 mM BSO (GSH udtømning inducer); 1 mM HEDS (thiol oxidation induktor) og 0,01 enheder /ml glucoseoxidase (øger produktionen af ROS). Vist Western blots er repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

2 inducerer post-translationelle protein modifikationer såsom oxidation af intracellulære thioler og thiolat anioner. Disse ændringer er en integreret del af H

2 signalering berører en række cellulære processer [34]. Det er tidligere blevet påvist, at PTBP1 i oxidative betingelser kan danne dimerer på grund af dannelsen af intermolekylære disulfidbroer [35]. Ja, i vores eksperimenter, vi har registreret også dannelsen af en høj molekylvægt protein bånd genkendt af PTB1 antistoffer efter behandling af MDA468 celler med H

2 (resultater ikke vist).

for at evaluere bidrag thiol oxidation til PTBP1 nedbrydning, vi udsættes MDA468 celler til to forskellige forbindelser ændrer cellulære thiol stofskifte. Behandling med 2-hydroxyethyl disulfid (HEDS), et middel, der virker som thiol-specifik oxidant, faldt betydeligt PTBP1 niveauer (fig. 3D), hvilket indikerer, at direkte thiol oxidation kan spille en vigtig rolle i PTBP1 nedbrydning respons. For yderligere test, hvis PTBP1 nedbrydning induceres ved formindsket cellulære thiol-reducerende aktivitet som reaktion på H

2, vi også behandlet cellerne med L-buthionine-S, R-sulfoximin (BSO). BSO er en irreversibel hæmmer af glutathion biosyntese, faldende intracellulær glutathion pool. Vi observerede ingen signifikant nedbrydning af PTBP1 som reaktion på BSO, hvilket antyder, at et lavere niveau af GSH ikke er tilstrækkelig til at fremkalde PTBP1 (fig. 3D) nedbrydning. Disse resultater kan også være relateret til den iboende evne MDA468 celler for at kompensere for GSH tab induceret af BSO, som det tidligere er blevet rapporteret for cellelinier med høj SOD-ekspression [36]. Således oxidation af Cys thioler af H

2 kunne initiere dannelsen af PTBP1 dimerer og bidrage til efterfølgende protein nedbrydning.

2 effekt på PTBP1 protein niveauer varierer i forskellige brystkræft cellelinier

for at bestemme det generelle i H

2-induceret PTBP1 nedbrydning, vi testede yderligere brystkræft linjer, herunder: MDA-MD-453, MDA- MD-231 og MCF7. Western blot analyse af H

2-behandlede celler demonstrerede forskellige grader af PTBP1 reduktion i MDA468, MCF7 og MDA231 celler, men ingen ændring i MDA453 celler (Fig. 4A). Den manglende inducere PTBP1 nedbrydning i MDA453 celler blev observeret ved H

2 koncentrationer, let fremkaldte signifikante fald i MDA468 celler (sammenlign med fig. 4B til fig. 2B og C). Disse data antydede, at graden af H

2-induceret nedbrydning af PTBP1, tænkte udbredt, er stadig forholdsvis cellelinie specifikke. At udforske, om modstanden mod PTBP1 proteinnedbrydning er forbundet med øget cellernes evne til at overleve oxidativt stress, vi sammenlignet H

2-induceret cytotoksicitet i MDA468 og MDA453 celler. MDA468-celler var mindre modstandsdygtige over for H

2-induceret cytotoksicitet (IC

50 = 450 ± 60 pM) sammenlignet med MDA453 celler (IC

50 = 660 ± 2 pM) (fig. 5 ). I et forsøg på at direkte forbinde en reduktion i PTBP1 niveauer til H

2-induceret cytotoksicitet udførte vi siRNA-medieret PTBP1 knockdown i MDA453 celler. Trods en reduktion på over 50% i PTBP1 mRNA (som påvist ved RT-qPCR), afslørede cellelevedygtighed målinger kun en lille ubetydelig fald i resistens over for H

2 behandling (fig. S2). Disse data antyder, at niveauet af PTBP1 ekspression alene er ikke kritisk vigtigt at støtte oxidative resistens i MDA435 celler

A:. Western blot-analyse undersøger PTBP1 ekspression i MDA231, MDA453, MDA468 og MCF7-celler behandlet med 1 mM H

2 i 18 timer. Repræsentative biologiske dubletter er vist. B: MDA453 celler er resistente over for H

2-induceret PTBP1 nedbrydning.

Top panel

: MDA453 celle blev behandlet med forskellig koncentration af H

2 og cellelysater blev udsat for Western blot-analyse med antistoffer mod PTBP1 og β-actin. Viste blots er repræsentative for fire uafhængige forsøg med lignende resultater.

Bundplade

: densitometrianalyse af PTBP1 protein niveauer normaliseret på p-actin niveauer. Gennemsnit for repræsentative biologiske dubletter for hver behandling, er vist.

Survival kurve blev genereret som reaktion på H

2 dosering ved hjælp trypan udelukkelse metode og udtrykt som% af overlevelse til ubehandlede kontroller . Middel ± SD af tre uafhængige passager udført i tre eksemplarer vises, * – p. 0,05 af t-test i forhold til at styre

Diskussion

I denne rapport viser vi, at det oxidative stress fremkaldt af H

2 påvirkninger splejsning af α1 sGC’en genet (GUCY1A3) og selektivt nedsætter proteinniveau af PTBP1 og hnRNP A2 /B1 splejsningsfaktorer. Vi har tidligere konstateret, at GUCY1A3 transkripter undergår alternativ splejsning, og at C-α1 sGC splejsningsisoform koder for et protein, der er resistent over for ODQ-induceret nedbrydning [19], [37]. ODQ inducerer nedbrydning ved oxidation af SGC proteser hæm-gruppe, der destabiliserer proteinet. En lignende proces er blevet foreslået at forekomme i tilstande af oxidativ stress og for at være ansvarlig for nedsat niveau af sGC protein i vaskulær inflammation [23]. I dette studie undersøgte vi, om sGC splejsning kan moduleres ved ROS som en potentiel mekanisme til fordel for ekspressionen af oxidationsresistente C-α1 splejset form.

2 er et allestedsnærværende ROS molekyle, der produceres i celler ved superoxid dismutases som en metabolit af superoxid anion (O

2-). H

2 er et relativt stabilt og neutralt ladet, som gør det muligt at let cross cellemembraner. Disse egenskaber har ført til forslaget om, at H

2 kan være involveret i parakrin oxidativ stress signalering [38], [39]. Således valgte vi at undersøge H

2 som mediator af oxidativ stress i vores undersøgelser udført på human BE2 neuroblastom og MDA468 bryst adenocarcinom cellelinjer. Vores data vist for første gang, at en eksponering for H

2 øger den relative mængde af C-α1 mRNA og protein i disse cellelinjer (fig. 1). Dette resultat fastslår, at C-α1 splejsning kan moduleres ved fysiologisk relevant ROS forbindelse, og foreslår, at splejsning kan spille en vigtig rolle i modulering sGC enzymatiske egenskaber som følge af ændringer i oxidativ balance i mikromiljøet. En yderligere undersøgelse til støtte for denne idé er for nylig blevet rapporteret af Kraehling et al. [21]. Denne rapport uafhængigt bekræftet vores tidligere fund, at C-a1 sGC danner meget stabile og fuldt aktive heterodimerer med β1 sGC. Endvidere forskellen i subcellulære fordeling af C-a1 og kanonisk a1 sGC-underenheder er blevet påvist under anvendelse af fluorescens-mærkede protein; C-α1 isoform blev lokaliseret til de mere oxiderede miljø af endoplasmatisk reticulum. Sammen antyder disse data, at alternativ splejsning af GUCY1A3 gen kan deltage i adaptiv cellerespons at bevare sGC funktion i oxidativt stress. Yderligere undersøgelser for at evaluere den fysiologiske betydning af en sådan tilpasning er nødvendige.

For at få et indblik i potentielle mekanismer involveret i alternativ splejsning af α1 sGC, vi udførte en

i silico

analyse af relevante GUCY1A3 intron og exon sekvenser til at identificere potentielle regulatoriske elementer [40], [41]. Fordelingen af forudsagt

cis

reguleringsmyndigheder sekvenser var i overensstemmelse med en model, hvor SR proteiner ville favorisere kanonisk splejsningssite brug, mens binding af hnRNPs, specielt PTBP1 og hnRNP A2 /B1, ville blokere anerkendelse af exon 4 konstitutive 3′-splejsningssted at fremme C-α1 isoform produktion (fig. 2A og fig. S1). For at teste vores model undersøgte vi udtryk for splejsning faktorer før og efter udsættelse for H

2. Mens splejsning regulering opnås almindeligvis ved at modulere ekspressionsniveauet af regulatoriske faktorer [28], virkningerne af oxidativt stress på denne proces er ikke tidligere blevet karakteriseret. I modsætning til vores forventninger, viste data, at H

2 eksponering inducerede en selektiv reduktion af PTBP1 og hnRNP A2 /B1, og havde ingen effekt på HUR og SR proteinekspression (fig. 2). Vores eksperimentelle resultater indikerer en mere kompleks regulering af sGC splejsning end forudsagt

i silico

model. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forklare denne forskel. På en anden side, den specifikke og dramatisk reduktion af to centrale RNA splejsning faktorer foreslog, at selektiv nedregulering af splice regulatorer kunne være en af de mekanismer, der ligger til grund ændringerne i alternativ splejsning som reaktion på oxidativ stress.

PTBP1 spiller en afgørende rolle i en række post-transkriptionelle regulatoriske processer, og dets aktivitet er blevet forbundet med cellulær proliferation, apoptose, tumorigenese og respons på hypoxi [30], [42], [43], [44]. Derfor valgte vi at yderligere at udforske effekten af H

2 behandling på PTBP1 udtryk. Vores resultater viste, at H

2 aftager PTBP1 ekspression i en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 2C, F og fig. 3A, B). Ingen ændring i PTBP1 mRNA-niveau blev observeret, hvilket indikerer, at nedreguleringen forekommer post-transkriptionelt (fig. 3C). Endvidere flere timer forsinket reaktion på H

2 behandling tyder en indirekte mekanisme for PTBP1 nedregulering. Denne konklusion understøttes af den iagttagelse, at proteasominhibitor MG132 lettes, og ikke hæmmes, H

2-induceret fald i PTBP1 protein (fig. 3A, B). Fordi PTBP1 nedbrydning ikke krævede ny proteinsyntese (det blev ikke blokeret af cycloheximid behandling) vores resultater viser, at H

2 kan potentielt øge proteasomalaktivitet nedbrydning af nogle ukendte faktor er ansvarlig for PTBP1 stabilisering. I betragtning af, at H

2 eksponering er kendt for at inducere apoptose [45], vi betragtes som en caspase-medieret nedbrydning af PTBP1. Tidligere undersøgelser har vist, at PTBP1 er målrettet efter Capase-3 under apoptotisk respons [33]. , Inhibitor IV undladt at forhindre H

2-medieret reduktion i PTBP1 proteinniveauer (data ikke vist). , Konkluderer således vi, at H

2O sandsynligvis inducerer

2 PTBP1 nedbrydning af en anden fra tidligere beskrevne mekanismer.

Det er også vigtigt at påpege, at PTBP1 nedbrydning ikke var begrænset til det direkte tilsætning af H

2 løsning til celler. Anvendelse af ekstracellulær glucose oxidase (GO), der katalyserer omdannelsen af glucose til H

2O, inducerede også

2 og D-glucono-δ-lacton et markant fald af PTBP1 protein i MDA468 celler (fig. 3D) .

reaktionen af H

2 med protein thioler (R-SH) og thiolat anioner (RS

-) er kendt for at generere sulfenic syrer (RSOH) ændringer og fremme disulfid bindingsdannelse. Disse proteiner blev impliceret i en lang række forskellige biokemiske effekter medierer ROS signalering [34], [46]. Interessant dimerisering af PTBP1 molekyler via intermolekylær Cys bro-dannelse blev tidligere observeret i oxidative betingelser [35]. Vi udforsket muligheden for, at nedregulering af PTBP1 protein ved H

2 medieres af thiol oxidation. Faktisk uspecifik thiol oxiderende sammensatte HEDS fremkaldte et markant fald af PTBP1 niveauer, der ligner en direkte H

2 eksponering (fig. 3D). Således kan dimerisering gennem cystein oxidation målrette PTBP1 protein til efterfølgende nedbrydning. Afgrænsning af en nøjagtig mekanisme ansvarlig for selektiv ROS-induceret nedbrydning af denne vigtige regulator kan tilbyde yderligere vigtige indsigter i cellulær oxidativ reaktion

Tidligere har PTBP1 udtryk blevet korreleret med stigninger i proliferation og metastatisk potentiale af kræftceller.;

Kronisk sygdom

PLoS ONE: Hydrogenperoxid Alters Splejsning af opløselig guanylylcyclase og selektivt Modulerer Angivelse af Splejsning Tilsynsmyndigheder inden humane cancerceller

Be the first to comment

Leave a Reply Annuller svar