PLoS ONE: fusogene-Oligoarginine peptid-medieret Levering siRNA’er Målretning af CIP2A Oncogene i Oral Cancer Cells

Abstrakt

På trods af en bedre forståelse af patogenesen af ​​oral cancer, dens udfald behandling forbliver fattige. Således er der et behov for nye terapeutiske strategier til at forbedre prognosen for denne sygdom. RNA-interferens (RNAi) synes at være en lovende terapeutisk værktøj til behandlingen af ​​mange sygdomme, herunder oral cancer. Imidlertid har en hindring for RNAi-medieret terapier været levering, især opbevaring af små interfererende RNA (siRNA) i endosomer og deres efterfølgende nedbrydning i lysosomer, hvilket resulterer i ineffektiv gendæmpning. Således er den aktuelle undersøgelse undersøgt muligheden af ​​at designe og udnytte et peptid, betegnet 599, der består af et syntetisk influenzavirus-afledte endosom-forstyrrende fusogent peptidsekvens og en strækning af kationisk cellepenetrerende nona (D-arginin) -rester, at levere siRNA’er i orale cancerceller og inducerer silencing af det terapeutiske mål, CIP2A, en onkoprotein overudtrykt i forskellige humane maligniteter indbefatter oral cancer. Forøgelse af 599 peptid-til-siRNA molforhold demonstrerede en højere bindingskapacitet for siRNA-molekyler og forbedret siRNA levering ind i cytoplasmaet af orale cancerceller. Faktisk kvantitative målinger af siRNA levering til celler viste, at en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold kunne levere 18 gange højere mængder af siRNAs sammenlignet med celler behandlet med siRNA alene uden væsentlige langsigtede cytotoksiske virkninger. Vigtigst, 599 peptidmedierede siRNA levering fremmes signifikant CIP2A mRNA og protein silencing som resulterede i nedsat oral cancer celle invasionsevne og forankringsuafhængig vækst. Sammen viser disse data, at et kimært peptid bestående af en fusogent sekvens, i kombination med celle-penetrerende rester, kan anvendes til effektivt at levere siRNA’er i orale cancerceller og inducere undertrykkelse af dets målgen, potentielt tilbyde en ny terapeutisk strategi i bekæmpelse oral cancer

Henvisning:. Cantini L, Attaway CC, Butler B, Andino LM, Sokolosky ML, Jakymiw A (2013) fusogene-Oligoarginine peptid-medieret Levering siRNA’er målretning af CIP2A Oncogene i oral cancer Cells. PLoS ONE 8 (9): e73348. doi: 10,1371 /journal.pone.0073348

Redaktør: Kin-Hang Kok, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Maj 14, 2013; Accepteret: 19 Jul 2013; Udgivet: 3. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Cantini et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIDCR og NCRR giver R00DE018191 (AJ) og P20RR017696 hhv. Dette arbejde blev også finansieret af Bankhead-Coley Florida Cancer Research Program tilskud 08BN-02 (AJ). Teknisk støtte fra Clemson Light Imaging Facility blev muliggjort af National Science Foundation Award # 1126407 og en Clemson University Core Facility tilskud til Terri F. Bruce. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det anslås, at omkring 40.000 nye tilfælde og ca. 8.000 dødsfald relateret til kræft i mundhule og svælg vil forekomme hvert år i USA i 2012 [1]. Mundhulen kræft er i øjeblikket rangeret som den 6. mest udbredte kræft globalt, med planocellulært karcinom i mundslimhinden er den mest almindelige type (-90%) [2], [3]. Trods enorme mængder af forskning og fremskridt inden for onkologi og kirurgi har 5-årige overlevelsesrate for kræft i mundhulen kun beskedent forbedret i de sidste 30 år, og dens prognose er stadig dårligere i forhold til bryst-, tyktarms-, eller prostatakræft [1] . Derfor er behov for nye terapeutiske strategier for at forbedre resultatet af denne sygdom.

RNA-interferens (RNAi) er et højt konserveret posttranskriptionel gen reguleringsmekanisme udløst af små, ikke-kodende dobbeltstrengede RNA-molekyler, der kan specifikt tavshed genekspression ved enten at undertrykke oversættelse og /eller fremkalde mRNA nedbrydning [4], [5]. Korte dobbeltstrengede RNA-molekyler, kendt som lille interfererende RNA (siRNA) er funktionelle molekyler, i association med den RNA-inducerede silencing kompleks (RISC) medierer sekvens-specifik mRNA target udvælgelse og spaltning [6], [7], [8 ], [9]. Opdagelsen, at indførelsen af ​​kemisk syntetiserede siRNA’er i pattedyrceller effektivt kunne inducere sekvensspecifik inhibering af genekspression [6], gjort klart terapeutiske potentiale udnytte RNAi som et middel til specifikt at målrette og stilhed sygdomsfremkaldende gener. Efterfølgende prækliniske forsøg i dyr og nyere kliniske forsøg har yderligere valideret siRNA’er som potente inhibitorer af et sortiment af sygdomsfremkaldende gener og som en lovende ny klasse af lægemidler [8], [10], [11].

Selv om udformningen af ​​terapeutiske-grade siRNA’er er forbedret [8], [10], levering stadig den største enkeltstående hindring mod den omsiggribende brug af siRNA’er for terapeutiske anvendelser [8]. Fordi terapeutiske makromolekyler leveres som regel gennem endocytose [12], en af ​​de vigtigste begrænsende trin for mange leveringsmetoder, herunder siRNA levering, er endosomale indfangning og efterfølgende nedbrydning af det terapeutiske last i lysosomer [11], [12], [13] . Således, for at øge intracellulære biotilgængelighed af siRNA’er, effektive strategier for endosomal flugt er nødvendige.

For at transportere det virale genom ind i cytoplasmaet, animalske vira, der er internaliseret via receptormedieret endocytose, udnytte proteiner med endosom-forstyrrende fusionspeptid domænesekvenser at mediere destabilisering af værtscellen endosomale membran [14]. Den metode, der disse virale proteiner destabilisere endosomale membraner forekommer i en forsuring-afhængig måde og er blevet efterlignet af syntetiske peptider, betegnes fusogene peptider [15], [16]. Især flere syntetiske fusogene peptider baseret på den N-terminale fusion domæne af HA2 subunit af influenzavirus hæmagglutinin-protein har vist sig at være effektiv til at påvirke genoverførsel [15]. Blandt disse fusogene peptider, både INF-7 peptid og dens dimer form diINF-7, har vist deres endosomet forstyrrende kapacitet ved at forbedre ikke-virale gen overførselssystemer og forbedre både den cytosoliske levering af immunoliposom-indfanget makromolekyler og lipofectamin-medieret siRNA- induceret gen silencing [15], [16], [17]. Endvidere co-inkubering af kimære peptider bestående af HA2 endosom-forstyrrende peptid fusioneret til celle-penetrerende peptider (CPP; kationiske peptid vektorer, som hurtigt kan inducere deres eget cellulære internalisering gennem forskellige former for endocytose [18]), er også blevet påvist at forbedre den endosomale udslip af CPP-kompleksbundet fragt dermed fremme stærkere biologiske virkninger [12], [18], [19]. I en særlig undersøgelse blev co-inkubering af HA2-linked CPP peptider med CPP-kompleksbundet siRNAs fundet til moderat forbedre silencing af det målrettede reportergenet [20].

Selvom de ovenfor beskrevne strategier har vist forbedringer i siRNA-medieret silencing effekter, flere problemer stadig at kunne begrænse effektiviteten af ​​fusogene peptid-medieret cytosol-levering af siRNA’er. For det første fordi de fusogene eller HA2-kimære peptider ikke var kompleksbundet til siRNA’er denne fremgangsmåde ikke garantere, at peptiderne ville co-lokalisere inden for de samme endocytiske vesikler som siRNA fragt [12]. Co-lokalisering er påkrævet for at frigive siRNA-molekyler fra den endocytiske vesikel [12]. For det andet, på grund af denne mangel på interaktion mellem peptiderne og siRNA’er, er det muligt at peptiderne kunne undslippe endosomerne uden alvorligt at forstyrre den endosomale membraner, i sidste ende forlader siRNA fragt indesluttet i vesiklen [12]. Således at omgå disse problemer, denne undersøgelse havde til formål at designe et kimært peptid bestående af en fusogent sekvens knyttet til en CPP, der ville muliggøre stabil binding med siRNA’er via elektrostatiske vekselvirkninger og fremme deres intracellulære levering og endosomale flugt, for at inducere den terapeutiske silencing af en målrettet onkogen i orale cancerceller. Fordi INF-7-peptid er en mere potent membran-destabiliserende peptid sammenlignet med forælder HA2-peptid og kationisk nona (D-arginin) peptider er meget effektive CPP’er stand til forøget celleoptagelse [12], [21], samt levering af siRNA’er til tumorer og hjernen på mus [22], [23], designede vi et kimært peptid, betegnet 599, der ville udnytte begge disse egenskaber inden for et enkelt molekyle til direkte kompleks til og forbedre den intracellulære biotilgængelighed af siRNA’er. Her vil vi vise, at 599 peptid effektivt leverer siRNAs designet til at målrette CIP2A, en oncoprotein overudtrykt i menneskelige hoved og hals pladecellecarcinomer (HNSCCs), herunder mundtlige planocellulært karcinom (OSCCs) [24], [25], [26] , i orale kræftceller, formidler effektiv CIP2A lyddæmpning, og dermed hæmmer kræft i mundhulen celle invasionsevne og forankringsuafhængig vækst.

Resultater

Den 599 Peptide effektivt binder og leverer siRNA’er i oral cancer Cells

for at teste, om 599-peptidet via sin kationisk nona (D-arginin) -rester effektivt kunne binde negativt ladede siRNAs baseret på elektrostatiske vekselvirkninger, blev en agarosegel ændring-assay udført (fig. 1). Ved hjælp af forskellige mængder af det 599-peptid, der spænder fra 1 til 50 gange molært overskud af siRNA’er blev det påvist, at 599-peptidet faktisk kunne binde siRNA-molekyler designet til at målrette CIP2A (siCIP2A) ved at forsinke den siCIP2A begyndende ved et peptid-til- siRNA molær (P: N) forhold på 20:01, med nogen frie siRNA’er påviselige i gelen ved 50:1. Ved P: N-forhold på 10:01, peptidet havde kun moderate virkninger på siRNA binding, og ved 01:01 var fuldstændig ineffektiv

En ethidiumbromidfarvet 4% agarose gelforskydningsassay undersøgelse af evnen af. forskellige mængder af 599 peptid (fra 1 til 50 gange molært overskud af siRNA’er) for at danne komplekser med siCIP2A. siCIP2A, siRNA rettet mod CIP2A onkogen; MWM, molekylvægtmarkør (antallet af basepar for hvert DNA-fragment er vist)

Ved at påvise, at 599 peptid kunne binde til siRNA’er på specifik P:. N nøgletal næste undersøgt muligheden af peptidet til at levere fluorescens-mærkede siRNA’er i orale cancerceller ved fluorescensmikroskopi analyse (fig. 2A). Brug af en fluorescens-mærket siRNA, DY547 konjugeret til siCIP2A (D-siCIP2A), i kompleks med stigende mængder af 599 peptid, der spænder fra 1 til 50 gange molært overskud af siRNA’er blev det observeret, at forøgelse af P: N-forhold forbedret levering af siRNA molekyler til CAL 27 orale cancerceller efter to timers inkubation. Mere specifikt 50:1 P: N-forhold påvist at have en øget evne til at inducere siRNA optagelse i celler sammenlignet med 20:01 P: N-forhold, som kun havde en moderat effekt. Omvendt celler behandlet med D-siCIP2A alene eller i kompleks med 599 peptid i en 01:01 P: N-forhold var ude af stand til effektiv siRNA-optagelse. Kvantitative målinger af internaliseret D-siCIP2A til CAL 27 celler efter 2,5 timers inkubation bekræftede også at en forøgelse af 599 P: N-forhold steg siRNA optagelse i celler. Især 50:1 og 100:1 P: N-forhold leveret ca. 18 og 42 gange signifikant højere mængder af D-siCIP2A, sammenlignet med celler behandlet med D-siCIP2A alene (figur 2B.). Til sammenligning det kommercielle transfektion agent INTERFERin ™ (IFN) kun leveret ca. 2 gange højere mængder af D-siCIP2A, sammenlignet med celler behandlet med D-siCIP2A alene. Notatet selvom 100:1 P: N-forhold var i stand til at levere det højeste beløb af siRNA’er i celler, det inducerede væsentlige langsigtede cytotoksiske virkninger som målt ved hjælp af en ikke-targeting siRNA (Sint) kontrol (Fig 2C.) . Især 100:1 P: N-forhold signifikant reducerede proliferation af celler 48 timer efter behandling sammenlignet med ubehandlede celler. Omvendt 50:1 P: N-forhold ikke havde nogen væsentlig indvirkning på langfristet cytotoksicitet. Som et resultat, baseret på disse resultater den 50:1 P:. N-forhold blev anvendt til yderligere karakterisering og eksperimenter

(A) Fluorescensmikroskopi analyse af CAL 27 orale cancerceller inkuberet i 2 timer med DY547-konjugeret siRNA targeting CIP2A (D-siCIP2A, rød) alene eller i kompleks med stigende mængder af 599 peptid (fra 1 til 50 gange molært overskud af siRNAs). Kerner (blå) blev modfarvet med DAPI. Scale bar: 50 pm. (B) CAL 27 celler inkuberet i 2,5 timer med D-siCIP2A alene eller i kompleks med stigende mængder af 599 peptid (fra 1 til 100 gange molært overskud af siRNAs). Til sammenligning blev cellerne også transficeret under anvendelse af kommercielle transfektionsreagens, INTERFERin ™ (IFN). Mængden af ​​siRNA leveret i celler i pmol per mg protein rapporteres med hver behandling normaliseret til D-siCIP2A alene. Data er gennemsnit ± SEM af fire separate forsøg, hvor *** P 0,001, ** P 0,01 sammenlignet med D-siCIP2A alene behandlede celler (ANOVA, Dunnetts multiple sammenligningstest). (C) Vurdering af langsigtet toksicitet (målt ved en celle proliferation assay) af CAL 27 celler 48 timer efter behandling med enten en ikke-targeting siRNA (Sint) alene, stigende koncentrationer af 599 peptid alene eller stigende mængder af 599 peptid (fra 1 til 100 gange molært overskud af siRNA’er) i kompleks med sint. Til sammenligning blev cellerne også transficeret med det kommercielle transfektionsreagens, IFN. Ubehandlede celler blev defineret som 100% levedygtige. Data er gennemsnit ± SEM udført tredobbelt (n = 3), hvor *** P 0,001, ** P. 0,01 sammenlignet med ubehandlede celler (ANOVA, Dunnetts multiple sammenligningstest)

Karakterisering af 599 peptid-siRNA Complex

for at få indsigt i mekanismen for celleindtastning af 599 /siRNA-komplekset, blev den subcellulære lokalisering af 599 /D-siCIP2A komplekset yderligere undersøgt i levende celler ved fluorescens mikroskopi koblede med fase kontrast (fig. 3A). Ved nærmere eftersyn af den internaliserede D-siCIP2As, dukkede det baseret på den omfattende punktformet optagelse mønster siRNA’er at 599 /D-siCIP2A komplekset blev endocytose. Co-farvning af fikserede celler med den tidlige endosomale markør EEA1 bekræftede colokalisering af D-siCIP2As med endosomale vesikler (fig. 3B), hvilket således indikerer en endocytisk internalisering tilstand.

(A) Fluorescensmikroskopi analyse og overlay af en fase kontrast billede af levende CAL 27 orale cancerceller inkuberet i 2 timer med DY547-konjugeret siRNA rettet mod CIP2A (D-siCIP2A; rød) kompleksbundet med 599 peptid ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold. Scale bar: 50 pm. (B) Indirekte immunofluorescens-mikroskopi-analyse af CAL 27 orale cancerceller inkuberet i 2 timer med D-siCIP2A (rød) kompleksbundet med 599 peptid ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold. Endosomer (grøn) blev farvet under anvendelse af et kanin-monoklonalt anti-EEA1 antistof. Kerner (blå) blev modfarvet med DAPI. Den co-lokalisering af D-siCIP2A med endosomer (gul) er observeret i det fusionerede panel og understreges af pile. Scale bar: 25 pm

For at vurdere 599 peptid i form af partikelstørrelse og overflade opladning efter kompleksdannelse med siCIP2A både dynamisk lysspredning og zeta potentielle målinger blev udført. (Figur 4A.). Ud fra målingerne blev 96% af de dannede partikler centreret ved 74 nm og 4% ved 220 nm efter antal-vægtede størrelsesfordeling, med den gennemsnitlige partikelstørrelse af den større population er 80 ± 0,5 nm. Zetapotentialet af 599 /siCIP2A kompleks blev bestemt til at være positive med en værdi på 32,5 ± 0,5 mV. 599 /siCIP2A kompleks blev også visualiseret under anvendelse mørkefelt-baserede optiske belysning (fig. 4B). Brug af denne billedanalyseteknologi 599 /siCIP2A komplekset viste sig at udvise temmelig ensartede, sfæriske strukturer.

(A) størrelsesfordeling og zeta-potentialet af 599 peptid komplekseret med siCIP2A ved en 50:1 peptid-til-siRNA molær forholdet 20 minutter efter formulering i vand. (B) Darkfield-baserede optisk mikroskopi billede af 599 peptid komplekseret med siCIP2A ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold 20 minutter efter formulering i vand. Målestok:. 10.000 nm

For at teste betydningen af ​​de to centrale komponenter (dvs. endosomet-forstyrrende og kationiske celle-gennemtrængende Nona (D-arginin) dele restkoncentrationer) i giver evne til 599 peptid til at levere siRNAs ind i celler, blev to yderligere peptider syntetiseredes bestående af enten endosomet-forstyrrende sekvens (616) eller det kationiske celle-penetrerende nona (D-arginin) rester alene (9R). Ved behandling af CAL 27 celler med enten 599, 616 eller 9R peptider i kompleks med D-siCIP2A på en 50:1 P: N-forhold, analyser fluorescensmikroskopi viste, at kun den intakte 599 peptid med både endosomet-forstyrrende og kationiske celle-penetrerende nona (D-arginin) portioner restkoncentrationer kunne mediere afgivelse af siRNA’er i celler, hvorimod både 616 og 9R peptider havde ingen tilsyneladende virkning på siRNA levering 2 timer efter behandling (fig. 5).

fluorescens mikroskopi analyser af CAL 27 orale cancerceller inkuberet i 2 timer med DY547-konjugeret siRNA rettet mod CIP2A (D-siCIP2A; rød) kompleksbundet til peptider 599, 616, og 9R ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold. Kerner (blå) blev modfarvet med DAPI. Målestok: 50 pm

Den manglende af 616 peptid at levere siRNA’er i celler var mest sandsynligt på grund af sin manglende evne til at binde siRNA’er selv ved P:. N-forhold så højt som 100:1 (data ikke vist). Men resultatet med 9R peptidet var noget overraskende, da det blev påvist til effektivt at binde siRNA’er på en 50:1 P: N-forhold baseret på en agarosegel shift assay (. Fig S1A) og kunne danne partikler med en gennemsnitlig størrelse på 58,2 ± 0,2 nm og en zeta potentiel værdi på 25,8 ± 0,5 mV (fig. S1B). Fordi paraformaldehydfiksering af celler kan resultere i kunstig omfordeling af (Arg)

9 peptider [27], var det muligt, at den cellulære fordeling af 9R /D-siCIP2A komplekset kan være blevet påvirket af denne kemiske fiksativ. Derfor blev optagelsen af ​​D-siCIP2A også vurderet ved hjælp af fiksering-uafhængig kvantitativ tilgang, som ligeledes konstateret, at 9R peptidet, i området fra 0,1 til 100 gange molært overskud af siRNA’er, var ude af stand til at mediere siRNA levering til celler og kunne skelnes fra celler behandlet med D-siCIP2A alene (fig. S1c).

den 599 Peptide formidler CIP2A Gene Silencing i Oral Cancer Cells

for 599 peptid, der skal betragtes som et effektivt levering køretøj for siRNA- baserede lægemidler, skal det være i stand til at levere funktionelle siRNA’er i celler, der kan slå deres tilsigtede gen mål. For at vurdere funktionaliteten af ​​599 /siRNA kompleks, to mundtlige kræft cellelinjer, CAL 27 og SCC-25, blev behandlet med den 599 peptid kompleks til enten siCIP2A eller et Sint kontrol ved en 50:1 P: N-forhold, hvorefter både CIP2A mRNA og protein niveauer blev bedømt 48 timer efter behandling af real-time PCR og Western blot-analyser, hhv. Kvantificering af real-time PCR viste en signifikant knockdown i CIP2A mRNA-niveauer i både orale cancercellelinier behandlet med 599 /siCIP2A komplekset sammenlignet med kontrol 599 /Sint behandlede celler (fig. 6A). Mere specifikt blev en reduktion i CIP2A mRNA niveauer -60% og -85% observeret i CAL 27 og SCC-25 orale cancercellelinier hhv. Desuden har undersøgelser Western blot bekræftede evnen af ​​599 peptid at mediere levering af funktionelle siRNA’er i begge cellelinier ved at demonstrere undertrykkelsen af ​​CIP2A proteinniveauer 48 timer efter behandling med 599 /siCIP2A komplekset sammenlignet med kontrol 599 /Sint behandlede celler ( fig. 6B). Af note blev proteinniveauer af den onkogene transkriptionsfaktor c-Myc også vurderet fordi CIP2A er kendt for at regulere stabilitet af dette protein [25]. Western blot-analyser bekræftede, at silencing af CIP2A forårsagede destabilisering af c-myc i begge cellelinier (fig. 6B).

(A) Real-time PCR-analyse af CIP2A mRNA-niveauer i CAL 27 og SCC-25 oral cancerceller 48 timer efter behandling med 599 peptid komplekseret til en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold til 100 nM siRNA targeting CIP2A (siCIP2A) sammenlignet med kontrol ikke-targeting siRNA (Sint). De CIP2A mRNA niveauer blev normaliseret til 18S rRNA. Data er gennemsnit ± SEM af tre separate forsøg udført tredobbelt, hvor ** P 0,01 sammenlignet med sint behandlede celler (Students t test). (B) Western blot-analyser af CIP2A og c-myc-protein ekspressionsniveauer i CAL 27 og SCC-25 orale cancerceller 48 timer efter behandling med 599 peptid komplekseret til enten 100 nM for Sint eller siCIP2A ved en 50:1 peptid-til -siRNA molforhold. GAPDH protein niveauer blev overvåget for at sikre lige belastning af prøver.

Karakterisering af 599 /siCIP2A Complex-medieret RNAi respons

I et forsøg på yderligere at karakterisere 599 peptid-medieret lyddæmpning af CIP2A i orale cancerceller varigheden af ​​gendæmpning, dosisafhængig gendæmpning, og aktiviteten af ​​silencing i serum blev også vurderet. Den vellykkede gennemførelse af RNAi som en form for terapi er afhængig af disse tre vigtigste funktioner. Således i et forsøg på at bestemme den vedvarende 599 peptid-medieret inaktivering af CIP2A i orale cancerceller over tid, en Western blot-analyser af CIP2A proteinekspressionsniveauer i CAL 27 og SCC-25 orale cancerceller 1, 3, 5, 7 og 9 dage efter behandling med 599 peptid komplekseret til enten Sint eller siCIP2A ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold blev udført (fig. 7A). Efter en enkelt behandling med 599 /siCIP2A blev silencing effekt observeret at vare i 5 dage i CAL-27-celler og op til 9 dage i SCC-25-celler med maksimal lyddæmpning forekommende i 3 og 7 dage. I dosis-respons eksperimenter i SCC-25 celler (fig. 7B), blev 599 peptid observeret at give siCIP2A medieret lyddæmpning dosisafhængigt med siRNA-koncentrationer ≥50 nM giver ~ 100% CIP2A protein knockdown og siRNA koncentrationer så lave som 20 nM stadig har målbare lyddæmpende effekt. Lignende resultater blev observeret i CAL 27 celler (data ikke vist), bortset fra at højere siRNA koncentrationer (≥80 nM) var nødvendig for at give i bedste -90% CIP2A protein silencing. Endelig fordi stabiliteten af ​​siRNA’er er et vigtigt problem i RNAi-terapi, var 599 peptid-medierede CIP2A silencing vurderes i fravær og nærvær af serum og sammenlignet med flere kommercielt tilgængelige standard kationiske lipidbaserede transfektionsreagenser (fig. 7C). Ved behandling af SCC-25 celler med 599 /siCIP2A blev ~ 95% CIP2A protein slået ned i fravær af en indledende input af serum og var sammenlignelig med CIP2A lyddæmpning observeret for alle kationiske lipid-baserede transfektion testede reagenser ( 99%) undtagen HiPerFect® som udviste kun en reduktion i proteinniveauer -30%. Af betydning, er imidlertid, at selv i nærvær af serum, kunne 599 /CIP2A komplekset stadig producere en meget effektiv RNAi respons ved -70% CIP2A protein knockdown. Kvantificering af disse data var baseret på densitometrisk analyse af tre uafhængige Western blot eksperimenter med Image J software [28].

(A) Western blot-analyser af CIP2A proteinekspressionsniveauer i CAL 27 og SCC-25 oral cancerceller 1, 3, 5, 7 og 9 dage efter behandling med 599 peptid komplekseret til enten 100 nM af kontrol ikke-targeting siRNA (Sint) eller siRNA targeting CIP2A (siCIP2A) ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold. GAPDH protein niveauer blev overvåget for at sikre lige ladning af prøver. (B) Western blot-analyse af CIP2A protein knockdown i SCC-25 orale cancerceller 48 timer efter behandling med 599 peptid alene (5 uM) eller kompleksbundet til en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold til enten Sint (100 nM ) eller faldende koncentrationer af siCIP2A. De CIP2A proteinniveauer i ubehandlede celler blev også analyseret for sammenligning. GAPDH protein niveauer blev overvåget for at sikre lige ladning af prøver. (C) Western blot-analyser af CIP2A protein Knockdown i SCC-25 orale cancerceller 48 timer efter behandling med 599 peptid kompleks med enten 100 nM for Sint eller siCIP2A ved en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold, i nærvær (+) eller fravær (-) af serum, sammenlignet med ubehandlede celler eller celler behandlet med kommercielle transfektionsreagenser Lipofectamine® RNAiMAX (RNAiMAX), Lipofectamine® 2000 (LF2000), INTERFERin ™ (IFN), og HiPerFect®. GAPDH protein niveauer blev overvåget for at sikre lige belastning af prøver.

Den 599 peptid-medieret Silencing af CIP2A Reducerer Oral Cancer Cell invasiv og Anchorage-Uafhængig vækst

Tidligere offentliggjort litteratur har vist at CIP2A silencing i cancerceller afledt fra forskellige væv, såsom HNSCCs, nyrecellecarcinomer og brystcancer kan påvirke cancercelleinvasion og forankringsuafhængig vækst [25], [29], [30]. Således yderligere at påvise den potentielle nytte af den 599-peptidet i siRNA-baserede terapeutiske midler til oral cancer, testede vi, om 599 peptid-medieret inaktivering af CIP2A kan påvirke invasionsevne og forankringsuafhængige vækstegenskaber af orale cancerceller. På grund af det faktum, at CAL 27 celler udviste kun en kort silencing effekt og vokser ikke godt i halvfast medium [31], 599 peptid-medierede CIP2A silencing virkninger på celleinvasion og forankringsuafhængig vækst blev kun afprøvet i SCC- 25 celler. Ved behandling af SCC-25 celler med 599 peptid komplekseret til siCIP2A observerede vi en signifikant ~33% inhibering i celle invasionsevne, sammenlignet med kontrol 599 /Sint behandlede celler (Fig. 8A). Desuden 599 peptid-medieret inaktivering af CIP2A i SCC-25 celler reducerede signifikant forankringsuafhængig vækst ved ~39% sammenlignet med kontrol 599 /Sint behandlede celler (fig. 8B). Tilsammen viste disse resultater evnen af ​​599 peptid kan fungere som en effektiv leveringsvehikel for siRNA-baserede orale kræftbehandling.

(A) Kvantificering af den procentdel af invaderende SCC-25 orale cancerceller efter behandling med 599 peptid komplekseret til en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold til 100 nM siRNA targeting CIP2A (siCIP2A) sammenlignet med kontrol ikke-targeting siRNA (Sint). Data er gennemsnit ± SEM af fire separate forsøg, hvor * P 0,05 sammenlignet med sint behandlede celler (Students t test). (B) forankringsuafhængig vækst af SCC-25 orale cancerceller efter behandling med 599 peptid komplekseret til en 50:1 peptid-til-siRNA molforhold til 100 nM siCIP2A sammenlignet med kontrol sint. Dataene er gennemsnit ± SEM af fire separate eksperimenter, hvor * P. 0,05 sammenlignet på Sint behandlede celler (Students t test)

Diskussion

For RNAi-baserede teknologier til at være effektiv terapier, de kræver en effektiv intracellulær afgivelse af terapeutiske siRNA’er ind i cytoplasmaet af celler. Men fordi de fleste leveringsmetoder trafik siRNA fragt i celler via endocytose, har indfangning af disse molekyler inden for de endocytiske vesikler blevet et stort begrænsende trin [11], [12] og dermed en barriere mod en effektiv anvendelse af RNAi-baserede terapier. For at omgå dette problem, vi udviklet og testet et peptid, betegnet 599, der bestod dels sekvenserne af både meget effektiv CPP og endosomet-destabilisere INF-7 peptid, som, når de kombineres vil muliggøre effektiv levering af kompleks siRNA lasten i celler. Resultater fra vores undersøgelse viste, at 599-peptidet kunne øge den intracellulære biotilgængelighed af siRNAs i orale kræftceller og effektivt mægle undertrykkelse af den målrettede CIP2A oncoprotein med deraf følgende hæmning af oral cancer celle invasionsevne og forankringsuafhængig vækst.

fordi kovalent konjugation af siRNA’er til CPP kan resultere i ineffektiv levering af funktionelle siRNA’er til celler [18], [32], [33], den 599 peptidet blev designet til at omfatte kationisk nona (D-arginin) rester, ville fungere ikke blot som CPP komponent, men også gøre det muligt ikke-kovalent binding af negativt ladede siRNA-molekyler til peptidet via ladede interaktioner. Agarose gel skift assays bekræftede, at 599-peptidet kunne kompliceret at siRNA-molekyler, og at bindingen mellem 599 peptid og siRNA’er syntes at være afhængig af nona (D-arginin) rester. Dette var særlig tydeligt baseret på det faktum, at 616-peptidet, som kun omfattede stærkt anioniske INF-7 peptidsekvensen, ikke kunne binde siRNA’er.

undersøgelse af, om 599 peptid-siRNA kompleksdannelse var tilstrækkelig til at inducere internaliseringen af ​​siRNA’er i celler, afslørede, at forøgelse af P: N-forhold vil medføre øget siRNA optagelse i celler efter to timers behandling sammenlignet med celler behandlet med INTERFERin ™ eller nøgen siRNA. Disse fund var i overensstemmelse med adskillige andre undersøgelser, der ligeledes fundet, at forøgelse af koncentrationen af ​​specifikke CPP’er øget deres siRNA optagelse evne [20], [23]. Den øgede optag af siRNA’er i celler sandsynligvis opstået ved højere P: N-forhold baseret på flere faktorer. For det første fordi den højere P: N-forhold var mere effektive til at binde frie siRNAs i opløsning, som var tydeligt gennem agarose gel skift assays dette in-part ville have bidraget til større mængder af siRNA’er bliver internaliseret i celler. For det andet, fordi behandling af celler med høje ekstracellulære koncentrationer af CPP er blevet rapporteret at inducere deres internalisering i celler via aktivering af endocytose [34], den forøgede optagelse af siRNA’er i celler ved højere P: N-forhold kan er også blevet tilskrevet tilstedeværelsen af højere mængder af den 599-peptid, som mere effektivt ville udløse endocytose af komplekset.

CPP-medieret internalisering i celler er drevet af kationiske rester fundet inden for deres sekvens og denne proces er blevet rapporteret at forekomme gennem forskellige former for endocytose [18]. I vores undersøgelse blev 599 peptid observeret at mediere internalisering af siRNA’er inden for de første to timer til endocytiske vesikler og fjernelse af nona (D-argininer) fra 599 peptid, som repræsenteret ved 616 peptidet, bekræftet kravet om kationiske rester til levering af siRNA gods. Overraskende, den 9R peptid, som kun bestod af kationisk nona (D-arginin) rester var ligeledes ude af stand til at levere siRNA’er i celler, selv om den kunne danne komplekser med siRNA’er.