PLoS ONE: Identifikation af Novel dereguleret RNA Metabolisme gener i ikke-småcellet lungekræft

Abstrakte

Lungekræft er en førende årsag til kræft død på verdensplan. Adskillige ændringer i RNA-metabolisme er blevet fundet i lungecancerceller; dette tyder på, at RNA-metabolisme-relateret molekyler er involveret i udviklingen af ​​denne patologi. I denne undersøgelse har vi søgt efter RNA metabolisme gener, som udviser forskellige ekspressionsniveauer mellem normale og tumor lungevæv. Vi identificerede otte gener udtrykkes forskelligt i lunge adenocarcinom microarray datasæt. Af disse syv opreguleret henviser on blev nedreguleret. Interessant er de fleste af disse gener ikke tidligere har været forbundet med lungekræft. Disse gener spiller forskellige roller i mRNA metabolisme: tre er forbundet med spliceosome (ASCL3L1, SNRPB og SNRPE), mens andre deltager i RNA-relaterede processer såsom oversættelse (MARS og MRPL3), mRNA stabilitet (PCBPC1), mRNA transport (RAE ), eller mRNA redigering (ADAR2, også kendt som ADARB1). Endvidere fandt vi en høj forekomst af tab af heterozygositet på kromosom 21q22.3, hvor ADAR2 locus er beliggende, i NSCLC-cellelinjer og primære væv, hvilket antyder, at nedregulering af ADAR2 i lungekræft er forbundet med specifikke genetiske tab. Endelig i en serie af adenocarcinom patienter udtryk for fem af de deregulerede gener (ADAR2, MARS, RAE, SNRPB og SNRPE) korreleret med prognose. Tilsammen disse resultater understøtter den hypotese, at ændringer i RNA stofskifte er involveret i patogenesen af ​​lungekræft, og identificere nye potentielle mål for behandlingen af ​​denne sygdom

Henvisning:. Valles I, Pajares MJ, Segura V , Guruceaga E, Gomez-romerske J, Blanco D, et al. (2012) Identifikation af Novel dereguleret RNA Metabolisme gener i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (8): e42086. doi: 10,1371 /journal.pone.0042086

Redaktør: Stefan Maas, Lehigh University, USA

Modtaget: Marts 8, 2012; Accepteret: 2 jul 2012; Udgivet: 2 August, 2012

Copyright: © Valles et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet af “UTE projekt CIMA”; Spanske regering (ISCIII452RTICC RD06 /0020/0066, PI02 /1116 og PI10 /00166), Den Europæiske Fond for Regional Udvikling (EFRU) “Una manera de hacer Europa”. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige menneskelige kræftformer og en førende årsag til kræft død på verdensplan [1], [2]. Det omfatter to væsentlige histologiske undertyper, småcellet lungekræft (SCLC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), og sidstnævnte udgør 80-85% af alle tilfælde. Lungekræft er ofte opdages på et fremskredent stadium, på hvilket tidspunkt sygdommen er næsten uhelbredelig. Yderligere karakterisering af de biologiske ændringer, der er forbundet med dens patogenese potentielt kunne hjælpe med at identificere nye biomarkører for tidlig diagnose og nye mål for mere effektive behandlingsformer.

Alternativ splejsning er en biologisk proces afgørende for protein mangfoldighed. Gennem alternativ splejsning, multiple transkripter dannet fra et enkelt mRNA precursor. Ændringer i alternativ splejsning har vist sig at være associeret med forskellige sygdomme, herunder cancer. Adskillige alternativt splejsede genprodukter har været knyttet til udviklingen af ​​neoplastisk sygdom [3]. Kræft-associeret splice varianter kan potentielt tjene som diagnostiske og prognostiske værktøjer samt terapeutiske mål i kræft [4]. I lungekræft, har mange splejsning ændringer blevet beskrevet tidligere i cancer-relaterede processer såsom cellevækst, cellecykluskontrol, apoptose, eller angiogenese [5] – [9]. For eksempel har høje niveauer af det anti-apoptotiske variant Bd-XL blevet rapporteret at bidrage til tumorudvikling i både SCLC og NSCLC [10], [11]. For nylig blev splejsning ændringer, der er ramt udskrifter af VEGFA, MACF1, APP, og NUMB påvist hos patienter med lunge adenocarcinom [9]. Endvidere blev ekspressionen af ​​en specifik isoform af NUMB i tumorprøver vist sig at fremme celleproliferation [9]. Desuden blev modulering af caspase 9 alternativ splejsning påvistes at påvirke følsomheden af ​​NSCLC-celler til nogle kemoterapeutiske midler [12].

Mekanismerne bag uregelmæssig alternativ splejsning i lungekræft stadig dårligt forstået. I nogle tilfælde mutationer i splejsning regulatoriske elementer inden nukleotidsekvensen af ​​genet medfører ændringer i splejsningssted udvælgelse, til gengæld fører til alternativt splejsede transkripter [13]. I andre tilfælde, ændringer i proteiner relateret til mRNA-metabolisme er ansvarlige for de abnorme splejsemønstre. Nogle undersøgelser har rapporteret ændringer i koncentrationen, lokalisering, sammensætning eller aktivitet af flere RNA-bindende proteiner i lungecancer [14] – [19], hvilket antyder, at denne vej ofte ændres og er vigtig for malign transformation. Det RNA-bindende protein SF2 /ASF overudtrykkes i NSCLC-tumorer og fremmer overlevelse ved at forbedre survivin ekspression [18]. Studier i dyremodeller tyder på, at ændre balancen mellem forskellige RNA-bindende proteiner bidrager til lunge carcinogenese [20], [21]. Imidlertid karakterisering af repertoiret af RNA metabolisme-relateret molekyler involveret i lungekræft øjeblikket ufuldstændig, og yderligere undersøgelser er berettiget.

I denne undersøgelse var det et mål at identificere nye RNA stofskifte-relaterede gener med ændret ekspression i primære lungetumorer. Brug lunge adenocarcinom microarray datasæt, vi søgte efter gener, der udviser signifikant forskellige udtryk niveauer mellem normale og tumor lungevæv. Vi identificerede syv mRNA metabolisme-relaterede proteiner opreguleret i tumorvæv og en ned-reguleret. Nogle af de overudtrykte gener tilhører familien af ​​spliceosomal proteiner, implicerer dette cellulære maskineri i udviklingen af ​​NSCLC. Den nedreguleret gen ADAR2 lå i et område med en høj frekvens af deletioner i NSCLC. Derudover blev ekspressionen af ​​fem af disse gener forbundet med prognosen for patienter med lunge-adenocarcinom, understøtter betydningen af ​​RNA-metabolisme i lungekræft biologi.

Resultater Salg

Gene Valg efter Bioinformatik Analyse

Gener tilhører RNA stofskifte-relaterede kategorier blev udvalgt fra Gene ontologi database (www.godatabase.org). Tre store RNA stofskifte-relaterede kategorier blev valgt: “RNA-bindende”, “RNA splejsning”, og “spliceosome kompleks”. Fold-change (FC) af genekspressionsniveauer mellem normal og adenocarcinom lungevæv blev beregnet ved hjælp af data fra tre microarray eksperimenter [22] – [24]. Et sæt af gener med mRNA ekspressionsniveauer markant forskellige mellem normale og cancer væv blev opnået fra hver af de tre microarray eksperimenter (tabel S1). Et repræsentativt eksempel er vist i figur 1A, og overlapningen mellem de forskellige lister er vist i figur 1B. Desuden har vi fundet, at disse gener differentielt blev udtrykt i pladecellecarcinom, småcellet carcinom og carcinoide tilfælde stede i datasættene (data ikke vist). For at bekræfte gyldigheden af ​​dette valg, ekstra

i silico

validering blev udført med en fjerde uafhængig kohorte af lunge adenocarcinom patienter [25], og resultaterne bekræftede resultaterne af den indledende forsøg (tabel S2).

) RNA-gener med ekspressionsniveauer signifikant forskellige (p 0,01) mellem lungeadenocarcinom prøver og normal lunge prøver (sidste 10 kolonner) i en af ​​microarray databaser anvendt i undersøgelsen [23]. Rød farve angiver højere ekspressionsniveauer, mens grøn farve indikerer lavere ekspressionsniveauerne. B) Venn-diagram, der svarer til gener med signifikante udtryk forskelle mellem normale og adenocarcinom prøver.

Angivelse af udvalgte RNA Metabolisme-relaterede gener i Lung Cancer cellelinjer og Normal Lung Primære kulturer

ekspressionsniveauer for de udvalgte gener blev evalueret ved konventionel PCR i SCLC og NSCLC cellelinjer og i primære NHBE-celler. For de fleste gener, mRNA-niveauer i lunge cancercellelinier var højere end i NHBE-celler (figur 2). Desuden mRNA niveauer var generelt højere i SCLC-cellelinier sammenlignet med NSCLC cellelinier. Dette resultat er i konkordans med tidligere observationer, hvor ekspressionsniveauerne for andre RNA-bindende proteiner blev også bestemt at være højere i SCLC sammenlignet med NSCLC [15]. I ADAR2, flere lungekræft-cellelinjer udviste lavere mRNA-niveauer i forhold til NHBE celler. Vi ekskluderede RNPS1 og SNRPC i efterfølgende analyser, fordi ekspressionsniveauerne var homogene blandt alle celletyper.

Ekspressionsniveauer blev bestemt i lungekræft-cellelinjer og normale menneskelige bronchieepithelceller (NHBE) celler. GAPDH blev anvendt som kontrol-gen. SCLC: småcellet lungekræft; ADC: adenocarcinom; SCC: planocellulært karcinom; LCC: storcellet carcinom; CT: carcinoid tumor; NC:. Negativ kontrol (vand)

For at kvantificere forskelle i ekspressionsniveauer, real time PCR for hver af de otte udvalgte gener blev udført i panelet af lungekræft cellelinier, såvel som i NHBE celler og normale primære SAECs. Denne analyse bekræftede vores tidligere resultater: udtryk for de up-regulerede gener var højere i lunge kræftceller i forhold til NHBE celler eller SAECs. I modsætning hertil ADAR2 ekspression i lungecancerceller var lavere end i NHBE celler eller SAECs (figur 3). Salg

Ekspressionsniveauer blev bestemt i lungekræft-cellelinjer og ikke-maligne lunge primære kulturer (NHBE og SAEC). HPRT blev anvendt som kontrol-gen. Søjler repræsenterer normaliseret ekspressions-forhold i forhold til gen-niveauer i NHBE-celler. Nøgletal 1 indikerer højere ekspressionsniveauer end i NHBE celler, mens nøgletal 1 betegne lavere ekspressionsniveauer

genetiske ændringer på ADAR2 Locus

Vi karakteriseret de genetiske ændringer forbundet. med ADAR2 nedregulering i lungekræft. Således evalueret vi tilstedeværelsen af ​​LOH på 21q22.3, placeringen af ​​ADAR2 locus. Vi anvendte et panel af otte heterozygote mikrosatellitter. Mikrosatellitter blev amplificeret ved PCR og analyseret under anvendelse kapillarelektroforese. Mikrosatellit heterozygoti blev oprindeligt vurderet i panelet af lungekræft cellelinier, og resultaterne er vist i figur 4. I seks cellelinier (H23, HCC827, A549, H322, H1385, og H1299), alle mikrosatellitter var homozygote. Selv om tilstedeværelsen af ​​tab af heterozygositet (LOH) er ikke endeligt afgørende på grund af den manglende matchede normal genomisk DNA, dette homozygositet er yderst usandsynligt, og antyder stærkt tab af genetisk materiale. I andre cellelinjer var resultaterne variable, og visse tilfælde foreslog lokaliserede områder af LOH (fx den mest centromerregionen i H157 celler). Dernæst vi sammenlignede homozygositet på 21q22.3 og ADAR2 mRNA-ekspressionsniveauer (tidligere opnåede). Alle cellelinier homozygote for mikrosatellitter udtrykte lave ADAR2 mRNA-niveauer. Faktisk to af de tre cellelinier med de laveste ADAR2 mRNA ekspressionsniveauer (A549 og H1385) tilhører denne gruppe. I modsætning hertil de fem cellelinier med de højeste ADAR2 ekspressionsniveauer (H82, H187, H157, H226 og H460) var hovedsagelig heterozygot for mikrosatellitter der flankerer ADAR2 locus (D21S171 og D21S1574).

homozygositet (grøn) eller heterozygoti (rød) blev bestemt i hver cellelinje. Mikrosatellitter bestilles fra den mest centromerisk til de mest telomere. ADAR2 locus ligger inden D21S171 og D21S1574.

Vi undersøgte forekomsten af ​​homozygositet på 21q22.3 i genomisk DNA fra 48 patienter med lungekræft. Evalueringen af ​​de otte mikrosatellitter i tumorvæv og matches normale væv tilladt os at præcist bestemme frekvensen af ​​LOH på dette kromosomale område. 5A illustrerer de tre alternative elektroforetiske mønstre opnået: ikke-informative tilfælde, fastholdelse af heterozygositet og LOH. Efter mikrosatellit analyse blev LOH identificeret i ca. 30-40% af tilfældene (figur 5B). LOH på 21q22.3 var signifikant højere i pladecellecarcinomer end i adenocarcinomer (25 ± 6% vs. 49 ± 7%, p = 0,003). Der blev ikke fundet forskelle i frekvensen af ​​LOH mellem trin (trin I: 37 ± 2% vs. iscenesætter II-III: 34 ± 7%, p = 0,279). At evaluere ADAR2 locus mere specifikt blev en SNP placeret i ADAR2 genet (rs1051367) analyseret. Af de tyve informative tilfælde (dvs. tilfælde heterozygote for SNP rs1051367 i normalt væv), femten (75%) var homozygot i det tilsvarende matchet tumorvæv. En sammenligning mellem resultaterne opnået ved mikrosatellit analyse og SNP-sekventering påvist overensstemmelse mellem de respektive teknikker, selv om antallet af patienter med LOH på ADAR2 SNP var højere (30-40% vs. 75%).

genomisk DNA fra primær lungekræft og deres tilsvarende normale lungevæv blev anvendt. A) Repræsentative eksempler på de elektroforetiske mønstre opnået ved mikrosatellit-analyse: en ikke-informativ tilfælde, hvor kun én amplifikation top; heterozygositet fastholdelse, med to toppe i både normale og tumorprøver; og LOH, med to toppe i den normale prøve, men kun én top i den tilsvarende tumorprøven. Pile peger på mikrosatellit-alleler. B) LOH af de angivne mikrosatellitter blev analyseret i 48 NSCLC-patienter. Mikrosatellitter bestilles fra den mest centromerisk til de mest telomere. LOH på ADAR2 locus blev analyseret ved direkte sekventering af polymorfien rs1051367 (A /G). Grønne kasser repræsenterer LOH, røde felter angiver tilbageholdelse af heterozygositet og gule kasser er ikke-informative loci.

Angivelse af RNA Metabolisme-relaterede Gener og lungekræft Klinisk Outcome

Vi undersøgte om ekspression af differentielt udtrykte RNA stofskifte-relaterede gener var forbundet med kliniske resultater hos patienter med lunge-adenocarcinom anvender en offentligt tilgængelig microarray data [26]. Patienterne blev inddelt efter høje og lave mRNA ekspressionsniveauer under anvendelse medianen som cut off point (figur 6). I tilfælde af ASCC3L1, MRPL3, og PABPC1, blev ingen sammenhæng fundet mellem mRNA-niveauer og patientforeninger kliniske resultat (data ikke vist). Høj udtryk for MARS, RAE1, SNRPB, og SNRPE var signifikant forbundet med nedsat samlet overlevelse. Høje ADAR2 mRNA niveauer blev signifikant associeret med et bedre resultat. For en kombineret analyse af de fem prognostiske gener blev patienterne opdelt i tre grupper: patienter uden deregulering hændelser, patienter med en til tre hændelser, og patienter med fire eller fem hændelser. Den samlede score på de fem gener var en stærk prognostisk markør (figur 6). Således patienter uden deregulering begivenheder udstillet meget god overlevelse. I modsætning hertil patienter med dereguleringen i fire eller fem af generne udstillet den værste overlevelse. Den Cox proportionel risiko model blev brugt til at vurdere virkningen af ​​den prognostiske score på samlet overlevelse, både univariate og multivariate analyse (tabel 1). RNA-metabolisme score var en uafhængig prognostisk faktor for samlet overlevelse hos patienter med lunge adenocarcinom.

Data blev indhentet fra en microarray undersøgelse [26]. Tal viser Kaplan-Meier-kurver og log rank statistik for overlevelsen i patienter, opdelt i høj- og lav-mRNA-ekspression (ved hjælp af medianen som cut-off point). Sidste tal svarer til patienter divideret med antallet af deregulering hændelser (se Materialer og Metoder).

Diskussion

Vi identificerede otte RNA-gener udtrykkes forskelligt i lungekræft , en konstatering, der understøtter den hypotese, at RNA-metabolisme er vigtigt i patogenesen af ​​lungekræft. Syv af de identificerede gener blev opreguleret, hvorimod kun én var nedreguleret. Interessant er de fleste af disse gener ikke tidligere var blevet rapporteret at være associeret med lungecancer. Derudover er ekspressionen af ​​de fleste af disse gener udviste en forening med total overlevelse i lungeadenocarcinom patienter, hvilket tyder på en forbindelse mellem RNA-metabolisme og lungekræft patogenese.

Tidligere rapporter har vist, at RNA-metabolisme gener er dereguleret og impliceret i malign transformation af lungeceller [14], [16], [18]. Resultaterne i vores undersøgelse identificere et nyt sæt differentielt udtrykte gener associeret med RNA-metabolisme. Det er klart, at ekspressionen af ​​mange andre RNA-gener er ændret i lungekræft. Den gruppe af gener er identificeret i vores undersøgelse var stærkt påvirket af den strenge strategi for udvælgelsen. Statistiske analyser blev restriktiv; Således blev kun de væsentligste gener valgt. Endvidere ændringer i splejsning, som er blevet rapporteret for nogle RNA-gener [17], [27], [28], kan ikke påvises ved hjælp af denne analytiske fremgangsmåde.

De fleste RNA-gener identificeret i vores undersøgelse blev opreguleret i tumorvæv. Grunden til dette er uklar; Det kan skyldes den øgede stofskifte forbundet med tumorcelleproliferation. Men det store flertal af RNA-gener udviste ingen forskelle mellem tumorvæv og normalt lungevæv. Desuden blev en relevante gen identificeret i vores undersøgelse nedreguleret (ADAR2), og mRNA-ekspression af fem af de udvalgte gener var forbundet med kliniske resultater i en serie af adenocarcinom patienter. Især blev høj ekspression af up-regulerede gener (MARS, RAE1, SNRPB, og SNRPE) forbundet med dårligere prognose, hvorimod høj ekspression af nedreguleret gen (ADAR2) korreleret med forbedret overlevelse. Interessant, gruppen af ​​patienter uden deregulering i nogen af ​​disse gener udstillet meget god overlevelse. På den anden side blev et stort antal deregulering hændelser forbundet med dårlig overlevelse. Disse resultater antyder, at aktiviteten af ​​RNA-metabolisk maskiner potentielt kan tjene som en prognostisk markør for lungekræft.

Proteiner oversat fra tre af de otte op-regulerede gener tilhører familien af ​​spliceosomal små nukleare ribonucleoproteiner ( snRNP’er): ASCC3L1, SNRPB, og SNRPE. Den spliceosome er et kompleks af snRNP’er plus et væld af associerede proteiner. Dette kompleks genkender splejsningssteder og fjerner introns fra præ-mRNA-molekyler. Der vides kun lidt om den rolle, som spliceosome i kræft spillet. For nylig, ved hjælp af hel-exome sekvensanalyse har nogle undersøgelser identificerede en høj frekvens af mutationer i forskellige komponenter af spliceosome i kronisk lymfatisk leukæmi og myelodysplasi [29] – [33], implicerer dette cellulære maskineri i udviklingen af ​​cancer [34] . Således har nogle spliceosomal inhibitorer blevet testet i cancerceller og spliceosome er blevet foreslået som et mål anti-cancer [35]. Identifikationen af ​​tre spliceosomal proteiner udtrykkes differentielt i lungekræft tyder på, at en rolle spilles af spliceosome i denne malignitet. Desværre er der lidt offentliggjorte oplysninger om den rolle, som disse særlige proteiner i kræft. ASCC3L1 (SNRNP200) koder helicase Brr2, en vigtig del af den spliceosomal snRNP U5. Så vidt vi ved, denne undersøgelse er den første til at påvise end ASCC3L1 er forbundet med malignitet. Lille nukleare ribonukleotid associeret protein B (SNRPB) er en del af snRNP U1. SNRPB er blevet rapporteret at være en metastase suppressor i en mus allograft model for prostatacancer [36]. En sjælden polymorfi i SNRPB genet er blevet forbundet med nedsat risiko for brystkræft i BRCA1 mutation luftfartsselskaber [37]. Den overekspression af små nukleare ribonukleotid associeret protein E (SNRPE) er blevet sigende forbundet med vækst anholdelse i G2 fase i både maligne og non-maligne celler [38]. Men i tråd med vores resultater, er SNRPE forstærkes og overudtrykt i maligne gliomer og mundtlige planocellulært karcinom [39], [40]. SNRPE også forstærkes og opreguleret i hepatocellulært carcinom og kan fungere som et onkogen ved at øge celledeling [41].

De andre proteiner, der var opreguleret i vores undersøgelse var MARS, MRPL3, PABPC1 og RAE . Methionin-tRNA-syntetase (MARS eller metrs) virker som en katalysator i bindingen af ​​methionin til dets tilsvarende tRNA. Øget aktivitet af dette enzym er blevet rapporteret i human coloncancer [42]. For nylig blev en induktion af MARS ekspression vist i brystcancercellelinier stimuleret med insulin-lignende vækstfaktor [43]. Rammeskift mutationer i MARS er blevet beskrevet i gastriske og colorektale carcinomer med mikrosatellit instabilitet [44]. Mitokondrielle ribosomale protein L3 (MRPL3) er en bestanddel af 39s underenheden af ​​mitokondrie ribosomet. Høj ekspression af dette protein er blevet rapporteret i leverkarcinom, coloncarcinom, og lymfom, hvilket antyder en sammenslutning af dette protein med høj celledeling satser [45]. Poly-A-bindende protein cytoplasmatisk 1 (PABPC1) deltager i poly-A afkortning ved 3 ‘enden af ​​eukaryote mRNA’er. Modstridende resultater vedrørende den rolle, som dette protein i cancer er blevet rapporteret. Et studie konkluderede, at lave niveauer af PABPC1 korreleret med mere invasive tumorer og værre overlevelsesrater for patienter med kræft i spiserøret [46]. Men i andre undersøgelser, PABPC1 overekspression blev beskrevet i prostatatumorer [47], hepatocellulært carcinom [48], overfladisk blærecancer [49], og lungecancer [50]; i sidstnævnte rapport forfatterne foreslog deltagelse af translationsinitiering kompleks i tumorigenese af lungekræft. PABPC1 også regulerer telomeraseaktivitet, der fører til en vækstfordel i keratinocytter, der udtrykker human papillomavirus type 16 E6 [51]. RNA eksport 1 homolog (RAE1) er et nukleart eksport protein involveret i mRNA transport fra kernen til cytoplasmaet. RAE1 spiller også en kritisk rolle i opretholdelsen af ​​spindel bipolarity under celledeling [52], [53]. RAE1 mRNA og protein-niveauet falder ved inhibering af neuroblastom celleproliferation, og dets overekspression forhindrer retinsyre-induceret cellecyklusstandsning og differentiering [54]; imidlertid en tidligere undersøgelse viste at RAE1 /NUP98 mutante mus er mere modtagelige for DMBA-induceret lungetumorer sammenlignet med vildtypemus, hvilket indikerer, at kombineret RAE1 /NUP98 haplo-insufficiens potentielt fremmer tumorigenese [55].

Den nedreguleret gen adenosindeaminase handler på RNA 2 (ADAR2 eller ADARB1) er et RNA editase der katalyserer adenosin til inosin deaminering i dobbeltstrengede områder. Dysregulering af adenosin til inosin redigering i humane cancere potentielt bidrager til den ændrede transkriptionel program nødvendigt for at opretholde carcinogenese [56]. ADAR2 udtrykkes ubikvitært i mange væv, især i centralnervesystemet [57]. Tidlig debut epilepsi og for tidlig død blev rapporteret i ADAR2 knock out mus [58]. I kræft, en tidligere undersøgelse rapporteret overekspression af ADAR2 i

in vitro

forvandlet menneske voksne mesenkymale stamceller, transformerede fibroblaster, og nogle cellelinjer fra andre væv [59]. Højere niveauer af ADAR2 mRNA blev også observeret i androgen-uafhængig prostatacancer cellelinjer forhold til androgen-responderende cellelinjer [60]. Men link, de fleste rapporter kræft med reduceret ADAR2 ekspression eller aktivitet. Således blev et fald i enzymatisk aktivitet af ADAR2 hos patienter med mangeartet glioblastom (MGB) forbundet med højere Ca

2+ permeabilitet og aktivering af Akt pathway, der bidrager til tumorvækst og aggressivitet [61], [62]. Paz et al. også fundet et fald på ADAR2 mRNA-niveauer i hjernetumorer og viste, at dets overekspression i en MGB cellelinie resulterede i nedsat celleproliferation [63]. Et fald i ADAR2 redigering aktivitet, hvilket korrelerer med graden af ​​malignitet, blev også fundet hos pædiatriske astrocytomer [64]. Når redigeringen status blev tilbageført i tre astrocytoma cellelinier, blev et signifikant fald i celle malign opførsel fundet [64]. For nylig Galeano et al. observeret et generelt fald i ADAR2-medierede redigering begivenheder i blæren og kolorektal cancer [65]. I tilfælde af lungecancer, blev en reduktion på ADAR2 ekspression tidligere beskrevet i planocellulært lungecarcinom [66].

Nedregulering af ADAR2 i lungekræft er potentielt associeret med genetiske ændringer ved 21q22, hvor ADAR2 genet er placeret. Tidligere undersøgelser har rapporteret tabet af genetisk materiale ved den lange arm af kromosom 21 hos patienter med adskillige faste tumorer [67] – [71], herunder lungecancer [72] – [76]. Lee et al. analyseret ni mikrosatellitmarkører, placeret mellem 21q21.1 og 21q22.3 i NSCLC patienter. LOH blev påvist i mindst en af ​​dem i over 55% af tumorer, med 26% -48% LOH forekomsten i individuelle mikrosatellitter [74]. Sato et al. beskrevet LOH på 21q22.3 i 28% af prøverne fra adenocarcinom og pladecellekræft patienter [72]. Vi fokuserede på analysen af ​​21q22.3 ændringer i regionen ADAR2. Vi fandt 30-40% forekomst af LOH blandt patienter med NSCLC, med næsten halvdelen af ​​tumorerne (23 ud af 48) udviser LOH i mindst én af de analyserede mikrosatellitter. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser viste planocellulært karcinom højere frekvenser af LOH på 21q22 end adenokarcinomer. Desuden blev en meget høj forekomst af LOH (75%) observeret ved analyse af en SNP beliggende inden for ADAR2 genet. Disse resultater kan forklares ved eksistensen af ​​vekslende områder med og uden LOH, og indikerer, at ADAR2 genetiske locus er en af ​​de hyppigst ændrede regioner i lunge carcinogenese. Tilsammen de hyppige genetiske tab ved ADAR2 locus og dets reducerede ekspression antyder, at ADAR2 potentielt fungerer som en tumorsuppressor i lungekræft. Funktionelle data understøtter også denne hypotese, fordi overekspression af ADAR2 i cancer cellelinjer hæmmer proliferation og migration [63], [64]. Desuden har vi påvist, at lave ADAR2 mRNA-niveauer er signifikant associeret med samlede overlevelse i lungeadenocarcinom patienter. En prognostisk score baseret på ekspressionen af ​​ADAR2 og fire ekstra RNA stofskifte-relaterede gener (MARS, RAE1, SNRPB og SNRPE) kan stratificere lungekræftpatienter i høje og lave risikogrupper for kræft død. Yderligere forskning er dommerkendelse til at undersøge, om disse oplysninger kan være nyttige til at identificere de patienter med resektabel NSCLC, der har høj risiko for tilbagefald og kan med fordel adjuverende behandling.

Som konklusion i denne undersøgelse identificerede vi nye RNA stofskifte -relaterede gener udtrykkes forskelligt i lungekræft og forbundet med kliniske resultat. Disse resultater understøtter rollen af ​​RNA-metabolisme i patogenesen af ​​denne sygdom. Yderligere karakterisering af de mekanismer, der regulerer denne proces kan potentielt føre til udvikling af forbedrede strategier for diagnose, prognose, og behandling af lungekræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af etiske komitéer i Clínica Universidad de Navarra (Pamplona, ​​Spanien) og Hospital Marqués de Valdecilla (Santander, Spanien). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient

microarray eksperimenter

Fire offentligt tilgængelige microarray eksperimenter blev brugt til at identificere RNA-stofskifte relaterede gener udtrykkes forskelligt mellem lunge adenocarcinom og normal lungevæv [22]. – [25]. Nogle af disse forsøg omfattede data fra andre histologiske undertyper. En femte microarray eksperiment blev anvendt til at analysere forholdet mellem genekspressionsniveauer og prognosen hos patienter med lunge-adenocarcinom [26]. Tabel S3 indeholder oplysninger om antallet af prøver og de histologiske undertyper stede i hver undersøgelse.

Lung Cancer cellelinjer og primære kulturer

Lungekræft cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). Celler blev dyrket i RPMI suppleret med 2 mM glutamin, 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Lille luftvejs-epitelceller (SAEC) blev indkøbt fra Lonza (Walkersville, MD) og dyrket i små luftvejsepitelceller vækstmedium (SAGM, Lonza) suppleret med SAGM SingleQuots (Lonza). Normale humane bronkiale epitel (NHBE) celler (Clonetics, San Diego, CA) blev dyrket i bronkial epitelcelle vækstmedium (BEGM, Clonetics) suppleret med væksttilskud af BulletKit (Clonetics). Cellekulturer blev holdt ved 37 ° C og 5% CO

2 i en fugtig inkubator. Før RNA eller DNA-ekstraktion blev cellerne testet for

Mycoplasma

kontaminering, ifølge producentens instruktioner (MycoAlert Mycoplasma Detection Kit, Cambrex, Rockland, ME).

kliniske prøver

Primære tumorer og deres tilsvarende normale lungevæv blev opnået fra patienter med NSCLC behandlet med kurativ resectional kirurgi på Clínica Universidad de Navarra (Pamplona, ​​Spanien) eller på hospitalet Marqués de Valdecilla (Santander, Spanien). Ingen af ​​patienterne modtog kemo- eller strålebehandling inden operationen. Kirurgisk fjernet prøver blev straks nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Kun prøver indeholdende mere end 70% af tumorcellerne blev anvendt. Histologier og stadier af tumorerne indgår i undersøgelsen, er angivet i tabel S4. Tumorer blev klassificeret ifølge WHO 2004 klassifikationen [77].

RNA Extraction

RNA ekstraktion blev udført ved hjælp af RNA Ultraspec (Biotecx Laboratories, Houston, TX). For primære væv blev RNA ekstraktion udført efter mekanisk fragmentering af frosne prøver under anvendelse af β-mercaptoethanol og RNeasy Micro (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Alle RNA-prøver blev fortyndet i vand med DEPC og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. RNA-koncentrationen blev bestemt ved spektrofotometri (NanoDrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Reverse Transcription (RT)

To mikrogram RNA blev inkuberet med 1 mM dNTP’er og 50 ng /oligo pi -dTs ved 65 ° C i 5 minutter. Bagefter blev 4 pi 5 x RT-puffer, 1 pi 0,1 M DTT, 40 U af RNase Out og 200 U af Super Script III revers transkriptase (alle fra Invitrogen) tilsat. Rør blev inkuberet 50 minutter ved 50 ° C og 15 minutter ved 70 ° C, og derefter anbragt i is. Endelig blev 2 U af RNase H (Invitrogen) tilsat, og rørene blev inkuberet 20 minutter ved 37 ° C. cDNA blev lagret ved -20 ° C indtil anvendelse.

Genomisk DNA Extraction

Genomisk DNA blev oprenset med QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner.