PLoS ONE: Performance og omkostningseffektivitet af KRAS Mutation Test for metastatisk kolorektal cancer i Rutinemæssig Diagnose: Den MOKAECM Study, en landsdækkende Experience

Abstrakt

Formål

Hurtig fremskridt i forståelsen af ​​kræft biologi har forvandlet udvikling af lægemidler og dermed føre til godkendelse af målrettede behandlinger og til udvikling af molekylære tests at vælge patienter, der vil reagere behandlinger.

KRAS

status har vist sig som en negativ indikator for klinisk gavn af anti-EGFR-antistoffer i kolorektal cancer, og anti-EGFR-antistoffer brug var begrænset til

KRAS

vildtype tumorer. For at sikre bred adgang til tumor molekylær profilering, har den franske National Cancer Institute (Inca) oprette et nationalt netværk af 28 regionale molekylærgenetiske centre. Samtidig en landsdækkende vurdering ekstern kvalitet til

KRAS

test (MOKAECM) blev givet til at analysere reproducerbarhed og omkostninger.

Metoder

96 celle-line DNA og 24 DNA-prøver fra paraffin indlejrede tumorvæv blev sendt til 40 franske laboratorier. I alt 5448

KRAS

resultater blev indsamlet og analyseret, og en mikro-koster undersøgelse blev udført på websteder for 5 almindelige metoder af et uafhængigt hold af sundhedsmæssige økonomer.

Resultater

Dette arbejde gav et baseline billede af nøjagtigheden og pålideligheden af ​​

KRAS

analyse i rutinemæssige testbetingelser på et landsdækkende niveau. Inter-laboratorium Kappa værdier var 0,8 til

KRAS

resultater på trods af forskelle påvisningsmetoder og brugen af ​​in-house teknologier. Specificitet var fremragende med kun én falsk positiv i 1128 FFPE data og følsomhed var højere for målrettede teknikker i forhold til Sanger sekventering metoder, der var afhængige af lokal ekspertise. Anslåede omkostninger reagens per patient varierede fra € 5,5 til 19,0 €.

Konklusion

Inca har set-up et netværk af offentlige laboratorier dedikeret til molekylær onkologi tests. Vores resultater viste næsten perfekte aftaler

KRAS

test på et landsdækkende niveau på trods af forskellige testmetoder, der sikrer en omkostningseffektiv lige adgang til personlig kolorektal cancer behandling

Henvisning:. Blons H, Rouleau E, Charrier N, Chatellier G, Côté JF, Pages JC, et al. (2013) Ydelse og omkostningseffektivitet af

KRAS

Mutation Test for metastatisk kolorektal cancer i Rutinemæssig Diagnose: Den MOKAECM Study, en landsdækkende Experience. PLoS ONE 8 (7): e68945. doi: 10,1371 /journal.pone.0068945

Redaktør: Anthony W.I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Marts 4, 2013; Accepteret: 4 juni 2013; Udgivet: 25 Juli 2013

Copyright: © 2013 Blons et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Det MOKAECM studere: Evaluering de la afsløring des Mutationer de l’Oncogene KRAS pour le TRAITEMENT par les Anticorps anti-EGFR des patienter Porteurs d’un cancer Kolorektal Métastatique blev støttet af den franske National cancer Institute (Inca) projektnummer STIC2008 /IC0803 /NI08001. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Hélène Blons, Etienne Rouleau, Nathanaël Charrier, Gilles Chatellier, Jean-François Cote Jean-Christophe Pages, Firenze de Fraipont, Jean-Christophe Boyer Jean Philippe Merlio, Alain Morel, Marie-Claude Gorisse, Patricia de Cremoux, Karen Leroy, L’Houcine Ouafik, Jean-Louis Merlin, Delphine Le Corre, Pascaline Aucouturier, Frédérique Nowak, Thierry Frebourg, Jean-François Emile og Isabelle Durand-Zaleski erklæret, at de ikke har nogen konkurrerende interesser. Gérard Milano: Erklæret være: konsulent eller rådgivende rolle for “Roche, Merck Serono, GSK” (Direkte finansiering til Hélène Blons) Jean-Christophe Sabourin: Erklæret være en konsulent eller rådgivende rolle for “Merck Serono” (Direkte finansiering til Hélène Blons ) Pierre Laurent-Puig: Erklæret være en konsulent eller rådgivende rolle for “Merck Serono; Amgen; Genomic Health; Sanofi; Myriad Genetics “(Direkte finansiering til Hélène Blons). Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Nye terapeutiske metoder såsom anti-EGFR målrettede behandlinger og samtidig identifikation af molekylære biomarkører til identificere undergrupper af potentielt responsive tumorer havde skabt et behov for rutinemæssig molekylær karakterisering af kræft. I kolorektal cancer, blev demonstrationen, at patienter med

KRAS

muterede tumorer ikke drage fordel af anti-EGFR monoklonale antistoffer etableret uafhængigt af den teknologi, der anvendes til at identificere

KRAS

muterede tumorer [1]. Dette resultat blev hurtigt efterfulgt af et direktiv for Det Europæiske Lægemiddelagentur (EMEA), der begrænsede brugen af ​​cetuximab (Erbitux®) og panitumumab (Vectibix®) til patienter med

KRAS

vildtype metastatisk kolorektal cancer [2 ]

med mere end 940.000 nye tilfælde af kolorektal kræft på verdensplan hvert år, brug af anti-EGFR målrettede behandlinger står over hovedspørgsmål, en økonomisk én:. der betaler for testen eller narkotika, og en medicinsk én : der udfører forsøget? Det franske offentlige sygesikringssystem besluttet at yde målrettet terapi for tarmkræft i overensstemmelse med EMEA anbefaling. Parallelt hermed har den franske regering og National Cancer Institute (Inca) oprette et nationalt netværk af 28 regionale molekylærgenetiske centre til at gennemføre rutinemæssige molekylære test for tarmkræft. Mere end ét laboratorium kan relateres til en regionalt center.

Hvert laboratorium udviklet

KRAS

test i henhold til sin egen ekspertise og de lokalt tilgængelige instrumenter. Antallet af prøver er steget fra 1.100 i 2007 til 10.012 i 2008 og 17.246 i 2009. Fra da af, antallet af prøver var stabilt og dækket den forventede forekomst af metastatisk kolorektal cancer patienter i Frankrig. En grundlæggelsen af ​​€ 2.5M var afsat til

KRAS

test. Denne organisation syntes omkostningseffektive overvejer global gevinst på omkostningerne narkotika. Det var nødvendigt at bevise, at

KRAS

testresultaterne var reproducerbare mellem molekylære laboratorier. Hvert laboratorium ved hjælp af en eller flere genotypebestemmelse metode blev evalueret af en ekstern kvalitetskontrol programmet, multicenter program:

KRAS

Oncogene Mutation detektion i behandlingen af ​​metastatisk kolorektal kræft ved EGFR antistoffer (MOKAECM). Den MOKAECM Projektet blev oprettet som en ekstern kvalitetskontrol og laboratorier kunne frit vælge og udvikle deres egen metode til

KRAS

test.

Forrige sammenlignende undersøgelser evalueres én teknologi [3]

[4], [5]. Andre sammenlignet forskellige teknikker med en afprøvet teknologi per site. I begge tilfælde kan ikke vurderes robustheden af ​​en teknologi, der anvendes med forskellige niveauer af ekspertise [6] [7]. En national vurdering af

KRAS

mutation test forbinder faktiske praksis i forbindelse med evaluering omkostninger er aldrig blevet gjort indtil nu.

Det første mål for den MOKAECM projektet var at evaluere på et landsdækkende niveau ydeevne af

KRAS

test til klinisk formål (sensitivitet og reproducerbarhed). Den anden var at vurdere og sammenligne omkostningerne til hver enkelt teknologi. Da denne undersøgelse dækker et nationalt område, herunder alle de Inca mærket molekylære laboratorier, kan vi udlede den nationale ydelse til

KRAS

test fra MOKAECM studiet.

Materialer og metoder

undersøgelse design

Denne undersøgelse blev designet til at evaluere

KRAS

genotypning i 40 franske laboratorier i tilknytning til en af ​​de 28 molekylærgenetiske centre, ved hjælp af cellelinje og formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) tumor prøver. ADN’erne var centralt parat til at kontrollere homogenitet og blindt sendt til alle deltagere for

KRAS

test anvendelse af rutinemæssige praksis teknologier. Resultaterne blev indlæst og lagret i en særlig database og analyseret af en statistiker (GC) fra hEGP hospitalet Klinisk Forskningsenhed

cellelinier

ATCC Cells linjer (H1573: p.G12A; H358. : p.G12C; A427: p.G12D; LS123: p.G12S; SW620: p.G12V; LoVo: p.G13D; SW46: Wild Type) var specielt indkøbt til undersøgelsen og

KRAS

G12R, blev opnået ved retroviral infektion af 292FT celler med en vektor indeholdende den

KRAS

c.34G . C substitution (JCP)

Kolorektal Cancer Servietter prøver

Fireogtyve tumorer blev karakteriseret og udvalgt fra patienter, der gennemgår kirurgisk resektion for tarmkræft på Ambroise Paré Hospital, (Boulogne-Billancourt, Frankrig). Den etiske komité i Ile de France II godkendt undersøgelsen og patienterne blev informeret og skriftligt samtykke blev opnået i henhold til fransk lovgivning. Undersøgelsen blev gennemført i Frankrig. Diagnose af kolorektal adenocarcinom blev vurderet af en patolog (JFE) der valgt de FFPE blokke til efterfølgende molekylær analyse. DNA-ekstraktion blev udført på Ambroise Paré Hospital ved hjælp af Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen). De tumorer blev karakteriseret for

KRAS

af tre forskellige laboratorier ved hjælp af tre forskellige teknologier. Disse laboratorier blev udvalgt baseret på deres erfaringer med KRAS test og i hus validering af den anvendte metode. Udvalgte prøver viste nogen uoverensstemmelse.

Vurdering af cellularitet

Evalueringen af ​​cellularitet blev udført ved Hematoxylin, eosin og safran (HES) glider i begge ender af FFPE blok anvendt til DNA-ekstraktion. Slides blev scannet på en Mirax Scan, (Zeiss, Göttingen, Tyskland). For at validere indholdet tumoren celle blev de scannede billeder gennemgået af syv uafhængige patologer fra forskellige centre. Når uoverensstemmelser blev bemærket, blev slides revideret og konsensus blev fundet

Metodevalg

Forskellige in-house metoder blev udviklet:. Sanger direkte sekventering (n = 15 laboratorier), allele diskrimination probe systemer [ ,,,0],8], [9] (n = 13), Snap Shot [10] (n = 7), pyrosekventering [11] (n-5), HRM efterfulgt af sekventering [12] (n = 5). Et laboratorium bruges TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit kommercielle kit. Fem laboratorier testede mere end én metode.

Tredive laboratorier bragt hele deres protokol for

KRAS

mutation afsløring, var der ingen praksis homogenitet bortset laboratorier

KRAS

TaqMan® sonder (se Information S1). Detaljerede procedurer med primere positioner er tilgængelige på anmodning.

Statistisk metode og dataanalyse

Fejl sats blev defineret som summen af ​​falske positiver, falsk negative, ikke-bidragsevne tests og forkert mutation kald. Til at passe til de kriterier, som Det Europæiske EQA blev alle fejl ved først betragtes som lige væsentlige, selv om konsekvenser for patienter kan variere. Alle prøver blev udvalgt til at have nogen forstærkning standard og hver deltager indsendt et resultat, som vi anses for at være den endelige rapport sendes til onkolog. I et andet trin overvejede vi klinisk relevante fejl som værende falsk positive og negative resultater overvejer, at en ny prøve i tilfælde af svigt vil blive anmodet om, selv om dette vil resultere i en yderligere forsinkelse for patienten.

Succes rate blev defineret som summen af ​​sande positive og sande negativer.

Vi vurderede både reproducerbarhed (inter- og intra-laboratorier) og diagnose nøjagtighed (sensitivitet og specificitet) af de forskellige teknikker til

KRAS

genotypebestemmelse. For hver mutant cellelinie, der var fire forskellige fortyndinger (5%, 20%, 50%, 100%) med tre replikater pr fortynding. Alle data blev taget i betragtning.

For de seks teknikker, der anvendes af mindst to laboratorier, inter-reproducerbarhed blev vurderet ved hjælp af en generalisering af Cohen Kappa statistik for måling af aftale mellem flere satser [13] . Faktisk blev hver af de 96 prøver bedømt af

m

laboratorier – med

m

fra 2 til 15 i overensstemmelse med teknik-ind i en af ​​de otte gensidigt udelukkende kategorier. Som der var svigt (manglende evne til teknikken at give en mutation status), beregning under hensyntagen manglende data. Konfidensintervaller for den sande generaliseret Kappa koefficienten blev beregnet ved hjælp af bootstrap resampling metode, til at tage intra-cluster korrelation i betragtning [14].

For at vurdere intra-reproducerbarhed for en given

KRAS

genotype teknik, vi beregnet en Kappa statistik for hvert laboratorium, som beskrevet ovenfor, er baseret på de tredobbelte portioner. Så vi opsummeret resultaterne ved at give gennemsnitlige Kappa-koefficienter, med den række af Kappa-koefficienter tværs laboratorier.

Diagnose nøjagtighed til påvisning af hver enkelt mutation (kategoriske guldstandard) blev vurderet for hver teknik og hvert laboratorium. Materialer, der anvendes i de to runder kan betragtes som guld standardmaterialer (cellelinjer, validerede tumor DNA’er). Det var muligt at vurdere en sensitivitet og specificitet for hvert laboratorium med cellelinje materiale og FFPE DNA-prøver. For hver teknik, følsomhed og specificitet til påvisning af mutation (binær guldstandard) blev beregnet ved at kombinere data fra alle laboratorier. Et forhold estimator for variansen af ​​klynger binære data, som tager intra-cluster korrelationer i betragtning blev brugt til at beregne 95% CI [15]. Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS-software-version 9.1

Økonomisk Assessment

Fem teknologier blev sammenlignet:. “Direkte sekventering”, “Snapshot”, “Pyrosequencing”, “High Resolution Melting” (HRM ), “TaqMan®”. Omkostninger blev estimeret ud fra synspunktet af laboratoriet ved microcosting og tid-motion undersøgelser. Vi vurderede faste og variable omkostninger forbundet med hver af de fem teknologier: arbejdskraft, hjælpematerialer (dvs. reagens og andre forbrugsgoder) og udstyr og udelukkede omkostninger. Købspris blev brugt til forsyninger og udstyr med et 5-års lineær afskrivning og arbejdskraft blev vurderet ved hjælp af samlede lønsum [16].

Cost Følsomhedsanalyse

En følsomhedsanalyse blev ført til at få en række af omkostningerne ved at flytte forskellige parametre. Parametrene var på priserne (5% og ± 10%) og laboratorium antal retsakter (Information S1).

Resultater

Analyse af cellelinje Resultater

Ninety-seks celle-line DNA-prøver blev sendt til 40 franske laboratorier, fem laboratorier anvendt to forskellige screeningsmetoder, der fører til 4320 rapporterede resultater. Da 6 laboratorier ikke teknisk kunne detektere p.G12R mutationen (Information S1) blev p.G12R prøverne ikke taget i betragtning og 3780 resultater blev endeligt analyseret. Resultater blev sammenlignet med de forventede genotyper. Den globale fejlprocent var 10,6% (399/3780), primært som følge af falsk negative resultater (89%, 357/399). Blandt dem, 307 tests svarede til en procentdel af tumorceller af 5%, medens 50 involverede prøver med højere tumor-forhold. De 42 resterende fejl var analytisk svigt (n = 25; 6%), falsk positiv (n = 2; 0,5%) og forkert mutation (n = 15; 4%). Sekventering genereret alle falske positive resultater og viste en falsk positiv rate på 0,4% (2/540). Forkerte mutation kaldelser blev noteret til sekventering (0,8%, 11/1260) og snapshot (0,7%, 4/588).

I teknikker udføres af mere end 2 laboratorier, følsomhed varierede fra 76% til 96% og specificitet fra 95% til 100% (tabel 1). Vedrørende 5% tumorprøver blev laveste følsomhed fundet for sekventering og HRM med en samlet opdagelse på ca. 40% i forhold til 89,7% fundet for pyrosekventering. En teknisk fejl på 1,6% blev observeret for Taqman sonder på grund af en ikke-fortolkning af 3 laboratorier i tre eksemplarer, der svarer til p.G12V (SW480 100%) homozygote prøver. Intra-laboratorium og inter-reproducerbarhed var i næsten perfekt aftaler ( 0,8 for alle metoder). Og ikke afhænge af mutation type (tabel 2)

Analyse af Tumor Sample Resultater

Med hensyn FFPE væv, blev 1128 data genereret og analyseret fra 24 individuelle tumor prøver (n = 47 metoder, 40 forskellige laboratorier). Den globale fejlprocent var 1,8% (20/1128) med 1 falsk positive, 7 falsk negative, 9 analytiske fiaskoer og 3 forkerte mutation kaldelser. Individuelle tumor prøver korrekte opkald varierede fra 100% til 76,6%, ja alle laboratorier korrekt genotype 16/24 prøver og én prøve (en

KRAS

p.G12A prøve) genererede fejl af 11 laboratorier. De 6 vildtype prøver blev korrekt genotype undtagen i et enkelt tilfælde var en falsk positiv blev rapporteret af diskrimination allel qPCR metode med en PNA blocker. Tredive-to ud af 47 resultatsæt (laboratorie /metode) genererede 0 fejl (68%), 13 lavet en (28%), 2 lavet to og en lavet 3 (tabel 3). De tre fejl var 3 analytiske fiaskoer bruger pyrosekventering assay. Dette laboratorium bruges også direkte sekventering med én falsk negativt resultat. Hvis klinisk relevante ændringer (falsk positive og negative), og hvis bedste resultater i betragtning, når mere end én metode blev testet, 82,5% af laboratorierne gjort nogen fejl, og succesraten varierede fra 100 til 91,6. De resterende fejl var 6 falsk negativ og en falsk positiv i 7 laboratorier. (Tabel S1).

Omkostninger per post

Microcosting blev vurderet i stedet (n = 10 laboratorier) af et uafhængigt hold af sundhedsmæssige økonomer. Omkostningerne er givet per post per test og alt pr test (tabel 4). Første lønomkostninger varierede fra 3,7 € (TaqMan) til € 11,4 (snapshot) per test på grund af forskellige håndtering varigheder per prøve fra 7,2 (TaqMan) til 22,1 minutter (Snapshot). Små forskelle mellem laboratorier identisk teknologi blev observeret på grund af lille variation i protokoller og til forskellige udstyr, der påvirker effektiviteten og lønomkostninger. Desuden antallet af prøver kører pr parti inducerer også lønomkostninger variation. For det andet, udgifter til udstyr pr test varierede fra € 1,0 til 9,7 € afhængigt af laboratorier og teknologier. Direkte sekventering var den dyreste teknologi med mere end € 7 pr test. Pyrosequencing, HRM og TaqMan var de mindst dyre teknologier med mindre end 2 € per test. Sequencer, Pyrosequencer og qPCR thermocycler genererede 84% af udgifter til udstyr. Machine omkostninger pr test varieres efter varighed af kørsler, købspriser og maksimale antal prøver pr parti.

For det tredje, hjælpematerialer præmier pr test varierede fra 5,6 € til 19,0 €. Antal gentagelser, type reagenser, tekniske processer og prisforhandlinger forklarede de fleste af de observerede fra laboratorier ved hjælp af den samme teknologi forskelle. Disse forskelle var særligt vigtige for snapshot teknik. Et snapshot laboratorium gentaget eksperimenter og brugte dyrere reagenser, der fører til tre gange højere forbrugsmaterialer omkostninger i forhold til det andet laboratorium undersøgt.

samlede omkostninger

De samlede omkostninger per test varierede fra 10,6 € til 34,8 € ( tabel 4). Desuden samlede omkostninger for HRM skal tage hensyn sekventering omkostninger. Omkring to tredjedele af prøver blev påvist som vildtype KRAS gener ved HRM og ikke kræver sekventering. Vi observerede en stigning på post “HRM” sekventering omkostninger fra € 7 til 13 € i forhold til de direkte omkostninger sekventering trods lignende teknologier. Derfor den globale samlede pris pr HRM test varierede fra 27,0 € til 28,0 €.

Cost Følsomhedsanalyse

Følsomhedsanalyse bekræftede, at TaqMan var billigere end andre teknologier (figur 1). De anslåede omkostninger for TaqMan var optimal i basisscenariet. Inden for de værre forhold (fem prøver pr batch og 10% priser markup) TaqMan priser pr test varierede fra 15,7 € til 20,1 €. Pyrosekventering omkostninger pr test var lavere end 20,1 €, hvis mindst 15 prøver pr batch blev kørt.

Bleu diamanter sjældne grundmodel omkostninger.

Diskussion

Anvendelse af anti-EGFR monoklonale antistoffer er begrænset til de 60 til 70% KRAS vildtype metastatisk kolorektal tumorer, hvilket gør passende identifikation af KRAS-mutationer et centralt punkt for klinisk praksis [17], [18]. Desuden begrænser anvendelsen af ​​EGFR-hæmmere til patienter med vildtype-KRAS kan være en mulig løsning for omkostningsbesparelser [19]. For at sikre test tilgængelighed, har Inca givet 28 regionale molekylærgenetiske centre op til 2,5 M € [20]. Formålet med den landsdækkende kvalitetskontrol netværk ved navn MOKAECM, støttet af Inca, var at evaluere de forskellige in-house udviklede metoder ved molekylære laboratorier til KRAS test i rutinemæssige forhold. Her blev lignende cellelinier (4296) og FFPE tumor prøver ADN’erne (1152) sendt til de forskellige deltagere og 5448 KRAS genotype resultater blev fremlagt og analyseret. Med hensyn til cellelinjer test, fejlprocenten var 10,6%, påvisning cutoff varierede fra 5 til 20% og 86% af falsk negative var relateret til fortynding af 5%. 1152 FFPE prøveresultaterne blev analyseret i denne undersøgelse, 68% af test sæt (metode /laboratorier) korrekt identificeret KRAS mutations status i alle FFPE prøver. Dette resultat kan sammenlignes med scoren rapporteret i den europæiske KRAS Eaq ordningen (70%) [21]. For nylig, for KRAS mutation analyse i kolorektal cancer, vilkårlige tærskelværdier for korrekt

KRAS

mutation identifikation blev fastsat til 97% [22]. I betragtning af de bedste resultater til laboratorier testning mere end én metode, den gennemsnitlige succesrate for FFPE prøver var 98,5 og varierede fra 100 til 91,6% (Information S1). Disse scoringer er i overensstemmelse med resultaterne af en undersøgelse kørte i 10 laboratorier i Nederlandene [23]. Desuden manglende nå en samlet test begivenhed score på mindst 80% blev defineret utilfredsstillende ved test af en større antal sager i “Clinical Laboratory Improvement Act” af 1988. Under hensyntagen resultater fra de to test sætter 96% af de franske laboratorier havde en tilfredsstillende score over 80% som tydeligt viser kvaliteten af ​​KRAS test i Frankrig trods det store panel af metoder. Desuden blandt de 1152 tumorer testet, blev rapporteret kun 20 fejl. Dette niveau af fejl er tilfredsstillende.

Fra et nationalt perspektiv, på 1152 tumor prøver i denne undersøgelse, 20 fejl (0,017 CI95% [,01-,027]) blev rapporteret med 11 af dem i relation til en enkelt prøve . Derfor den korrigerede fejlprocent var 0,7% CI95% [0,03% -0,13%] per test og pr tumor. En ekstrapolation tyder på, at i Frankrig, ud af de 18.000 tumorer analyserede hvert år 54 til 234 tumorer kunne misgenotyped.

genotypebestemmelse fejl kan skyldes forskellige spørgsmål som typen af ​​fiksativ, bevarelse procedure, evaluering af indhold tumor-celle og endelig opførelser af den anvendte metode til test. Her DNA-ekstraktion var centraliseret og tumorceller indhold blev bekræftet af 7 uafhængige patologer derfor kun

KRAS

genotypebestemmelsesmetoder blev sammenlignet. Alle valgte prøver havde en første validering af deres KRAS-status udført af tre referencelaboratorier ved hjælp af tre forskellige metoder. Mange forskellige teknikker, herunder kommercielt tilgængelige kits, er blevet udviklet og afprøvet, men fraværet af en anerkendt referencemetode gør evaluering af nye teknologier en vanskelig opgave.

Cell line test kan afvige rutinemæssige men blev brugt som en validering test i optimale betingelser til at sammenligne følsomheden og specificiteten mellem de forskellige teknologier. For prøver med tumorcellelinje indhold over 20%, der kan betragtes klinisk relevante, analyseresultater viste næsten perfekt aftaler. For prøver under 20%, var resultaterne mere heterogene, især for direkte sekventering. Det er vores erfaring, har HRM prescreening ikke redde prøver lavt tumor indhold. Den lavere følsomhed sekventering metoder i forhold til andre var ikke en overraskelse [24], [25], [26], men vores resultater også påpege, at performance kan afhænge af metoden optimering og niveau af ekspertise. Faktisk 7 laboratorier sekventering eller HRM-sekventering havde en lav fejl score ( 10%) i cellen linje serier, herunder 5% cellelinje prøver og ingen fejl i tumoren serien. Følsomhed synes relateret til et par – metode /laboratorie-oplevelse – snarere end strengt til en metode, derfor validering og afsløring cutoff skal vurderes i hvert laboratorium. Når der anvendes lav følsomhed metoder til genotypning, skal macrodissection cutoff være tilstrækkeligt vælges og klare preanalytic anbefalinger skal gives til patologer før DNA-ekstraktion. Uanset påvisningsmetoden, kunne mutation typen påvirke følsomheden. Den fejlprocent var omkring 3% med p.G12V til mere end 20% med p.G12S og p.G12A. Allel kvantificering af de 7 cellelinje DNA ved hjælp pyrosekventering gav ikke nogen relevant forklaring på nedsat følsomhed observeret for nogle mutationer, og termodynamiske konsekvenser i DNA smeltende adfærd måske delvist forklare denne observation. I FFPE serien fejlprocenten var 20/1128 (1,7%) versus 399/3780 (10,6%) i cellelinjer, for hvilke fejl blev primært som følge af 5% tumor celle falsk negative resultater. Fejlprocenten var 2,6% for cellelinjer i lignende forhold tumor indhold (falsk negativ på grund af 5% prøver udelukket) tyder på, at vævsfiksering ikke var en hindring for

KRAS

test. Imidlertid kunne fiksering lidt indflydelse på fiasko niveauer: 0,8% (9/1128) om FFPE prøver versus 0,6% på cellelinie DNA (25/3780). Brugen af ​​metoder baseret på forstærkning af små amplikoner kunne være en mulighed for at sænke niveauet af ikke-bidragsevne resultater [27]. I denne undersøgelse, metoder baseret på diskrimination allel baseret på små fragmenter forstærkning og real time PCR viste ingen fejl mod op til 4% for direkte sekventering metoder. Endelig i FFPE serien, blev 14% af de fejl fundet i en enkelt prøve, for hvilken tumor celle indholdet var 50% efter HES eksamen, men kvantificering af muterede alleler ved Pyrosekventering foreslået, at mutant celler kunne kun udgør 20% af alle. Dette kan til dels forklare de afvigelser observeret for denne prøve, men også tyder på, at genetiske variationer ikke er ligeligt opdaget. Én FFPE falsk positiv prøve blev identificeret ved allelspecifik forstærkning med en PNA blocker. Det var ikke valideret af et andet laboratorium hjælp lignende teknologi og blev derfor betragtet som en falsk positiv. Desuden den kliniske værdi af muteret sub-klon mangler at blive demonstreret [28], [29], [30], [31], [32].

omkostningsskøn Begrænsninger

Denne metode vurdering af omkostningerne var enkelt udleveres, da den samme uafhængigt hold vurderede al den teknologi direkte i laboratorierne. Fem teknologier blev undersøgt ved microcosting i ti laboratorier, der repræsenterer en tredjedel af alle franske “platforme”, som gennemførte 25% af alle

KRAS

mutationer test for patienter med metastatisk kolorektal i Frankrig i 2009. Selv om niveauet for beviser kunne være suboptimal, da den var baseret på 2 observationer pr teknologi, allel diskrimination hjælp TaqMan prober var omkring to eller tre gange billigere end nogen anden teknologi undersøgt. Omkostninger variation inden for en teknologi eller mellem teknologier kan skyldes forskellige procedurer. Faktisk metoder var ikke helt identisk, selv i laboratorier ved hjælp af lignende teknologi, og forskellige grader af optimering blev rapporteret. Et eksempel var forvaltningen af ​​testprocedure – antallet af positive og negative kontroller, antallet af replikater og antallet af tilsatte trin til proceduren såsom gel migration af PCR-produkter. Disse ekstra omkostninger blev vurderet. Vedrørende omkostningerne udstyr en mætning hypotese blev fastsat til en sats på otte timer pr arbejdsdag i løbet af fem år. Dette kunne ikke være den sande situation for nogle laboratorier og de forventede omkostninger undervurderede sande omkostninger til laboratorier. Ifølge mætning hypotesen om udstyr, antages det, at den forventede levetid for maskiner var ens for enhver slags maskine, ingen oplysninger om den reelle forventede levetid for maskiner. Alt microcosting data antydede, at “in-house” teknologier omkostninger var meget lavere end kommercielle kits, undtagen udstyr og lønomkostninger.

Konklusion

Den franske befolkning var 65.027.000 indbyggere i 2011. tyve otte regionale molekylærgenetiske centre, som dækker alle de territorier og koordinerende 46 laboratorier er nu involveret i analysen i 16.000

KRAS

test for metastatisk kolorektal kræft hvert år. Hele netværket er nationalt forvaltes af Inca. Denne kvalitetskontrol program var den første landsdækkende erfaring med 120 tilsvarende prøver, der analyseres med 40 forskellige laboratorier. Vores resultater viser, at, når det er klinisk relevante resultater betragtes som 82,5% af laboratorierne korrekt identificeret

KRAS

mutationsstatus i alle FFPE prøver. Dette arbejde viser også, at mens alle metoder er egnede til

KRAS

test med en gennemsnitlig udgift på 35 € per test eksklusive præanalytiske trin er der forskelle med hensyn til følsomhed og robusthed. Valget af metode vil sandsynligvis afhænge af udstyr og tekniske ekspertise til rådighed lokalt. Denne kvalitet program forudsat en baseline billede af

KRAS

test i Frankrig. Den viste, at det er muligt til en reduceret pris for at indstille et landsdækkende program, er det identificerede fejl i testprocedurer for nogle laboratorier understreger vigtigheden af ​​optimering, validering og kvalitetskontrol processer ved hjælp af et stort panel af mutationer.

Støtte Information

Information S1.

Detaljer af materiale og metoder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068945.s001

(DOC)

tabel S1.

Viser de oplysninger, detaljerede genotyper for FFPE prøver ved laboratoriet (N = 40). Den bedste

KRAS

resultater blev holdt for laboratorium ved hjælp af mere end én teknologi

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0068945.s002

(XLSX-)

Tak

Vi takker French National Cancer Institute og STIC 2008 Audrey Didelot, Claire Mulot, Karine Pallier for deres finansielle og tekniske støtte. Vi takker patologer der anmeldt de 24 HES dias for tumorceller procent evaluering Frédéric Bibeau (Centre Val d’Aurelle, Montpellier), Pascale Cervera (Hôpital St-Antoine, Paris), Françoise Piard (CHU de Dijon), Jean-Christophe Sabourin (CHU de Rouen), Jannick Selves (Hôpital Purpan, Toulouse) og Frédérique Penault-Llorca (Centre Jean Perrin, Clermont-Ferrand)

medlemmerne af MOKAECM kollaborative gruppe er:. Marie-Pierre Gaub; Isabelle Soubeyran; Hugues Begueret; Frédérique Penault-Llorca; Agnès Hardouin; Françoise Piard; Jean Mosser; Cédric Le Marechal; Chantal Delvincourt; Christine Clavel; Christophe Ferrand; Olivier Schischmanoff; Nathalie Theou-Anton; Antoinette Lemoine-Corbel; Lascols Olivier; Hugues De De;