PLoS ONE: Genistein sensibiliserer Blære Cancer Cells til HCPT Behandling In vitro og in vivo via ATM /NF-KB /IKK Pathway-induceret Apoptosis

Abstrakt

Blærekræft er den mest almindelige maligne urologisk sygdom i Kina. Hydroxycamptothecin (HCPT) er en DNA-topoisomerase I-inhibitor, som er blevet anvendt i kemoterapi for blærekræft i næsten 40 år. Tidligere forskning har vist, at isoflavon, genistein, kan bevidstgøre flere kræftceller til HCPT behandling, såsom prostata- og livmoderhalskræft. I denne undersøgelse undersøgte vi, om genistein kunne sensibilisere blære cancercellelinier og blære epithelial cell BDEC celler til HCPT behandling, og undersøgte de mulige underliggende molekylære mekanismer. Genistein kan signifikant og dosisafhængigt sensibiliserer multiple blære cancercellelinier og BDEC celler til HCPT-induceret apoptose både in vitro og in vivo. Genistein og HCPT synergistisk hæmmet vækst blære celle og spredning, og induceret G2 /M fase cellecyklusstop og apoptose i TCCSUP blærekræft celle og BDEC celle. Forbehandling med genistein sensibiliserede BDEC og blærekræft cellelinjer til HCPT-induceret DNA skade ved den synergistiske aktivering af ataksi telangiectasia muteret (ATM) kinase. Genistein betydeligt svækket evne HCPT at inducere aktivering af anti-apoptotiske NF-KB-vejen både in vitro og in vivo i en blærecancer xenograft model, og dermed modvirket den anti-apoptotiske virkning af NF-KB-vejen. Denne undersøgelse viser, at genistein kan fungere som en lovende ikke-toksisk middel til at forbedre effektiviteten af ​​HCPT blærecancer kemoterapi

Henvisning:. Wang Y, Wang H, Zhang W, Shao C, Xu P, Shi CH, et al. (2013) genistein sensibiliserer Blære Cancer Cells til HCPT Behandling In vitro og in vivo via ATM /NF-KB /IKK Pathway-induceret apoptose. PLoS ONE 8 (1): e50175. doi: 10,1371 /journal.pone.0050175

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: 18 juni 2012; Accepteret: 22 Oktober 2012; Udgivet: januar 24, 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.901.498, No. 30.100.185, No. 81.250.036, No. 30.973.000, No. 30.872.583, No. 81.072.116) og Natural Science Foundation of Shaan’xi provinsen, Kina ( 2009JQ4003). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er en af ​​de mest almindelige ondartede sygdomme, der påvirker urinvejene. I alt 44,690 mænd (29,8 pr 100.000) og 16,730 kvinder (11,2 pr 100.000) blev diagnosticeret i 2006, ranking blærekræft som den fjerde mest almindelige mandlige og niende hyppigste kvindelige malign sygdom i USA [1]. I modsætning hertil var forekomsten af ​​blærekræft i Asien er meget lavere. I 2009 Zhang et al. rapporterede, at selv om satserne er steget mellem 1988 og 2002 (8.22 pr 100.000 i 1988 til 1992, 9,45 per 100.000 i 1993 til 1997 og 9,68 pr 100.000 i 1998 til 2002), forekomsten af ​​blærekræft i Kina er fortsat lavere end USA [ ,,,0],2]. Ligeledes i det østlige Asien, er blevet rapporteret lave forekomster af blærekræft i Korea (14,39 pr 100.000), Japan og Indien (ca. 14 pr 100.000) [3] – [5]. Derudover 5-årige sygdomsspecifikke overlevelse af patienter blærekræft i Asien er højere end dem i de vestlige lande [6].

kemoterapeutiske middel, hydroxycamptothecin (HCPT), anvendes primært til behandling af blærekræft. HCPT inducerer apoptose i blære cancerceller ved at danne et ternært kompleks med DNA og DNA-enzymet topoisomerase I via hydrogenbindinger og derved stabilisere komplekset. Den stabilt kompleks forhindrer DNA re-ligering og fører til omdannelsen af ​​enkeltstrengede DNA-brud til dobbeltstrenget strengbrud under S-fasen. På dette tidspunkt replikationsgaflen kolliderer med DNA-spaltning komplekser, der inducerer apoptose og cellecyklusstandsning [7].

Genistein, en velkendt isoflavon og naturlige botaniske østrogen, har vist sig at inhibere cancercellevækst, overlevelse, metastase og angiogenese ved at øge apoptotisk celledød via induktion af adskillige DNA-skadelige stimuli [8] – [10]. Genistein har vist sig at have en hæmmende virkning på væksten af ​​prostatacancer [11], livmoderhalskræft [12], brystcancer [13], tyktarmskræft [14] og renalcellecarcinom [15] -celler. Genistein kan også chemosensitize mange maligne tumorer over for virkningerne af DNA toksiske lægemidler. Tidligere rapporter har indikeret, at forbehandling med 10-30 pmol /l genistein kan chemosensitize hals-, ovarie- og normale fibroblastceller til behandling med HCPT ved at inducere en højere grad af vækstinhibering og celle apoptose [16]. Men om genistein kan forbedre den kemoterapeutiske effekt af HCPT i blæren celler, og dens molekylære virkningsmekanisme i denne vævstype, fortsat uklare. Derfor har vi undersøgt, om genistein kunne chemosensitize blære kræftceller til HCPT, og undersøgt de potentielle underliggende mekanismer af denne effekt.

Materialer og metoder

1. Cellelinjer

J82, SCaBER, og TCCSUP blærekræft cellelinjer blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), BFTC905, HT1197, T24, TSGH-8301 blærekræft cellelinjer var fra Kina center for Type Culture Collection (CCTCC). Den primære blære epitelcellelinje, BDEC, var fra BioWhittaker (San Diego, CA, USA) og blev opretholdt som eksponentielt voksende kulturer i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Genistein (Sigma, Shanghai, Kina) og HCPT (venligst stillet til rådighed af Sanofi, Shanghai, Kina) blev opløst i DMSO for at forberede 10 mM stamopløsninger. Til forsøg blev cellerne inkuberet i 3 dage og derefter behandlet med eller uden 10 uM genistein og 1 uM HCPT i 24 timer.

2. Cellevækstinhiberingen af ​​genistein og HCPT

Celler blev podet ved en densitet på 5 x 10

3 celler /brønd og fik lov til at binde natten over. Dyrkningsmediet blev udskiftet med friske medier indeholdende genistein ved forskellige koncentrationer i 24 timer, og celler blev derefter eksponeret for HCPT i yderligere 72 timer. For hver enkelt middel behandling, blev cellerne behandlet med genistein i 96 timer og HCPT i 72 timer. Cellevækst blev undersøgt under anvendelse af MTT-assayet.

3. Flowcytometri for apoptose

adhærente celler blev trypsinbehandlet, resuspenderet og behandlet som tidligere [17] beskrevne. Flowcytometri blev udført under anvendelse blåt lys argon-laser (excitationsbølgelængde, 488 nm; lasereffekt, 200 mW) og rød fluorescens fra PI, som mærker DNA blev registreret. Alle test for apoptose blev udført i to eksemplarer og de viste resultater er repræsentative for mindst tre eksperimenter.

4. Immunfluorescensfarvning for γ-H2AX og ATM

I γ-H2AX farvning, celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af HCPT og genistein, mediet blev fjernet på forskellige tidspunkter, og cellerne blev fikseret i 1% paraformaldehyd i 10 minutter, efterfulgt af 70% ethanol i 10 min. Cellerne blev derefter inkuberet i 0,1% Triton X i phosphatpufret saltvand (PBS) i 10 minutter, permeabiliseret i 0,5% Triton i PBS i 10 minutter, vasket tre gange i PBS og blokeret med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 60 min. Cellerne blev inkuberet med anti-γ-H2AX (1:2,000; Cell Signaling, Shanghai, Kina) eller anti-ATM (1:300, Cell Signaling, Shanghai, Kina) i 5% BSA i PBS ved 4 ° C natten over, vasket fire gange i PBS, inkuberet i mørke med et FITC-mærket sekundært antistof (1:2,000 for anti-γ-H2AX og 1:300 for anti-ATM) i 5% BSA i 1 time, vasket 4 gange i PBS, inkuberes i mørke med 1 ug /ml 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i PBS i 5 minutter, og monteres og dækglas i Fluoromount G (Southern Biotech, Birmingham, AL , USA). Pladerne blev undersøgt på et Leica fluorescens mikroskop (Wetzlar, Tyskland), billeder blev taget med et Nikon fluorescens mikroskop (Nikon Eclipse E800) og importeres til Nikon ACT-1 (Version 1.12) software. Billeder blev kombineret i en udgivelse format ved hjælp af Adobe Photoshop CS2-softwaren. For hver behandling tilstand, blev antallet af γ-H2AX eller ATM foci bestemt i mindst 50 celler. Alle observationer blev valideret af mindst tre uafhængige forsøg.

5. Western blotting

blærekræft celler blev lyseret i 400 pi 1% SDS lysis buffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 4 mM Nappi, 2 mM Na

3VO

4) i 5 minutter på is til opnåelse af totale cellelysater. At indsamle nuklear protein, blev monolagene vasket tre gange med iskold hypotonisk lysepuffer (HLB, pH 7,5, 10 mM Tris, 10 mM KCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM MgC

2), og cellerne blev opsamlet og overført til en homogenisator (Wheaton Ltd, Millville, NJ, USA) i 500 pi HLB. Cellerne blev kvældet i HLB i 15 minutter, homogeniseret og cellekernerne blev opsamlet ved centrifugering og lyseret i RIPA-buffer. Pull-down assay blev udført ved immunoudfældning af 500 pg nukleare eller cytosoliske ekstrakt (præ-klaret med Protein A /G-perler) med primært antistof, og derefter 50-100 pg totalt eller nukleare lysat blev løst på en 7,5-12,5% natriumdodecylsulfat sulfat-polyacrylamid (SDS-PAGE) gel, elektro-overført til en Hybond ECL-membran (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), blokeret i PBS indeholdende 5% fedtfri tørmælk og 0,05% Tween-20, inkuberet med primært antistof natten over ved 4 ° C, og derefter inkuberet med sekundære antistoffer i 1 time. Proteinbåndene blev visualiseret under anvendelse af Phototope-HRP Western Detection System (Cell Signaling, Beverly, MA, USA) og Kodar film (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) og scannet og kvantificeret ved anvendelse ImageJ (http: //rsbweb.nih .gov /ij /). Anti-ATM, anti-phospho H2AX, anti-phospho ATM (Ser 1981), anti-IKK, anti-phospho IKK1 /2, anti-β-actin, anti-GAPDH, anti-phospho-NEMO (NF-kappa β væsentlige modulator), blev anti-NBS1 (Nijimegen brud syndrom 1) antistof, anti-caspase 3 og 9, anti-phospho PARP og anti-Oct1 antistoffer opnået fra Cell Signaling.

6. siRNA transfektion

Transfektion af TCCSUP og BDEC celler med ATM siRNA (50 nmol /l; Invitrogen) blev udført under anvendelse Oligofectamine reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol

7.. In vivo tumor terapi undersøgelser

Forsøget blev godkendt af den etiske komité i den fjerde Military Medical University. Blære kræftceller var forblandet 01:01 med Matrigel (Becton Dickinson, Beijing, Kina) og subkutant podet (5 × 10

6 celler pr stedet) i flankerne af 10-ugers gammel kvinde SCID nøgne mus (Department af forsøgsdyr, den fjerde Military Medical University, Xi’an, Shaan’xi, Kina). Lægemiddelbehandling begyndte 22 dage efter tumorcelleinjektion. Mus blev opdelt tilfældigt (5 mus /gruppe) i fem grupper. Kontrolgruppen blev kompromitteret tumorer, der blev behandlet med 0,01% DMSO. Mus blev behandlet oralt med fødevarer, der indeholdt genistein (1 g /kg) og /eller den transperitoneale injektion af 3 ug /ml HCPT. Den procentvise ændring i tumorstørrelse blev beregnet ved sammenligninger med baseline værdi på 22 dage.

8. Elektroforetisk mobilitet (EMSA)

Nuclear celleekstrakter blev opnået som tidligere beskrevet, og 10 ug kerneekstrakt blev inkuberet med oprenset

32P-mærket NF-KB konsensus dobbeltstrenget oligonukleotid og 0,25 mg /ml poly (dI-dC) i 5 × bindingspuffer [18]. Prøver blev separeret på 8% polyacrylamidgeler, blev gelerne tørret, eksponeret for røntgenfilm natten over ved -80 ° C og fremkaldt under anvendelse af en All-Pro 100 Plus automatiserede røntgenfilm processor (All-Pro Imaging Corporation, Hicksville, NY, USA).

9. Kvantificering og statistiske metoder

Grupper blev sammenlignet ved hjælp af Students

t

-test;

P

values≤0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

1. Effekter af HCPT og genistein på levedygtigheden af ​​blære kræftceller

Blære celler blev behandlet med genistein i 3 dage, og cellelevedygtighed blev bestemt ved anvendelse af MTT-analysen. Behandling af en række forskellige blærekræft cellelinier og BDEC blære celler med genistein resulterede i dosis- og tidsafhængige hæmning af celleproliferation, hvilket viste, at genistein reproducerbart hæmmer væksten af ​​blæren cancerceller. Men en synergistisk virkning blev observeret, når J82, T24, TSGH8301 og TCCSUP blære cancerceller og BDEC blære celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af genistein og HCPT (fig. 1A). MTT-assays viste, at den synergistiske virkning af genistein og HCPT var koncentrationsafhængig (fig. 1B).

A. MTT-assay af blærekræft cellelinier og BDEC celler behandlet med 10 pM genistein og /eller 1 uM HCPT; Resultaterne er udtrykt som procent af kontrolceller. B. MTT-analyse af TCCSUP og BDEC celler behandlet med forskellige koncentrationer af HCPT og /eller genistein i 48 timer. C. cellecyklusfordeling af TCCSUP eller BDEC behandlet med 1 pM HCPT og /eller 10 uM genistein i 24 timer. D. Apoptose målt ved FACS i TCCSUP, og BDEC behandlet med 10 uM genistein og /eller 1 uM HCPT. Værdier er gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg; *

P

0,05 og **

P

0,01 sammenlignet med kontrolgruppen. #

P

0,05 og ##

P

0,01 sammenlignet med HCPT; @

P

0,05 og @@ P. 0,01 sammenlignet med genistein

2. Synergistisk standsning af cellecyklus ved HCPT og genistein

Både HCPT (1 um) og genistein (10 um) for en 24-timers periode viste en statistisk signifikant evne til at standse cellecyklussen (Fig. 1C). Sammenlignet med køretøjet, HCPT forårsagede en cellecyklusstop i både S-fasen (kontrol: 57,6%, HCPT: 46,5%, genistein: 57,9%, HCPT + genistein: 31,1% for TCCSUP celler kontrol: 57,2%, HCPT: 43,1 %, genistein: 53,6%, HCPT + genistein: 29,1% for BDEC celler) og G2-M-fasen (kontrol: 21,5%, HCPT: 30,6%, genistein: 22,1%, HCPT + genistein: 41,6% for TCCSUP celler; kontrol : 21,7%, HCPT: 30,3%, genistein: 26,7%, HCPT + genistein: 36,3% for BDEC celler). Selvom genistein (10 uM) alene påvirkede ikke cellecyklus betydeligt i forhold til kontrollerne, tilsætning af genistein til HCPT-behandlede (1 uM) celler signifikant sensibiliserede cellerne til HCPT via induktion G2 /M-cellecyklusstandsnings.

3. Synergistisk induktion af apoptose ved HCPT og genistein

Brug FACS at kvantificere apoptose, vi observeret, at 10 uM genistein og 1 uM HCPT synergistisk og dosisafhængigt induceret apoptose i blære cancerceller (fig. 1d). Induktionen af ​​apoptose var dosisafhængig og direkte korreleret med en inhibering af cellevækst (fig. 1B, D).

4. NBS1-afhængig ATM aktivering induceret af DNA-skader

De er beskrevet i afsnit 3.3 viste, at genistein kan virke synergistisk med HCPT at inducere apoptose resultater. Som anført ovenfor kunne HCPT inducere celleapoptose via inducere dobbelte strengbrud (DSB) i DNA. Derfor undersøgte vi, om denne synergisme af apoptose er relateret til DSB. TCCSUP celler blev behandlet med 1 pM HCPT og /eller 10 uM genistein i 1 time, og det totale protein fra hver gruppe blev ekstraheret og gennemgik Western blotting for kromosomale histon-protein, γ-H2AX [19]. Western blot viste, at HCPT og genistein synergistisk kunne inducere H2AX phosphorylering 1 time efter lægemiddelbehandling, som viste, at disse lægemidler kunne inducere DSB. Endvidere kunne stærk H2AX phosphorylering stadig ses i den samtidigt behandlede gruppe 24 timer efter behandling sammenlignet med cellerne administreres med kun enkelte lægemidler, som påviste en forsinket DNA-skader reparationsprocessen (fig. 2A). Derudover 1 uM HCPT og 10 uM genistein synergistisk aktiveret phosphoryleringen af ​​ATM ved Ser 794 på en dosis-afhængig måde (Fig. 2B). Den rumlige fordeling af ATM og γ-H2AX efter lægemiddelbehandling blev bestemt under anvendelse af en multiplex immunofluorescens assay (fig. 2C). Signifikant flere ATM og γ-H2AX nukleare foci blev observeret i TCCSUP celler behandlet med både HCPT og genistein i 30 minutter i sammenligning med kontrollen, HCPT- og genistein-behandlede celler. Derudover behandling med begge disse lægemidler signifikant forøgede co-lokalisering af ATM og γ-H2AX i cellekernen. ATM inhibitor, Ku55933, faldt betydeligt ATM foci-dannelse og dermed hæmmet γ-H2AX /ATM co-lokalisering i HCPT- og genistein-behandlede celler (fig. 2C). En immunopræcipitationsassay blev udført for at undersøge, hvordan ATM phosphoryleres efter HCPT og genistein behandling. Behandling med både HCPT og genistein aktiveret ATM og induceret en interaktion mellem ATM /H2AX og NBS1 /H2AX i TCCSUP og BDEC celler. Den NBS1 inhibitor, mirin, betydeligt svækket HCPT- og /eller genistein-induceret ATM eller NBS1 og H2AX bindende i HCPT- og genistein-behandlede celler (fig. 2D).

A. Western blot og kvantificering af H2AX DNA beskadigelse reparation efter forbehandlingen af ​​10 uM genistein og /eller 10 uM HCPT. HP-1α blev anvendt som en loading kontrol; Resultaterne udtrykkes i forhold til kontrolgruppen ved 0 timer. B. Western blot og kvantificering af ATM Ser 1981 phosphorylering efter forbehandling af TCCSUP celler med 10 uM genistein og /eller 10 uM HCPT i 1 time. C. Repræsentative billeder og kvantificering af ATM phosphorylering og H2AX foci dannelse 30 min efter behandling af TCCSUP celler med 1 pM HCPT og /eller 10 uM genistein; diskrete foci af ATM-autophosphorylering vises formodede steder af dobbeltstrengede brud. D. Identifikation af NBS1-afhængige ATM /H2AX interaktion. TCCSUP celler og BDEC celler blev behandlet med 1 pM HCPT og /eller 10 uM genistein i 1 time med eller uden NBS1 inhibitor, mirin, immunpræcipiteret med anti-ATM eller anti-NBS1 antistoffer og immunkomplekser blev detekteret ved Western blotting. ATM foci steg lineært med dosis efter 1 time genistein og HCPT behandling. Værdier er gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg; IP: immunopræcipitation, W: Western-blot. *

P

0,05 og **

P

0,01 sammenlignet med kontrolgruppen. #

P

0,05 og ##

P

0,01 sammenlignet med HCPT; @

P

0,05 og @@ P. 0,01 sammenlignet med genistein

5. ATM hæmning nedregulerer NF-kB og inducerer apoptose i HCPT- og genistein-behandlede celler

Niveauerne af aktiveret, blev phosphoryleret ATM undersøgt i TCCSUP celler. TCCSUP celler behandlet med 1 pM HCPT i 1 time udviste en stærk konstitutiv ATM phosphorylering, som kunne inhiberes af ATM siRNA eller den lille molekylære specifikke ATM inhibitor, KU55933 (fig. 3A). Immunopræcipitationsanalyser indikerede, at ATM siRNA reduceret ATM /NEMO bindende i TCCSUP celler; kunne dog HCPT og genistein synergistisk forøge ATM /NEMO binding (fig. 3B), hvilket indikerede, at NEMO spiller en vigtig rolle i suppression af HCPT induceret NF-KB-aktivering. Endvidere blev den synergistiske forøgelse af ATM /NEMO bindende i HCPT- og genistein-behandlede celler ledsaget af forøget kBa ekspression (figur 3C.) Og reduceret IKK1 /2 phosphorylering (Fig 3D.); til gengæld disse inducerede den forøgede spaltning af caspase 3, caspase 9 og PARP (Fig. 3E).

A. Western blot af ATM-phosphorylering i TCCSUP celler behandlet med 1 pM HCPT i 1 time transficeret med ikke-silencing kontrol (NSC) siRNA, ATM siRNA eller behandlet med ATM inhibitor, Ku55933 (10 uM, 2 timer). B. Immunfældning og Western blot af ATM og NEMO i TCCSUP celler transficeret med NSC siRNA eller ATM siRNA, eller behandlet med 10 pM Ku55933, 10 uM genistein og /eller 1 uM HCPT. IP: immunopræcipitation, W: Western-blot. C. EMSA blot af NF-KB-ekspression i TCCSUP celler behandlet med 10 pM genistein og /eller 1 uM HCPT i nærvær af NSC siRNA og ATM siRNA. D. Western blot af NF-KB, IKK2, kBa ekspression og IKK1 /2 phosphorylering i TCCSUP celler behandlet med 10 pM genistein og /eller 1 uM HCPT i nærvær af NSC siRNA og ATM siRNA, hvilket viser, at genistein og HCPT inducere phosphorylering af IKK1 /2 og øge kBa udtryk via ATM. E. Western blot af PARP, caspase 3 og caspase 9 spaltning i helcellelysater fremstillet ud fra TCCSUP celler behandlet med 10 um genistein og /eller 1 uM HCPT i nærvær af ATM siRNA eller Ku55933. Alle forsøg blev gentaget tre gange, og lignende resultater blev opnået i hver gentagelse.

6. Genistein svækket HCPT-induceret NF-KB-aktivering og dermed synergistisk induceret apoptose in vivo

For at verificere den synergistiske hæmmende virkning på væksten af ​​genistein og HCPT i blære cancerceller, vi bestemt deres virkninger i en xenograftmodel af SCID mus behandlet med TCCSUP blærecancer-cellelinie. Genistein og HCPT udviste en synergistisk hæmmende virkning på tumorvækst i xenograft (fig. 4A). Endvidere tumorer behandlet med HCPT viste NF-KB-aktivering, mens genistein svækkede denne aktivering (fig. 4B). Nedsat aktivering af de nedstrøms molekyler IKK1 /2, øget fosforylering af kBa og øget kløvning af caspase 3, caspase 9 og PARP blev observeret i tumorer behandlet med genistein og HCPT (fig. 4C).

TCCSU blærekræft celle tumorer fik lov til at etablere i 22 dage, hvorefter dyrene blev injiceret intratumoralt med 10 uM genistein og /eller 10 uM HCPT på dag 0 og 7 i behandling. A. Vækst kurve TCCSUP blærekræft xenografter behandlet med genistein og /eller HCPT; tumorvolumen udtrykkes i forhold til tumorstørrelse ved starten af ​​behandlingen. B. EMSA-assay af NF-KB-ekspression i xenograft tumorvæv fra hver gruppe. C. Western blot analyse af phosphoryleret IKK1 /2, IKK2, kBa udtryk i xenograft tumorvæv fra hver gruppe.

Diskussion

Genistein anses for at være en potentielt ideel kemoterapi agent for blærekræft, som det er naturligt, sikker, med minimale bivirkninger og relativt lave omkostninger [20]. Tidligere undersøgelser har indikeret, at sojabønne isoflavon, som er til stede i store mængder soja produkter, kan spille en vigtig rolle i inhibering af tumorigenese [21]. Det har også vist sig at inducere celleapoptose via nedsættelse af ekspression af 32 kDa caspase 3 precursor og øge niveauet af den spaltede aktive form af denne caspase [22]. Zhou et al. rapporterede, at soja isoflavoner og soja fytokemiske koncentrater kunne hæmme væksten af ​​murine og humane blære-cellelinier in vitro og in vivo i en dosisafhængig måde [23]. Tidligere undersøgelser afslørede, at den synergistiske inhiberende virkning af genistein og camptothecin i livmoderhalskræft, ovariecarcinom og musefibroblastceller sker som følge af inhibering af NF-KB translokation og induktionen af ​​G2 /M cellecyklus og apoptose [16].

Hvad enten genistein kunne sensibilisere blære celler til camptothecin behandling ikke tidligere er blevet undersøgt. I denne undersøgelse blev genistein og HCPT sig at inhibere væksten af ​​multiple blære cancercellelinier og den primære BDEC blære epitelcellelinie (fig. 1A). Genistein og HCPT synergistisk og dosisafhængigt inhiberede celleoverlevelse (fig. 1B), inducerede G2 /M-cellecyklusstandsnings (fig. 1C) og apoptose (fig. 1D) i TCCSUP blærekræft cellelinje og BDEC blære epitelceller. Med hensyn til den underliggende mekanisme, induktionen af ​​dosisafhængig synergistisk DNA-beskadigelse ved genistein og HCPT og deres hæmmende virkning på DNA beskadigelse reparationsprocessen blev observeret i op til 24 timer, sammenlignet med genistein eller HCPT behandling alene (fig. 2A) . Som tidligere rapporteret, kunne både HCPT [24] og genistein [25] direkte inhiberer DNA-topoisomerase I. Vi hypotesen, at induktionen af ​​DNA-skade ved HCPT og genistein skyldes deres hæmning på DNA topoisomerase og dermed deres indvirkning på dannelsen af replikation gaffel, der kræver yderligere undersøgelser.

Så vi undersøgte de nedstrøms signalering virkninger af genistein- og HCPT-induceret DNA-skader at bestemme, hvordan den synergistiske induktion af ATM fosforylering er relateret til deres pro-apoptotiske effekt. ATM kinase er en vigtig regulator, der aktiveres af DNA-beskadigelse [26]. Det er blevet rapporteret at være tæt korreleret med celle apoptose i flere cancerceller. ZÜCO et al. rapporterede, at camptothecinderivatet, ST1968, kan inducere apoptose via aktivering af ATM [27]. Kawakami et al. rapporterede, at doxorubicin kan inducere apoptose i A549 lungeadenokarcinom celler via ATM-aktivering [28]. I denne undersøgelse blev det konstateret, at en kombineret behandling med genistein og HCPT synergistisk induceret ATM Ser 1981 phosphorylering (fig. 2B) ved steder med DNA-skader. I celler behandlet med genistein og HCPT, inhiberingen af ​​ATM ved sin specifik inhibitor, Ku55933, inhiberede phosphorylering af ATM og H2AX, og dermed hæmmet deres co-lokalisering (fig. 2C).

NBS1 er bevist at være det centrale element i den MRE11 /RAD50 /NBS1 kompleks, som danner umiddelbart efter en DNA DSB formularer at rekruttere relaterede proteiner til at reparere de beskadigede DNA sites [29]. ATM og NBS1 både binder til H2AX, et stillads protein ved steder med DNA-skader. Som tidligere beskrevet [30], fandt vi, at evnen af ​​genistein og HCPT til synergistisk inducerer DNA-skader i blæren kræftceller via ATM aktivering var afhængig af NBS1, da NBS1 inhibitor mirin specifikt ophævet HCPT- og genistein-induceret ATM /H2AX binding og NBS1 /H2AX binding (fig. 2D). Disse resultater viste, at den synergistiske DNA-ødelæggende virkning af disse to lægemidler skyldtes deres hæmning af ATM, hvilket er NBS1-afhængig. Phosphorylering af ATM kunne aktivere NF-KB-vejen via NEMO [31], hvilket fører til aktivering og ekspression af en række pro-proliferative og anti-apoptotiske gener, og dermed beskytte cancerceller fra apoptose. NEMO menes at være en polyubiquitin bindende underenhed, som rekrutterer IKK lineære eller K63-bundne poly-scaffolds, der danner som følge af receptor-initieret signaleringsbegivenheder [32]. Derfor, efter behandling med DNA-toksiske lægemidler, såsom HCPT DSB induceret ATM-aktivering, og den nedstrøms NF-KB-vejen aktiveres via NEMO (fig. 3B). Imidlertid NF-KB-vejen er blevet vist, at beskytte celler fra celle apoptose, som til dels kunne dæmpe de toksiske virkninger af HCPT. I vores forskning, kan genistein behandling inaktivere NF-KB-vejen i blærecancer og epitelceller. Sammenfattende upon HCPT behandling, kan DNA-skader inducere ATM phosphorylering, som aktiverer NF-KB-vejen for at beskytte celler mod apoptose. Den multiple protease evne genistein hjælper dog at ophæve HCPT-induceret NF-KB-aktivering [33]. Knockdown af ATM blokerede fuldstændigt evnen hos HCPT og genistein at inducere aktiveringen af ​​NEMO /IKK (Fig. 3D) og inhiberede kløvning af caspase 3, caspase 9 og PARP (Fig. 3E). Dette indikerede, at ATM spiller en central rolle i HCPT- og genistein-induceret apoptose.

For at bekræfte de synergistiske virkninger af HCPT og genistein, vi udførte in vivo xenograft eksperimenter. I xenografter af TCCSUP celler dyrket i SCID-mus, kombineret behandling med HCTP og genistein synergistisk hæmmede tumorvækst (fig. 4A). Denne intracellulære molekylære begivenhed er i overensstemmelse med tidligere opdaget fund i blære celler. HCPT blev vist at aktivere NF-KB, der blev modvirket af genistein i SCID-mus (fig. 4B). Co-behandling med disse to lægemidler synergistisk aktiveret ATM og hæmmede kBa (fig. 4C).

Denne forskning viser, at isoflavon, genistein, kan væsentligt styrke virkningerne af blærekræft kemoterapi agent, HCPT, både i vivo og in vivo. De synergistiske pro-apoptotiske virkninger af disse to lægemidler inducerer flere DSBs og forsinke DNA beskadigelse reparationsprocessen ved at aktivere ATM /NBS1 /NEMO /IKK pathway. Men nogle aspekter af denne mekanisme mangler at blive belyst. For det første, er det stadig ukendt, om den synergistiske DSB inducerende effekt af HCPT og genistein sker via indgreb i replikationsgaflen og toposoimerase I. andet er det stadig uklart, hvordan DSB reparationen er forsinket, om dette er gennem hæmning af homologe rekombination, eller inhibering af ikke-homolog ende sammenføjning. For det tredje kræver yderligere udforskning rolle synergistiske inhibering af NBS-1 aktivering med HCPT og genistein i misdannelse af MRN komplekset. I sidste ende, genistein er en velkendt botanisk østrogen, og østrogen er blevet vist at blive udtrykt i blæren overgangsperiode celle kræft, og det var negativt korreleret med tumorklassificering [34]. Hvorvidt østrogen effekt af genistein er korreleret med den synergistiske vækstinhiberende virkning mangler at blive udforsket i fremtiden.

Som konklusion viser denne undersøgelse, at genistein kan sensibilisere blærekræft cellelinier til HCTP, hvilket fører til en synergistisk dosis -afhængige hæmning af spredning og en induktion af cellecyklusstop og apoptose. Genistein og HCTP inducerer dobbeltstrengede DNA-brud, hvilket fører til den synergistiske aktivering af ATM, dæmper NEMO /NF-KB /IKK /caspase signaltransduktion, og således inducerer apoptose både in vitro og in vivo. Genistein kan også modvirke HCPT-induceret NF-KB-aktivering, og således svække anti-apoptotiske virkning af NF-KB-vejen, som sammenfattet i fig. 5. Disse resultater indikerer, at selvom de underliggende mekanismer kræver yderligere udforskning, kan den kombinerede administration af HCTP og genistein være en lovende fremgangsmåde til behandling af human blærecancer.

ATM phosphoryleres ved steder med dobbeltstrenget DNA pauser efter NBS1 i nærvær af H2AX phosphorylering. Aktiveret ATM transporteres til cytoplasmaet, og aktiverer NEMO, som phosphorylerer IKK1 /2. IKK1 /2 aktiverer og ubiquitinizes kBa, hvilket fører til kBa nedbrydning. Dette stimulerer frigivelsen og transport af NF-KB til kernen, hvor det binder sig til DNA, aktiverer caspase spaltning og initierer apoptose.

Tak

Vi takker Dr. Claudia Buehnemann ( University of Oxford, UK) for hendes fremragende teknisk bistand.