Abstrakt
På trods af den øgede forståelse for kolorektal cancer og indførelsen af målrettede medicinsk behandling, den metastatiske fase af sygdommen forbliver refraktære over for behandling. Siden dereguleringen af normal apoptose bidrager til patogenesen af colorektal cancer, blev hidtil ukendte nucleosidanaloger syntetiseret her og evalueret for deres evne til at inducere apoptose og forårsage celledød i to kolorektale adeno-carcinom-cellelinier, Caco-2 og HT-29. Tre hidtil ukendte nucleosidanaloger vurderes her viste cytotoksiske aktivitet, som målt ved MTT-assayet mod begge cellelinier: IC
50 værdier varierede mellem 3 og 37 uM, med Caco-2-celler er mere følsomme end HT-29-celler. Sammenlignet med camptothecin, den positive kontrol, de nukleosidanaloger var betydeligt mindre toksiske for normale stimulerede leukocytter (
s
0,05). Endvidere nucleosiderne kunne inducere apoptose som målt ved en stigning i caspase 8 og caspase 3-aktivitet over for kontrollen. Dette blev desuden understøttet af data fra Annexin V-FITC-analyser. Trods marginale ændringer i mitochondriemembranpotential, alle tre nucleosider forårsagede en signifikant stigning i cytosolisk cytochrom c (
s Restaurant Accepteret: September 1, 2015; Udgivet: 21 September, 2015
Copyright: © 2015 Harmse et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle data er indeholdt i manuskriptet og støtte oplysninger
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Research nicheområder Program for National Research Foundation (NRF) i Sydafrika og University of the Witwatersrand Fakultet Forskningsudvalget Health Sciences . JLP blev støttet af NRF Knappe Skill Program for studier i retning af en Ph.D. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling, analyse, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes
Introduktion
Der er sket betydelige fremskridt i forståelsen af de molekylære mekanismer, der ligger kolorektal cancer. Men på trods af målrettet medicinsk behandling, forbliver kolorektal cancer forbundet med en dårlig prognose. Mens stoffer som bevacizumab har forbedret overlevelsen periode for metastatisk sygdom ud over 20 måneder, har de ikke været i stand til at påvirke en kur. For nylig har kliniske studier vist, svigt af tyrosinkinaseinhibitorer såsom sunitinib, hvilket medførte en stigning i sværhedsgrad og forekomsten af alvorlige bivirkninger med minimal terapeutisk fordel [1]. Derfor er forskning i effektive midler til behandling af fremskreden kolorektal cancer er fortsat en prioritet.
Talrige undersøgelser har vist, at den normale apoptotiske proces er dysfunktionel i kolorektal cancer [2-5]. Dysregulering af apoptose bidrager til udviklingen af resistens over for kemoterapi og en dårlig prognose [6]. Apoptose, som først beskrevet af Kerr i 1972 [7], er kendetegnet ved en række morfologiske ændringer, herunder plasma membranblæredannelse, chromatinkondensering, nuklear fragmentering og dannelse af apoptotiske legemer. Kendetegnende for apoptose indbefatter eksponering af phosphatidylserin på den ydre blad af plasmamembranen [8 9], ændringer i mitochondriemembranpermeabilitet [10] og frigivelse af cytochrom c fra den mitokondriske inter-membran rum, med efterfølgende aktivering af effektor caspaser [11].
Apoptose er afgørende for reguleringen af normal celle omsætning af tarmens epitel. Men i colorektal cancer, er både den ydre og de iboende apoptotiske veje kompromitteret begunstige proliferationen af neoplastiske celler. I colorektal cancer, trods FAS receptorekspression, celler er resistente over for FAS ligand-medieret apoptose indikerer en defekt i FAS-medieret signalering [12]. TNF apoptoseinducerende ligand (TRAIL) receptormedieret apoptose normalt opreguleret i cancerceller; men i kolorektal cancer, er blevet observeret resistens over for TRAIL receptormedieret apoptose [13]. P53 tumorsuppressorgen produkt muteret eller fraværende i 85% af colorektale cancere. Denne transkriptionsfaktor er essentiel for aktiveringen af den indre apoptotiske vej samt ekspressionen af cyclin-afhængig kinase inhibitor p21
WAF1 /Cip1. Celler, der er defekte i p53 har nedsat niveau af apoptotiske proteiner, derved begunstiger proliferationen af neoplastiske celler [14].
Kemoterapeutiske midler, der er i stand til at inducere apoptose er gavnlige, da de medfører død af cancerceller uden udløser den inflammatoriske respons og tumorlysesyndrom forbundet med nekrose. Nukleosidanaloger anvendes i vid udstrækning til behandling af cancer og administrere virale infektioner som herpes og HIV. Lægemidler, der tilhører denne klasse er kendt for at inducere apoptose i de kræftformer, hvor de er effektive [15].
I den foreliggende undersøgelse, blev hidtil ukendte nucleosidanaloger screenes mod to colon cancercellelinjer, at undersøge både deres cytotoksiske virkninger og deres potentiale til at fremkalde apoptose. Vi viste, at trods viser relativt høje IC
50 værdier som bestemt ved MTT cytotoksicitet assay nogle nukleosidanaloger var sammenlignelige med camptothecin med hensyn til deres evne til at inducere apoptose. Desuden forbindelser inducerede en usædvanlig mitokondrie reaktion, som kan give yderligere fingerpeg til de underliggende apoptotiske abnormiteter i kolorektal cancer.
Materialer og metoder
Cell kultur
HT-29 (HTB -38 ™) og Caco-2 (HTB-37 ™) humane kolorektale cancercellelinjer opnået fra ATCC, blev dyrket i lav glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), som indeholdt 5% varmeinaktiveret føtalt kalveserum. Dyrkningsmedium og føtalt kalveserum blev opnået fra Highveld Biologicals, Sydafrika. Celler blev dyrket i 75 cm
2 dyrkningskolber og inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO
2. Begge cellelinier blev videredyrket når de nåede konfluens. Kort beskrevet blev cellerne vasket to gange med 10 ml phosphatpufret saltopløsning efterfulgt af tilsætning af 4 ml trypsin og inkubering ved 37 ° C i 10 minutter. Løsnede celler blev podet til den samme kolbe. Camptothecin (Sigma), en kendt inducer af apoptose, og en inhibitor af topoisomerase-1, blev anvendt som en positiv kontrol i alle eksperimentelle procedurer.
Vurdering af cellernes levedygtighed
Vurdering af test nukleosid cytotoksicitet blev udført af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl- tetrazoliumbromid, (MTT), assay (Sigma). Den trypanblåt (Sigma) udelukkelse assay blev anvendt til at vurdere levedygtigheden af cancercellerne før udpladning celler for nukleosid cellelevedygtighedsassays. Celler blev podet i 96-brønds plader ved en celledensitet på 9 000 celler /brønd, fik lov til at klæbe til vækst overflade i 4 timer og derefter udsat for testen nucleosider i 48 timer ved koncentrationer på mellem 1 og 120 uM. MTT-assayet blev i det væsentlige udført som beskrevet af Mossman [16] med undtagelse af opløsning formazankrystallerne i DMSO. Kort fortalt, efter inkubation med MTT, 100 pi medium blev erstattet med DMSO for at lette opløseligheden af formazankrystallerne. Absorbansen af de solubiliserede formazankrystaller blev målt ved 540 og 690 nm med en Labsystems IEM-pladelæser. Data blev opnået fra eksperimenter, der blev gentaget mindst tre gange, med hvert datapunkt bestemmes firdobbelt. S-formet dosis-respons kurver blev konstrueret med GraphPad Prism version 5.
Isolering af humane perifere leukocytter
Tilladelse til at isolere humane leukocytter fra raske frivillige blev opnået fra den menneskelige etiske komité for Det Naturvidenskabelige Health Sciences, University of the Witwatersrand (clearance nummer, M070519). Skriftlig, blev informeret samtykke fra hver donor opnået for det eksperimenterende brug af hans /hendes leukocytter i forskningen. Perifere leukocytter fra en enkelt donor blev isoleret fra blod opsamlet i et hepariniseret rør. Røde blodlegemer blev lyseret selektivt ved hjælp af Versagene Blood DNA Kit (Gentra Systems). Frisk fremstillet leukocytter blev anvendt til at bestemme nukleosid toksicitet til normale celler. Leukocytterne blev overført til RPMI (Highveld Biologicals) dyrkningsmedium suppleret med 2 mM glutamin (Sigma) og 10% føtalt kalveserum (Separations). Efter høst af leukocytter, blev deres levedygtighed bestemt af Trypan Blå udelukkelse assay, før de blev udsat for testen nukleosider i 24 timer.
Vurdering af apoptose
Induktion af caspase 3 og caspase 8-aktivitet.
caspase 3 og caspase 8 specifikke kolorimetriske assays, nemlig CPP32 og FLICE, blev anvendt til måling caspaseaktivitet som pr fabrikantens protokol (BioVision Research Products). Niveauet af caspaseaktivitet i cellelysaterne var direkte proportional med absorbansen af
s
nitroanilin (pNA) målt ved 405 nm i en Labsystems IEM Multiscan pladeaflæser. Celler blev podet i plader med 6 brønde ved en densitet på 50 000 celler pr brønd og fik lov at vokse i 18 timer før behandling med nucleosider. Proteinindholdet blev standardiseret i alle prøver. Caspase 3 og caspase 8 aktivitet blev målt efter forskellige eksponeringsniveauer perioder af cellerne til test- nukleosider, typisk ved 2, 4, 8, 12, og 24 timer efter tilsætningen af nucleosider til de dyrkede celler.
måling af mitochondriemembranpotential.
kationiske farvestof 5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodid (JC-1) er selektive for mitokondrier og dets iboende fluorescens gør det nyttigt at måle den elektrokemiske gradient, der eksisterer på tværs mitokondriemembranen. Protokollen blev fulgt som pr producentens specifikationer (BD Pharmingen). JC-1 farvestof akkumuleres i mitokondrierne af sunde celler som fluorescerende røde aggregater. Celler blev podet i plader med 6 brønde ved en densitet på 50 000 celler pr brønd og lodes vokse til næsten konfluens før behandling med nucleosider. Flowcytometri, med excitation /emission filtre af 485/540 nm (grøn fluorescens) og 540/590 nm (rød fluorescens), blev anvendt til at måle effekten af test- nukleosider på mitochondriemembranpotential. Mitokondrierne indeholdende røde JC-1 aggregater i raske celler blev påvist i FL-2 kanal (øvre port i scattergraphs), hvorimod der ikke blev detekteret grønne JC-1 monomerer i apoptotiske celler i FL-1 kanal (lavere gate i scattergraphs ).
måling af mitokondrie og cytoplasmatisk cytochrom c.
det humane cytochrom c Titerzyme Enzyme immunometrisk assay (Assay Designs Inc.) blev anvendt til at måle koncentrationen af cytochrom c i mitokondrie og cytoplasmatiske fraktioner af celler udsættes for test nukleosider. Celler blev podet i plader med 6 brønde ved en densitet på 50 000 celler pr brønd og fik lov at vokse i 18 timer før behandling med nucleosider. De behandlede celler blev høstet og skyllet med iskold phosphatbufret saltvand. Den cytosoliske fraktion blev opnået ved at resuspendere cellepelleten med en celle permeabilisering puffer, (250 mM sucrose, 137 mM NaCl, 70 mM KCI, 4,3 mM Na
2HPO
4, 1,4 mM K
2HPO
4, 0,2 mg /ml Digitonin og 0,1% Hydorol M), som leveres i mitokondrie isolation kit, (Assay Designs Inc.), der har forladt mitokondrierne intakte. Dette blev efterfulgt af centrifugering for at adskille den cytosoliske fraktion og til pelletering mitokondrier. Mitokondrier blev derefter lyseret med RIPA-buffer, der består af 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat og 0,1% SDS.
Bestemmelse af apoptose som målt ved annexin V-assayet.
Phosphatidylserin (PS) translokation til den ydre cellemembran blev bestemt ved fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket annexin V. Flowcytometrisk analyse med FITC-mærket annexin V og propidiumiodid blev udført ifølge producentens protokol (BD Pharmingen), på celler udsat for 100 pM af hver af de test-nukleosider eller camptothecin i 24 timer. Celler blev podet i plader med 6 brønde ved en densitet på 50 000 celler pr brønd og lodes vokse til næsten konfluens før behandling med nucleosider. Cellefarvning blev vurderet ved anvendelse Annexin V-FITC (grøn fluorescens) samt et farvestof udelukkelse af propidiumiodid (PI) (negativt for rød fluorescens), optagelse mindst 10
4 begivenheder. Efter eksponering for test- nukleosider, blev cellerne høstet og analyseret ved flowcytometri på en BD LSR II flowcytometer. Dataene blev afbildet som en scattergraph med FITC-Annexin V (grøn fluorescens) repræsenteret på X-aksen
versus
PI (rød fluorescens) på Y-aksen.
Caspase 9-aktivitet.
Caspase 9-aktivitet blev bestemt med Abcam® Caspase 9 aktiv FITC-farvning kit. Caspase 9 selektiv inhibitor LEHD-FMK konjugeret til FITC trænger levende celler til at binde til aktiv caspase 9 på en irreversibel måde. Celler blev podet på sterile dækglas (50 000 pr dækglas) lov til at klæbe i fire timer og udsat for test nukleosider og camptothecin, henholdsvis for 24 timer. Derefter blev cellerne vasket med PBS og derefter inkuberet med substratet ved 37 ° C i en time. Objektglas blev vasket i PBS og ses på et Olympus BX41 epifluorescensmikroskop. Billeder blev taget med et Olympus DP72 kamera og analyseret med Olympus CellSens Software pakke. Celler med aktiveret Caspase 9 skærm en lys grøn fluorescens.
Vurdering af HT-29 og Caco-2 cellemorfologi
Effekten af nukleosider på cellemorfologi blev vurderet ved fasekontrast og fluorescens mikroskopi . For fasekontrastmikroskopi blev celler dyrket i 6 brønds kulturplader (50 000 celler pr brønd), fik lov til at klæbe natten over og derefter udsat for nukleosider for forskellige tidsperioder. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange. Celler blev observeret med et Olympus CKX41 omvendt mikroskop og billeder blev taget med et Olympus DP21 kamera. Cellemorfologi blev yderligere bedømt med Hoechst 33342 (Life Technologies) og acridinorange (Life Technologies) fluorescerende farvestoffer. Celler blev dyrket på varme steriliseret dækglas og udsat for test nukleosider i varierende koncentrationer. Anvendelse af de passende filtre blev celler observeret med et Olympus BX41 epifluorescensmikroskop. Billeder blev taget med et Olympus DP72 kamera og analyseret med Olympus CellSens softwarepakken.
Vurdering af Bcl-2 og Bax udtryk
Udtrykket og cellulære placering af både Bcl-2 og Bax i HT-29 og Caco-cellelinjer blev bestemt ved immunfluorescens mikroskopi. Celler blev dyrket på dækglas (50 000 celler pr dækglas), fik lov til at adhærere natten og udsat for testen nukleosider og camptothecin i 6 timer. Efter skylning med PBS blev cellerne fikseret med 3% formaldehyd i PBS i 20 minutter. Cellerne blev skyllet og permeabiliseret i 5 minutter med 0,25% Triton X100, fremstillet i PBS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Efter permeabilisering blev celler blokeret med 1% (BSA) i PBS i 1 time. Derefter blev cellerne vasket og inkuberet natten over med de respektive primære antistoffer (Bcl-2 eller Bax i PBS med 0,5% BSA) ved 4 ° C. Muse-anti-Bcl-2 og muse-anti-Bax blev opnået fra BioVision og anvendes i en koncentration på 10 mg /ml. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med arter kompatible Alexa-fluor 568 (Abcam) sekundært antistof. FITC-konjugeret phalloidin, (Abcam), blev anvendt til at visualisere cytoskelettet og kernerne blev visualiseret med Hoechst 33342 farve som tidligere beskrevet. Cellerne blev vist ved hjælp af et Olympus BX41 epifluorescensmikroskop med de passende filtre for hver fluorokrom. Billeder blev taget med et Olympus DP72 kamera og analyseret med Olympus CellSens softwarepakken.
Evaluering af celler til induktion af autophagy
Celler blev dyrket på sterile dækglas i 6 brønde 9 (50 000 celler pr dækglas) lov til at klæbe natten over og behandlet med 50 pM af test nukleosider. Chloroquin (50 uM) blev anvendt som en positiv kontrol, da det er kendt for at forårsage omfattende autophagic vacuole dannelse [17, 18]. Celler blev udsat for testforbindelserne chloroquin og camptothecin i 3 timer, vasket med PBS og derefter inkuberet ved 37 ° C med 50 pM monodansyl-cadaverin (MDC) (Sigma), i PBS i 15 minutter [19, 20, 21]. Camptothecin blev inkluderet som en negativ kontrol for vakuole dannelse, da det undlod at forårsage vakuolen dannelse i de to cellelinjer. Dækglas blev skyllet med PBS og de levende celler blev set under Olympus BX41 epifluorescensmikroskop. Billeder blev taget med et Olympus DP72 kamera og analyseret med Olympus CellSens softwarepakken.
Nukleosid testforbindelser
Romanen nukleosidderivater, nukleosid 1, 2 og 5 evalueret i denne undersøgelse blev syntetiseret i School of Chemistry, University of the Witwatersrand, og karakteriseret ved en
H og
13C NMR, IR og HRMS spektroskopi. De blev syntetiseret ud fra en række forskellige udgangsmaterialer købt hos Sigma-Aldrich ifølge modificerede fremgangsmåder beskrevet i Sproat, 1994 [22]. Nukleosid 2 er en kendt forbindelse og spektre fra de to andre forbindelser er tilgængelige fra forfatterne. Stamopløsninger (20 mM) af test nukleosider blev udarbejdet i vævskulturkvalitet DMSO.
Dataanalyse og statistik
Alle data blev analyseret og dosisresponskurver konstrueret ved hjælp Graph-Pad Prism-version 5. Forskelle mellem kontroller og nukleosid behandlede prøver blev testet for signifikans med Prizm3 Instat softwarepakke, ved anvendelse af variansanalyse (ANOVA) og studerendes-t-test med et signifikansniveau tærskel på
s
0.05.
Resultater
Nukleosidanaloger er cytotoksiske for HT-29 og Caco-2 celler
Tre nye pyrimidin ribonukleosid analoger blev identificeret i en procedure tyve tre nye nukleosider screening som havende cytotoksisk aktivitet mod både HT-29 og Caco-2 cellelinjer når de testes ved en koncentration på 100 uM. Strukturerne af de tre aktive nukleosider er vist i fig 1A. Nukleosid 1 og 2 var uridin analoger og nukleosid 5 var en cytidinanalog. De pyrimidinbaser var forbundet via en
N
-glycosidic obligation til kulstof 1 i ribose sukker. Alle tre molekyler blev substitueret med voluminøse phenylgrupper på carbon 5 i ribose sukker. Nukleosid 1 havde en C-O-binding med en 4,4-dimethoxytritylgruppe og nukleosider 2 og 5 var forbundet med en tert-butyldiphenyl gruppe via en stabil Si-O-bindingen. De nukleosider blev vilkårligt nummereret 1-23 og test nukleosider nummer et, to og fem blev fundet at være aktiv i de indledende screening-assays.
halvtreds procent hæmmende koncentration (IC
50 ) værdier blev opnået for de tre aktive nukleosider og er vist i fig 1B. De to cellelinier viste differentiel følsomhed over for de tre aktive testforbindelser og til camptothecin. HT-29-celler var mere følsomme over for camptothecin end Caco-2-celler, med en IC
50 værdi på 5,7 uM i forhold til 10,6 uM. Nukleosid 5 var den mest effektive mod HT-29-celler med en IC
50 værdi på 3,4 uM og viste lignende aktivitet til Caco-2-celler med en IC
50-værdi på 4,8 uM. I HT-29-celler, nukleosid 1 og 2 havde IC
50 værdier 6.4 og 3.4 gange højere end den for camptothecin, viser IC
50 værdier på 36,3 og 19,1 uM. Dette er i modsætning til de Caco-2-celler, hvor nukleosid 1 havde lignende aktivitet som camptothecin og nukleosid 2 var 3 gange mere aktiv end camptothecin, med en IC
50 værdi på 3,5 uM. Repræsentativ dosis-respons-kurver er vist i S1 Fig
Eksponering af frisk isolerede leukocytter til hver af de tre nukleosidanaloger og camptothecin, angivet henholdsvis at nukleosid 2 havde den største inhiberende virkning på leukocytterne, hvilket medfører et fald 38,5% af leukocyt levedygtighed i en koncentration på 100 uM. Dette var to gange lavere end effekten af camptothecin på leukocytterne. Nukleosid 1 og nukleosid 5 var den mindst toksiske for leukocytter med cellelevedygtighed holdes på 82,7% og 99,9%, henholdsvis (se fig 1C).
Nucleosides inducerer caspase 8 og caspase 3-aktivitet
caspase 8 er en initiator caspase som forårsager spaltning og aktivering af effektorceller caspaser, såsom caspase 3. fig 2 viser caspase 8 og caspase 3-aktivitet bestemmes med forskellige tidsintervaller, efter tilsætning af forsøgsforbindelserne nucleosider, at begge cellelinier. De tre nucleosider forårsagede en stigning i caspase 8 og caspase 3-aktivitet i begge cellelinier i forhold til den negative kontrol. Men med undtagelse af nukleosid 2, caspase aktivitet var ikke så høj som den, der induceres af camptothecin. Nukleosid 2 var den mest effektive inducer af caspaseaktivitet i begge cellelinier, induktion caspase 8 og 3-aktivitet til et lignende niveau som camptothecin. I begge de HT-29 og Caco-2-cellelinier, induktion af maksimal caspase 8 og 3-aktivitet tog længere tid at opnå (12 timer i modsætning til 2-4 timer). Vigtigt er det, at aktiviteten af begge caspaser faldt i et langsommere tempo end de camptothecin behandlede celler, forbliver højere end camptothecin efter 24 timers eksponering.
Nukleosider have minimal indvirkning på mitokondrie membran potentiale (A ^ m )
ATm blev målt ved flowcytometri med det kationiske fluorescerende farvestof JC-1. Procentdelene af ATm i nukleosidet behandlet HT-29 og Caco-2-celler sammenlignet med de negative og positive kontrolceller er opsummeret i tabel 1. I forhold til den negative kontrol, i HT-29-celler, nukleosid 2 og 5 havde en marginal ( 3%) effekt på A ^ m. Nukleosid 1 behandling resulterede i 4% af celler med en reduceret ATm over det for kontrollen. I modsætning hertil camptothecin-behandlede celler havde 34,8% af celler med en reduceret ATm sammenlignet med kontrollen. I de Caco-2 celler, nucleosider 1 og 5 påvirket omkring 17% af celler, hvilket resulterer i et fald i ATm, mens nukleosid 2 havde en marginal virkning ( 3%) over det for kontrollen. Dette er i modsætning til camptothecin som forårsagede 34,6% celler med en A ^ m i Caco-2-celler. Scattergraphs er vist i supplerende S2 Fig.
Nukleosider ændre intracellulær cytochrom c fordeling
I celler, mellem 90 og 100% af den samlede cellulære cytochrom c er normalt placeret inden for mitokondrier. Fig 3A og 3B viser, at test nukleosider øget cytosolisk cytochrom c-fraktion til begge cellelinier i forhold til den negative kontrol, men ikke i samme omfang som camptothecin. I HT-29-celler, nukleosid 2 forårsagede den højeste procentdel af cytochrom c til at flytte til cytosolen (75,35 ± 1,15%), omend lavere end camptothecin (85.19 ± 1,54%). Nukleosider 1 og 5 forårsagede nogle 68,22 ± 0,62% og 70,42 ± 0,62% af cytochrom c til at flytte til cytosolen, hhv.
Cellerne blev udsat for 100 uM nukleosid 1, 2, 5 og camptothecin, henholdsvis , i 24 timer. Søjlerne repræsenterer middelværdien ± SEM fra tre Elisa analyser udført for hvert nukleosid.
I de Caco-2 celler, nukleosid 5 forårsagede den højeste procentdel af cytochrom c til at flytte til cytosolen (70,42 ± 1,76%), hvilket er lavere end den for camptothecin (86,94 ± 1,72%). Virkningerne af nucleosider 1 og 2 var sammenlignelige med nukleosid 5 med cytosoliske cytochrom c fraktioner af 63,87 ± 2,03% og 68,23 ± 0,62% hhv. Resultaterne indikerer således, at behandling med nukleosidanaloger forårsagede et fald i mitokondrie cytochrom c og ledsagende stigning i cytosolisk cytochrom c.
Annexin V bindende stigninger i HT-29 og Caco-2 celler
den flowcytometriske assay for annexin V-FITC, viser, at apoptose blev induceret efter tilsætning af de aktive nukleosidanaloger til begge cellelinier, som vist i tabel 2 og S3 fig. Efter 24 timers eksponering for nukleosid analoger eller camptothecin, der var primært to populationer af celler: levedygtige, ikke-apoptosing celler (annexin V-FITC og PI negative) og celler undergår apoptose (annexin V-FITC positive og PI negativ). Der blev observeret en lille population af celler til at være annexin V-FITC og PI positiv, hvilket indikerer, at de var i slutstadiet apoptose eller nekrose.
Den procentdel af hver delpopulation af celler i begge cellelinier udsat til nukleosidanaloger er vist i tabel 2. i de HT-29-celler, nukleosid 1 var den mest effektive apoptotiske inducer, med 38,4% af cellerne, der detekteres i tidlig apoptose og 5,9% af celler i sene apoptose /nekrose. Mens overlegen i forhold til camptothecin for tidlig apoptose, alligevel forårsagede camptothecin behandling nogle 19,6% af celler til at skifte til sen apoptose /nekrose. Dette indikerer, at camptothecin var i stand til at inducere apoptose i et hurtigere tempo end nucleosiderne. Nukleosid 2 behandling resulterede i 20,5% af celler bliver i begyndelsen af apoptose og 10,6% i slutningen af apoptose. Nukleosid 5 havde 22,2% celler i tidlig apoptose og 2,3% celler i sen apoptose /nekrose.
Virkningerne var forskellige i Caco-2-celler, udviste alle tre nucleosider en tilsvarende andel af levedygtige celler, der spænder fra 61 til 66,3%. Nukleosid 5 var den mest effektive med 30,9% af celler, der detekteres i tidlig apoptose og 4,8% i slutningen af apoptose eller nekrose, hvorimod efter nukleosid 1-behandling, 17,4% af cellerne var i tidlig apoptose og 14,8% i slutningen af apoptose. Nogle 21,7% celler blev påvist i tidlig apoptose og 11,4% af cellerne i slutningen apoptose /nekrose efter nukleosid 2 behandling. Scattergraphs er vist i S3 Fig.
De nukleosider inducerer ikke caspase 9-aktivitet
evnen hos test nucleosider til at stimulere caspase 9-aktivitet blev bestemt efter celler blev udsat for 50 uM af hvert nucleosid i 24 timer. Camptothecin (20 uM) blev anvendt som en positiv kontrol og var i stand til at stimulere caspase 9-aktivitet, i modsætning til de tre nucleosider som vist i S4 Fig.
Nucleosides påvirker ikke ekspressionen af Bcl-2 og Bax
for at få mere information om en omfordeling af cytochrom c til cytoplasmaet uden en fremtrædende ændring i mitochondriemembranpotential, undersøgte vi udtrykket af Bd-2 og Bax i HT-29 og Caco-2 celler linjer og deres reaktion på nukleosid behandling. Celler blev udsat for 50 uM nucleosider i 6 timer.
Bcl-2 er stærkt udtrykt og associeret med kernen i begge HT-29 og Caco-2-celler.
I ubehandlet og behandlet HT -29 celler blev Bcl-2 udtrykkes med et stærkt fluorescerende signal og tilknyttet kernen (S5 fig). Dette blev bekræftet ved at sammenlægge Hoechst og Bd-2 billeder, som præsenterede en lyserød sammenflettede billede indikerer co-lokalisering af de to fluorokromer. Udsættelse for test nukleosider havde ingen åbenlys effekt på Bcl-2 ekspressionsniveauerne eller dets subcellulære fordeling. Caco-2-celler på samme måde, havde en overvejende nuklear fordeling af Bcl-2. Men nogle celler udsendte en meget svagere signal end andre (S6 Fig). Eksponering for nukleosid 1 og 2 forårsaget minimal omfordeling af Bcl-2 til den perinukleære rum, som ikke er observeret med nukleosid 5 behandling.
Bax er dårligt udtrykt i HT-29 og Caco-2-celler med en perinukleær fordeling.
HT-29 kontrolceller, Bax blev tyndt associeret med kernerne med en fremherskende perinukleær fordeling (S7 fig). Hoechst /Bax fusionerede billeder støtter den observation, at Bax har en perinukleær fordeling. Noteably, fluorescensintensiteten af Bax var meget lavere end den af Bcl-2 angiver forholdsvis lavere ekspressionsniveauer. Udsættelse for de tre nucleosider viste en lille stigning i Bax fluorescens sammenlignet med den for kontrollen. Derudover behandling med nukleosid 5, forårsagede en polariseret nuklear gruppering af Bax (S7 Fig). Hoechst /Bax fusionerede billede viser en stigning i lyserød fluorescens indikerer en forøget sammenslutning af Bax med kernen.
Ekspression og cellulære fordeling af Bax var ens i Caco-2-celler (S8 Fig). Bax-ekspression var lav i Caco-2-celler og billeder måtte forbedres for at vise den subcellulære fordeling. Det var derfor ikke muligt at afgøre, om de nukleosider havde en direkte virkning på Bax ekspressionsniveauerne eller dets subcellulære fordeling i Caco-2 celler.
Virkninger af nukleosider på cellemorfologi
Hoechst farvning identificerer apoptotiske kerner. Salg
i HT-29-celler, både nukleosid 1 og 2 var i stand til at inducere apoptose, hvilket afspejles af den specifikke farvningsmønster nukleare (angivet med en fast /blok pilen i fig 4). Kernerne i ubehandlede kontrolceller var typisk oval form, farvning blå med en ensartet fordeling af farvestoffet. I modsætning hertil nukleosid 5 behandlede celler, der forblev fastgjort til væksten overflade efter 20 timer, demonstrerede uregelmæssigt formede kerner (figur 4), hvilket indikerer, at cellekernen kan være en målværdi. Desuden viste disse celler en høj grad cytoplasmatisk vakuolisering (figur 4), hvilket indikerer en omfattende cytoplasmatisk virkning.
Celler blev eksponeret for 50 uM nukleosid 1, 2 og 5 i 24 timer og farvet med Hoechst 33342 farve . Scalebar: 20 pm
Ubehandlede Caco-2 celler viste den typiske ovale nukleare struktur med endnu farvestof fordeling, når farves med Hoechst (figur 5)..
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.