PLoS ONE: Morfologiske Forskelle mellem Cirkulerende tumorceller af prostatakræft Patienter og kulturperler prostatakræft Cells

Abstrakt

Cirkulerende tumorceller (CTC) opregning tegner til at blive en vigtig indikator for kliniske resultater for en række kræftformer. Etablerede CTC tælling metoder sig primært på affinitet indfangning af celleoverfladeantigener, og er blevet kritiseret for undervurdering af CTC-numre på grund af antigen bias. Emerging CTC capture strategier typisk skelne disse celler baseret på deres formodede biomekaniske egenskaber, som ofte validerede anvendelse af dyrkede cancerceller. I denne undersøgelse, udviklede vi et software-værktøj til at undersøge de morfologiske egenskaber CTCs fra patienter med kastrationsniveau resistent prostatacancer og dyrkede prostata cancer celler for at fastslå, om sidstnævnte er en passende model for det tidligere. Vi isolerede både CTCs og dyrkede kræftceller fra fuldblod ved hjælp af CellSearch® systemet og undersøgt forskellige cytomorphological karakteristika. I modsætning med dyrkede kræftceller, blev CTCs beriget af CellSearch® systemet sig at have betydeligt mindre størrelse, større nukleare-cytoplasmatisk forhold, og mere aflang form. Disse CTCs blev også fundet at udvise betydeligt mere variation end dyrkede kræftceller i nuklear-cytoplasmatisk forhold og form profil

Henvisning:. Park S, Ang RR, Duffy SP, Bazov J, Chi KN, Sort PC, et al. (2014) Morfologiske Forskelle mellem Cirkulerende tumorceller fra prostatakræft Patienter og kulturperler Prostata Cancer Cells. PLoS ONE 9 (1): e85264. doi: 10,1371 /journal.pone.0085264

Redaktør: David T. Eddington, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: 13 juli, 2013; Accepteret: November 25, 2013; Udgivet: 8. januar 2014

Copyright: © 2014 Park et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Natural Science and Engineering Research Council of Canada, canadiske Institutes of Health Research, prostatakræft Canada, Vancouver Prostata centrets Translationel Research Initiative for Accelerated Discovery og Udvikling, Ingeniører-i-Scrubs træningsprogram på UBC, Terry Fox Research Institute og en pris fra Movember globale handlingsplan (GAP) Prostata Cancer Biomarkør Initiative. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne bekræfter, at medforfatter Peter Black er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Cirkulerende tumorceller (CTCs) har været impliceret som potentielle frø af kræft metastaser og er derfor af stor betydning i forskning, sygdomsbehandling, og udvikling af lægemidler [1] – [3]. Etablerede fremgangsmåder til at opfange disse celler, såsom Veridex CellSearch® systemet (Raritan, NJ, USA), er afhængige af affinitetsindfangning af epitelcelle overfladeantigen, EpCAM, efterfulgt af fluorescens mærkning af intracellulær cytokeratin (CK) [4] – [ ,,,0],6]. Mens CTC identifikation og tælling, baseret på epitel biomarkør udtryk, kan anvendes til at forudsige dårlig klinisk resultat [7] – [10] Denne strategi kan være tilbøjelige til undervurdering af CTC antal på grund af epitel-til-mesenchymal overgang [11] – [ ,,,0],14], dårlig udtryk for disse faktorer i nogle tumortyper [14], eller ændringer i ekspressionen af ​​disse faktorer efter kemoterapi [15]. Disse begrænsninger kan være særligt relevant, da forekomsten af ​​mesenkymale CTCs er associeret med sygdomsprogression [16] og medtagelse af yderligere kriterier CTC identifikation kan være et værdifuldt supplement til konventionel CellSearch® CTC tælling.

Ud til deres ekspression af tumorantigener, er det bredt accepteret, at CTCs har distinkte biomekaniske egenskaber, herunder større størrelse end leukocytter, større kerne og cytoplasma (N: C) forhold, såvel som forskellig cellekernemorfologi [17]. Talrige strategier er blevet udviklet til berige for CTCs baseret på disse karakteristika [18]. CTCs er blevet isoleret ved anvendelse af densitetsgradientcentrifugering [19] eller ved størrelse under anvendelse af mikropore filtrering [20] – [22]. For nylig er mikrofluide teknologier opnået overlegen CTC fangsteffektivitet og berigelse under anvendelse tilgange såsom hydrodynamisk chromatografi [23] – [28], mikrofluid filtrering [29] – [31], og dielektroforese [32] – [35]. Udviklingen af ​​disse teknologier anvendes typisk dyrkede kræftceller som en morfologisk model for kliniske CTCs. Men mens cancerceller og nogle CTCs har fælles biofysiske egenskaber [17], kan CTCs udviser distinkte morfologiske karakteristika, afhængigt af typen af ​​tumor oprindelse [36]. En alternativ strategi ville være at inkorporere biomekaniske karakterisering med den mere etablerede antigen-baserede CellSearch® CTC tælling strategi.

Vi udviklede et software-værktøj til at analysere de cytomorphological egenskaber kræftceller. Vi beskæftigede dette værktøj til at undersøge både patient CTC og model kræft cellelinje morfologi, efter CellSearch® berigelse. Disse resultater giver vigtige data til støtte i CTC identifikation baseret på kombineret antigen og biomekaniske kriterier [36] samt i at vælge passende modeller for optimering af biomekaniske CTC berigelse.

Materialer og metoder

Blood Prøvetagning

Blodprøver fra raske donorer og patienter med metastatisk kastrationsniveau resistent prostatacancer (CRPC) blev opnået med skriftligt informeret samtykke og opsamles ved hjælp af protokoller godkendt af UBC Clinical Ethics Review board (http: //forskning. ubc.ca/ethics/clinical-research-ethics-board). De CRPC patienter inkluderet i dette studie var i alderen fra 53-83 år, og PSA niveauer, fra 21,1 til 2200 ug /L (tabel S1). Blodprøver i begge tilfælde indsamles og lagres i CellSave® vakuumbeholderrør (Becton Dickinson, Raritan, NJ).

Isolering og tælling af CTCs ved CellSearch

CTCs isolation og tælling blev udført ved hjælp af CellSearch® systemet som tidligere beskrevet [4], [5], [37]. Kort fortalt blev der udtaget blodprøver i 10 ml CellSave Vacutainer-rør (Becton Dickinson) indeholdende proprietære antikoagulerende og konserveringsmiddel. Prøver blev holdt ved stuetemperatur og behandles inden for 48 timer efter indsamling. Den CellSearch® opfanger EpCAM-udtrykkende celler under anvendelse af antistof-coatede magnetiske perler og derefter mærker disse celler med fluorescerende farvestoffer, såsom DAPI, CD45, og cytokeratiner, for at skelne potentielle CTCs fra leukocytter. Efter immunomagnetisk opsamling og fluorescens farvning, er billeder af kandidat CTCs opnået i lysfelt og tre fluorescens kanaler (DAPI, CD45 og cytokeratiner). De optagede billeder opdelt i flere mindre billeder hver indeholder en enkelt celle og samles igen i et panel i software. Endelig en certificeret tekniker positivt identificerer de CTCs ved at gennemgå den størrelse, form og fluorescens intensiteten af ​​hver kandidat celle

Cell Kultur og Processing

menneskelige prostata cancer cellelinjer herunder LNCaP (ATCC.: CRL-1740), DU145 (ATCC: HTB-81), og c4-2 (ATCC: CRL-1595) blev opformeret i kultur ved anvendelse af RPMI-1640-medium (HyClone, Logan, UT) med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO

2. PC3 (ATCC: CRL-1435) celler blev dyrket på lignende måde, men ved anvendelse af DMEM (HyClone, Logan, UT) medium i stedet. Dyrkede kræftceller blev tilsat til 7,5 ml blod fra en rask donor i CellSave® Vacutainer rør og behandles inden for 48 timer på samme måde som de patientprøver.

Image Processing

At studere morfologi CTCs og dyrkede kræftceller, vi eksporterede billeder af enkelte celler fra CellSearch® systemet og analyseret dem ved hjælp af en software-program, vi udviklet ved hjælp af LabVIEW (figur S1, National Instruments, Austin, TX). Billederne var kvadratiske matricer med størrelser fra 80 til 200 pixels og formateret som Portable Network Graphics (PNG) filer som 8 bit mono eller 24 bit farve kompositter (Figur S1). Til beregnede område i pixels, blev billederne oprindeligt behandles ved hjælp klynge tærskelværdiansættelse at detektere lyse objekter, der svarer til auto-eksponering udføres af CellSearch® (figur 1A). Partikler med pixel i kontakt med kanten af ​​billedrammen blev fjernet under anvendelse af en grænse afvisning partikelfilter for at fjerne celler ufuldstændigt afgrænset af billederne (Figur S1). billeder Multi-partikel blev også elimineret under anvendelse vandskel segmentering. Debris partikler blev fjernet under anvendelse af to-iterationer af en 3 × 3 erosion partikelfilter. Celle og nuklear størrelse blev bestemt ved at tælle antallet af ovennævnte tærskel pixels i cytokeratin og DAPI kanal henholdsvis. Resultater for beregning cellen og nuklear størrelse blev filtreret for at fjerne celler med usandsynlige nukleare størrelser, som vi definerer som det nukleare område på over 95% af celleområdet. Disse bearbejdningstrin afvist 209 ud af 732 billeder eller 28,5% af det samlede. De fleste af de afviste billeder indeholdt celle fragmenter eller dårlig kvalitet billeder (Figur S2).

Labview software udfører række operationer på store varierende magikere datasæt leveret af CellSearch® systemet. To parallelle filtrering og målinger, såsom beregning af område i pixels (A) og estimering af bedst-fit ellipse (B) udføres for optimal ydeevne og resultater.

Excentricitet af Cell Shape Måling

for at analysere excentricitet celleform, en ellipse blev tilpasset til omridset af cellen. Oversigten over estimere bedste tilpasning ellipse hjælp LabView software er vist i figur 1B. For at øge afsløring af cellen omrids, billederne var kontrast-forstærket før auto-tærskling. Tre gentagelser af en 3 × 3 erosion filter, samt en enkelt spile filter blev udført for at udglatte kanterne af partiklerne. Montering blev udført på et binært billede ved hjælp konturen opsporing metode for at søge efter den længste ellipse perimeter i billedet (fig S1). Efter montering af ellipse resultaterne blev visuelt bekræftet af driftslederen. For at kvantificere excentricitet af cellen form, vi beregnet forlængelse faktor (EF), defineret som forholdet mellem de større og mindre akser bedst-fit ellipse.

Size Measurement Kalibrering

Til kalibrere målingerne størrelse fra CellSearch® billeder, vi hver for målte størrelsen af ​​de dyrkede prostata kræftceller i suspension ved hjælp af CEDEX XS filmede-baserede celle analysator (Roche, Tyskland). Grown dyrkede cancerceller trypsiniseres og resuspenderet i dyrkningsmediet. Celletællinger blev evalueret under anvendelse af en 1:01 fortynding af cellesuspension i trypanblåt (Gibco, Grand Island, NY). En 10 pi cellesuspension indlæst på Smart Slide (Roche, Tyskland), og derefter læse at måle cellens diameter. Omregningsfaktoren fra pixel til mikrometer kan bestemmes ved hjælp af følgende ligning,

Størrelsen af ​​CTCs fra patientprøver blev estimeret ved produkter af omregningsfaktoren og område CTCs målt fra CellSearch® billeder.

Nuclear cytoplasmisk Ratio Måling

nukleare cytoplasma ratio defineres som forholdet mellem nukleare område (A

N) til cytoplasmatisk (A

C) område, hvor A

C anses som området af cellen eksklusive A

N.

Sample Selection

CTCs analyseret i denne undersøgelse blev opnået fra baseline blodprøver fra samtykkende patienter diagnosticeret med metastatisk kastrationsresistent prostatacancer, der var kemoterapi-naive og indskrevet på en randomiseret fase II klinisk forsøg med et nyt middel [38]. Vi indsamlede alle de billeder, der viser DAPI + CK + CD45- begivenheder, der blev identificeret ved CellSearch® for de 83 forsøgspersoner indskrevet i forsøget. Baseret på sandsynligheden for, at en lille del af disse begivenheder repræsenterede legitime CTCs vi begrænset vores analyse til 19 patienter, som havde 40 DAPI + CK + CD45- begivenheder. Tre af disse patienter blev yderligere udelukket på grund af lav kvalitet af billeder. CTC tælling blev uafhængigt bestemt for de resterende 16 patienter ved en CellSearch®-kvalificeret tekniker og greverne varierede fra 11 til 106 CTCs /7,5 ml, med en median værdi på 41,5 CTCs /7,5 ml. Efter at have udelukket uegnede billeder (Figur S2), fordi de ikke kunne fortolkes af vores software, blev i alt 523 CTCs fra patienter med prostatacancer analyseret sammen med 800 dyrkede kræftceller fra fire prostata cancer cellelinjer.

Resultater og diskussion

Cell Size

Analyse billeder af celler behandles ved hjælp af CellSearch® systemet og kalibreret mod standard mikroskopi, fandt vi signifikante størrelse forskelle mellem prostatakræft CTCs og dyrkede prostata kræftceller (figur 2 ). Konkret er den gennemsnitlige diameter af CTCs fanget af CellSearch®, blandt vores 16 patienter, er lidt over halvdelen af ​​de dyrkede kræftceller, med 7,97 ± 1,81 um for CTCs og 13,38 ± 2,54 um for dyrkede kræftceller (p 0,001) henholdsvis . Mens Coumans og kolleger [21] ansat en mikropore filtrering strategi for berigelse af både kræft cellelinjer og patient-afledte CTCs, de karakteriseret de biomekaniske egenskaber af den samme EpCAM

+ CK

+ CD45

– CTC befolkning præsenteres i denne undersøgelse. Deres analyse rapporterede, at prostata CTCs var mindre end bryst eller kolorektal kræft, men de anslås, at prostatakræft CTCs var -25% større end vores nuværende rapport. Mens denne uoverensstemmelse kan repræsentere celle stress pålagt i prøve behandling ved immunocapture, i den aktuelle undersøgelse, og mikropore filtrering, i det tidligere, kan denne forskel også være opstået fra de forskellige strategier, til at måle cellestørrelse. Coumans brugt en Coulter pipette for størrelse kalibrering, hvilket var mindre præcis end billedanalyse for skala lille længde ( 10 um) størrelse skøn. Desuden er vores estimat for cellediameter er konsistent med den lille gennemsnitlig cellevolumen rapporteret af Ligthart og kolleger [36], samt en anden nylig undersøgelse viser LNCaP samlede celle område er 1,6 gange større end den for EpCAM

+ CK

+ CD45

– prostatakræft CTCs [39]. Det er også interessant at bemærke, at den optimale porestørrelse anvendt i tidligere undersøgelser til filtrering baseret indfangning af CTCs var 8 um, der falder sammen med vores forventede celle diameter på 7,97 um [21], [22], [29], [40] . Micropore filtrering strategier har rapporteret så højt som 90% CTC genvinding [40], men har relativt dårlig prøve renhed [41] .Den lighed i størrelse mellem CRPC CTCs undersøgt i denne undersøgelse, og leukocytter, kan dette udgøre en grundlæggende begrænsning af filtrering-baserede strategier . Denne begrænsning kan potentielt overvindes ved miljøberigelsesstrategier der kombinerer CTC berigelse baseret på en kombination af cellestørrelse og deformerbarhed [29] – [31].

Den gennemsnitlige diameter CTCs (7,97 um) var signifikant mindre end dyrket kræftceller (13,38 um) (p 0,001)

Vi overvejede også muligheden for vores patient udvælgelseskriterier (CTC tæller 40). kan have forudindtaget for et større antal mindre CTCs. Mens de udvalgte patienter var kemoterapi-negative, ville de have deltaget i en række terapeutiske indgreb og vil repræsentere patienter i de sene stadier af sygdommen. På grund af disse eller andre unikke fysiologiske byrder inden for vores patient kohorte, bør der udvises forsigtighed i generalisere disse resultater til alle CRPC CTCs. Men vi observeret nogen sammenhæng mellem CTC cellestørrelse og celletal (tabel S1 og figur S3), der ellers ville antyde, at sygdommens sværhedsgrad påvirker celle størrelse. Interessant, mens andre undersøgelser har rapporteret en høj grad af heterogenitet i CTC cellestørrelse [21], [36], [42], [43], vores størrelse skøn baseret på mikroskopisk analyse viste, at den inter-variation i den gennemsnitlige celle størrelse var helt små, der spænder fra 7,05 um til 8,94 um med en median på 8,04 um. Endvidere den aktuelt accepteret kriterium, som CellSearch® system til at validere CTCs er, at deres størrelse skal være større end de omkringliggende leukocytter [17]. Imidlertid blev denne størrelse definition stort set bestemt baseret på CTCs afledt af brystcancer [44] – [47], der har en median cellediameter på 13,1 um [21]. Vores observation, at CTCs fra patienter med CRPC er betydeligt mindre i størrelse (~8 um) tyder på, at disse konventionelle kriterier for CTC identifikation kan undervurdere den sande CTC tæller.

På samme måde er vores observation, at prostatakræft EpCAM

+ CTCs er konsekvent mindre end dyrkede kræftceller er potentielt vigtigt for nye label-fri CTC berigelse strategier. For det første kan berigelse af CTCs baseret på størrelse alene har begrænset effekt for opsamling af de mindre CTCs findes i CRPC patienter, fordi de ikke vil være lige så klart discriminable fra patientens leukocytter. Mens større cancerceller typisk anvendes til at påvise effekten af ​​disse teknikker, såsom HELA ( 20 um), LNCaP (18 um), MCF-7 ( 15 um), MDA-231 (15 um) [21 ], [48], [49], dyrkede cancerceller, såsom L1210 muselymfomceller (10 um), med mindre diameter kan udgøre bedre modeller for CTC berigelse [31], [50], [51]. For det andet bidrag nukleoplasma til celle stivhed er 10 gange større end cytoplasmaet [52]; CTC miljøberigelsesstrategier at fange CTCs baseret på størrelse og deformerbarhed kan vise sig at være bedre end dem, den slags baseret på størrelse alene.

celleform

Anvendelsen af ​​dyrkede cancerceller tilsat til blod fra raske donorer kan modellere adskillelsen af ​​disse celler fra hæmatologiske celler, der afviger i cellestørrelse men den fælles forbehandling af disse celler med trypsin, at adskille dem fra vævskulturkolber eller prøve behandling ved hjælp af CellSearch affinitetsindfangning strategi kan også en dramatisk indflydelse på celleform. Gennem sammenligning af trypsinerede dyrkede celler og CRPC CTCs, efter CellSearch® CTC berigelse, vi vurderet, om disse dyrkede celler er egnede modeller for patient-afledte CTCs. I modsætning til dyrkede celler, der var generelt rund form, CTCs udviste signifikant form variabilitet med mange celler, der har en mere aflang formet (figur 3). Vi kvantificerede excentriciteten af ​​celleform hjælp af forlængelsesfaktor (EF), defineret som forholdet mellem de større og mindre akser best fit ellipse. Som vist i figur 4A, CTCs var signifikant mere langstrakt end dyrkede cancerceller med en gennemsnitlig median EF på 1,27 sammenlignet 1,17 for dyrkede cancerceller (p 0,05). Denne observation er i overensstemmelse med andre undersøgelser, der rapporterer betydelige pleomorhpism blandt CTCs [21], [36], [42], [43]. En mulig årsag til mangfoldighed i cellemorfologi er apoptotiske begivenheder forbundet med CTC formidling [53]. de cytomorphological ændringer, der observeres i CTCs kan dog repræsentere funktionelle ændringer i forbindelse med interaktioner mellem CTC og endotel eller cellulær forlængelse associeret med vaskulær transport [54], [55]. Interessant, har cytomorphological abnormitet af CTCs blevet korreleret til dårlig klinisk resultat i metastatisk brystkræft, tyk- og prostatakræft. [36].

CTCs var mærkbart mindre end dyrkede kræftceller (A-D). Dyrkede kræftceller var for det meste rundt med regelmæssig celle og nukleare former. Kernen blev typisk centreret og omgivet af cytokeratin (E-L). CTCs udstillet meget variable former, herunder runde (E), oval (F), aflang (G-J), og klynger (L). Ikke-round og multi-kerneholdige celler blev undertiden observeret (G-K). Skalaen bar gule er 5 um i længden

A:. Forlængelse faktor (EF) af CTCs fra patienter med prostatacancer sammenlignet med dyrkede prostata kræftceller. Medianen EF af CTCs var generelt større med betydelig inter- og intra-patient variabilitet. B: Nuklear cytoplasmatisk (N /C) forhold mellem CTCs fra patienter med prostatacancer sammenlignet med dyrkede prostata kræftceller. Median med øvre og nedre kvartiler er vist for hver prøve. Medianen N /C ratio for CTCs var generelt større med betydelig inter- og intra-patient variabilitet.

Nuclear Cytoplasmisk Ratio

nukleare cytoplasma ratio (N /C) er defineret som forholdet mellem den tilsyneladende nukleare område og den tilsyneladende celleområdet med kernen trækkes. Sammenlignet med dyrkede kræftceller, der CTCs forventes at have større N /C på grund af deres mindre cellestørrelse og sandsynligvis større nukleare størrelse på grund af mulige kromosomafvigelser. Vi fandt medianen N /C for alle dyrkede cancerceller til at være 1,12, mens gennemsnittet median N /C-forhold fra CTC af patienter, beriget af CellSearch® systemet at være 1,43. Denne observation understøtter yderligere den potentielle effektivitet af deformerbarhed-baserede CTC berigelse, som nukleoplasma bidrager 10 gange mere til celle stivhed end den cytoplasmaet [52]. Som vist i figur 4B viste CTCs signifikant større N /C variabilitet end dyrkede cancerceller. I betragtning af at N /C-forhold på CTCs korrelerer til dårlig sygdom udfald [36], kan det spekuleret, at inden for denne heterogen population, der er cellesubpopulationer med større metastatisk potentiale. Hvis ja, så måske en mere relevant mål for sygdomsstatus er optællingen af ​​en bestemt underpopulation af CTCs snarere end optællingen af ​​alle CTCs som bruges i øjeblikket [9], [56].

Cell Svind

En bekymring forbundet med målecelle -størrelse med CellSearch® systemet er, om lagring celleprøver i CellSave® rør modificerer størrelsen af ​​cellen og kernen. For at undersøge, sammenlignede vi dyrkede cancerceller tilsat til blod fra raske donorer behandles omgående med de samme celler, der behandles efter 48 timers opbevaring. Diameteren celle blev fundet at falde med -6%, mens den nukleare diameter viste sig at falde med -10% fra 0 til 48 timer (figur 5). Dette resultat giver et estimat af variabiliteten af ​​de målte celle morfologi parametre som følge af prøve opbevaringstid, men kan ikke forklare de store forskelle i morfologi CTCs og dyrkede kræftceller, eller variationen findes inden hver CTC prøve.

A: diameteren af ​​dyrkede prostatacancerceller faldt -6% i gennemsnit. B:. Det nukleare diameter dyrkede prostatacancerceller faldt ca. 10% i gennemsnit

Konklusion

Som konklusion, CTCs isoleret fra patienter kastrationsniveau resistent prostatacancer, ved hjælp af CellSearch® systemet , var mindre i størrelse, mere aflang i form, og havde større N /C sammenlignet med dyrkede cancerceller. CTCs viste også signifikant større variabilitet i form og N /C. Mens systemet kun indfanger EpCAM-høj celler, CTC billeder fra CellSearch® tælling er bredt tilgængelige, og denne analytiske strategi kunne anvendes til at identificere karakteristiske morfologiske træk ved CellSearch®-beriget CTCs. De morfologiske forskelle mellem dyrkede cellelinjer og CTC skal overvejes i design og test af enheder, der isolerer CTC i en etiket-fri mode baseret på cytomorphological kriterier.

Støtte Information

Figur S1.

skærmbillede af den LabView® program udviklet til at analysere billeder opnået fra CellSearch® systemet. Programmet får billederne for hver CTC kandidat. En valgte billede (markeret med gult) analyseres for at måle det område i pixels. En ellipse er monteret på billedet og overlejret oven på det oprindelige billede til kontrol. Parametre for mellemliggende billedbehandlingsfunktioner trin, samt statistikker for hele samlingen vises også

doi:. 10,1371 /journal.pone.0085264.s001

(DOCX)

Figur S2.

Afvist billeder af celle fragmenter fra CTC identifikation. Disse billeder af celle fragmenter almindeligt optrådte under billedanalyse og blev ikke inkluderet i CTC tæller eller celle størrelse målinger. Typiske CTC fragmenter indbefatter en kerne delvist dækket af cytokeratin, eller en kerne fuldstændig adskilt fra cytokeratin. Disse fragmenter sandsynligvis stammer fra CTCs undergår apoptose

doi:. 10,1371 /journal.pone.0085264.s002

(DOCX)

Figur S3.

Cell størrelse versus CTC tæller. Der syntes at være nogen sammenhæng mellem CTC cellestørrelse og celletal for CTCs identificeret af CellSearch fra patienter med metastatisk kastrationsniveau resistent prostatacancer. Cellestørrelsen varierede fra 6,9 um til 8,95 um; mens CTC tæller varierede fra 11 til 106.

doi: 10,1371 /journal.pone.0085264.s003

(DOCX)

tabel S1.

Patient kortfattede oplysninger. Alle patienter blev diagnosticeret med metastatisk kastrationsresistent prostatacancer (mCRPC). Der var ingen signifikant sammenhæng mellem PSA-niveau og størrelse af CTCs

doi:. 10,1371 /journal.pone.0085264.s004

(DOCX)