PLoS ONE: A Novel Histondeacetylaseinhibitor Udstillinger antitumoraktivitet via Apoptose Induktion, F-Actin forstyrrelser og Gene Acetylering i Lung Cancer

Abstrakt

Baggrund

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft dødelighed på verdensplan, men den terapeutiske strategi for avanceret ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er limitedly effektiv. Desuden valideret histon deacetylase (HDAC) inhibitorer til behandling af faste tumorer kræver fortsat udvikling. Her foreslår vi en ny HDAC-hæmmer, OSU-HDAC-44, som et kemoterapeutisk lægemiddel til NSCLC.

Metode /vigtigste resultater

cytotoksicitet effekt af OSU-HDAC-44 blev undersøgt i tre humane NSCLC cellelinjer, herunder A549 (p53 vildtype), H1299 (p53 null), og CL1-1 (p53 mutant). De antiproliferatative mekanismer OSU-HDAC-44 blev undersøgt ved flowcytometrisk cellecyklusanalyse, apoptoseassays og hele genomet chromatin-immunpræcipitering-on-chip (chip-on-chip) analyse. Mus med etablerede A549 tumor xenograft blev behandlet med OSU-HDAC-44 eller vehikelkontrol og blev anvendt til at evaluere virkninger på tumorvækst, cytokinese hæmning og apoptose. OSU-HDAC-44 var en pan-HDAC-inhibitor og udviser 3-4 gange mere effektivitet end suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA) til undertrykkelse af cellernes levedygtighed i forskellige NSCLC cellelinier. Ved OSU-HDAC-44 behandling blev cytokinese inhiberet og efterfølgende ført til mitokondrier-medieret apoptose. Den cytokinese inhibering skyldtes OSU-HDAC-44-medieret nedbrydning af mitose og cytokinese regulatorer Auroroa B og survivin. Dereguleringen af ​​F-actin dynamik induceret af OSU-HDAC-44 var forbundet med reduktion i RhoA aktivitet som følge af srGAP1 induktion. Chip-on-chip-analyse afslørede, at OSU-HDAC-44 induceret chromatin løsner og lettes transkription af gener involveret i vigtige signalveje såsom apoptose, axon vejledning og protein ubiquitinering. Endelig OSU-HDAC-44 effektivt hæmmet vækst A549 xenograft tumor og induceret acetylering af histon og ikke-histon proteiner og apoptose

in vivo

.

Konklusioner /Betydning

OSU -HDAC-44 undertrykker signifikant tumorvækst via induktion af cytokinese defekt og iboende apoptose i prækliniske modeller af NSCLC. Vores data giver overbevisende dokumentation for, at OSU-HDAC-44 er en potent HDAC målrettet inhibitor og kan testes for NSCLC kemoterapi

Henvisning:. Tang YA, Wen WL, Chang JW, Wei TT, Tan Y-HC, Salunke S, et al. (2010) A Novel Histondeacetylaseinhibitor Udstillinger antitumoraktivitet via Apoptose Induktion, F-Actin forstyrrelser og Gene Acetylering i lungekræft. PLoS ONE 5 (9): e12417. doi: 10,1371 /journal.pone.0012417

Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Februar 22, 2010; Accepteret: August 2, 2010; Udgivet: 14 September, 2010

Copyright: © 2010 Tang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud NSC97-2627-M-006 til 005 og NSC99-2628-B-006-004-MY3 fra National Science Rådet og give DOH98-TD-G-111-024 fra Department of Health (The Executive Yuan, Kina). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste dødsårsag kræft verdensplan. Den 5-års samlet overlevelse af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er mindre end 15% i mange lande [1], [2]. Standarden terapeutisk strategi til avanceret NSCLC er platinbaseret dobbelt-agent kemoterapi, som imidlertid har nået et plateau af potens i at forbedre overlevelsen af ​​patienter [3], [4]. Kun et par “target agenter” har vist fordele, når de anvendes i kombination med platinbaseret dobbelt-agent for NSCLC kemoterapi, såsom bevacizumab, erlotinib og gefitinib, i en undergruppe af patienter [5], [6]. Derfor er udviklingen af ​​nye molekylære målrettede lægemidler med mere generelle effektivitet for patienter med lungecancer er en nødvendighed opgave.

De epigenetiske ændringer samt genetiske ændringer er forbundet med tumorigenese [7]. En nylig rapport identificerer, at de epigenetiske ændringer, der omfatter ændringer af histoner H2A og H3 i NSCLC patienter påvirker den samlede overlevelse og sygdomsfri overlevelse, der giver den prognostiske værdi af histon ændringer [8]. Det afslører også rationalet for brug af narkotika mod histon modifikation som en terapeutisk strategi for NSCLC.

HDACi (HDAC) er de enzymer, der katalyserer deacetylering af histoner og epigenetisk regulerer kromatin arkitektur og genekspression. Det er blevet påvist, at inhibering af HDAC’er reverserer aberrerende epigenetisk status og udviser kraftige antitumoraktiviteter ved at inducere standsning af cellecyklus, differentiering og /eller apoptose i forskellige cancerceller [9], [10]. HDAC-inhibitorer klassificeres i seks grupper efter deres kemiske strukturer, og mindst 12 af dem har udviklet sig til kliniske forsøg [9], [11]. Til dato, den amerikanske Food and Drug Administration godkender to HDAC-hæmmere, vorinostat (SAHA, suberoylanilid hydroxamsyre, Zolinza®) og romidepsin (FK228, depsipeptid, Istodax®), til behandling af kutane manifestationer af kutant T-celle lymfom (CTCL ) [12]. Forekommer dog nogle bivirkninger hos patienter behandlet med vorinostat eller andre HDAC-hæmmere, som måtte følge af de høje koncentrationer af dosis, der anvendes under behandlingen af ​​solide tumorer i kliniske forsøg [11], [13].

I den foreliggende undersøgelse, foreslår vi en ny klasse af potente phenylbutyrat-baserede HDAC inhibitor, OSU-HDAC-44 [4- (2,2-dimethyl-4-phenyl-butyrylamino) –

N

– hydroxy-benzamid ], et derivat af kendt HDAC inhibitor,

N

hydroxy-4- (4-phenylbutyryl-amino) benzamid (HTPB) [14]. De antitumor aktiviteter og mekanismer i OSU-HDAC-44 blev undersøgt i NSCLC celle og mus xenograftmodeller. Vi fandt, at OSU-HDAC-44 var en pan-HDAC-hæmmer og udstillet 3-4 gange mere effektivitet i at undertrykke celledeling

in vitro

og tumorvækst

in vivo

forhold til SAHA eller trichostatin A (TSA). Desuden OSU-HDAC-44 induceret mitose og cytokinese defekt efterfulgt af mitokondrier-medieret apoptose i både celle- og dyremodeller. Chromatin-immunpræcipitering-on-chip-analyse afslørede genom-dækkende målgener, som blev induceret ved OSU-HDAC-44-medieret hyperacetylering af kromatin. Vores data tyder på, at OSU-HDAC-44 var en HDAC-hæmmer, og kan anvendes som målrettet anticancer lægemiddel til NSCLC kemoterapi.

Resultater

OSU-HDAC-44 hæmmer celledeling og viser synergistiske virkninger med cisplatin uanset p53-status

strukturen af ​​OSU-HDAC-44 og SAHA er vist i fig. 1A. Docking-analyse viste, at OSU-HDAC-44 interagerede med det katalytiske domæne af HDAC 8, hvilket antyder en direkte funktion af OSU-HDAC-44 i målretning HDAC (fig. 1B).

(A) Kemisk struktur af OSU -HDAC-44 og SAHA. (B) Molekylær docking analyse af OSU-HDAC-44 og SAHA. Strukturerne af OSU-HDAC-44 og SAHA blev beregnet og docking mode på katalytiske domæne af HDAC8 blev forudsagt under anvendelse docking program GOLD 4.0.1. (C) Dosis-afhængige effekter af OSU-HDAC-44 (

venstre

) og SAHA (

højre

) på cellernes levedygtighed i IMR90, H1299, A549 og CL1-1 celler. Celler blev behandlet med 0,5-10 uM af OSU-HDAC-44 eller SAHA i 48 timer, og cellelevedygtigheden blev vurderet ved trypan-blå-udelukkelse assay. (D) OSU-HDAC-44 synergieffekt med cisplatin at undertrykke celleproliferation. Celler blev eksponeret for cisplatin (Cis) alene i 4 timer, OSU-HDAC-44 (HDAC-44) alene i 48 timer, eller forbehandlet med OSU-HDAC-44 i 48 timer før cisplatin behandling i 4 timer, og derefter lægemiddel var trak og celler blev inkuberet med lægemiddel-frie medier for yderligere 48 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved trypan-blå-udelukkelse assay. CL1-1 celler blev behandlet med 4,4 pM cisplatin eller 0,3 uM OSU-HDAC-44. A549-celler blev behandlet med 1,6 uM cisplatin eller 0,2 uM OSU-HDAC-44. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

. 0,001

celievækstinhiberingen aktiviteter OSU-HDAC-44 blev vurderet i tre humane NSCLC cellelinjer, herunder A549 (p53 vildtype) , H1299 (p53 null), og CL1-1 (p53 mutant). SAHA blev inkluderet som en positiv kontrol HDAC inhibitor. OSU-HDAC-44 signifikant inhiberede celleproliferation i alle cancercellelinier Trods forskellen i p53 baggrund, og forårsagede ikke synlige cytotoksicitet til IMR90-celler, en normal lunge-cellelinie (fig. 1C). OSU-HDAC-44 undertrykt celle levedygtighed A549 og CL1-1 celler med mikromolære IC

50 værdier (0,65 ± 0,08 og 0,67 ± 0,01 pM, henholdsvis) og IC

50 værdi på H1299 blev ekstrapoleret til at være 1,14 ± 0,14 uM. Især OSU-HDAC-44 udviste 3-4 gange mere potens end SAHA i anticancer kapacitet (IC

50: A549, 1,90 ± 0,16; CL1-1, 2,85 ± 0,27; H1299, 4,87 ± 0,98 uM). Derudover viser fig. 1D viste, at OSU-HDAC-44 handlede i synergi med cisplatin at forbedre celledød i CL1-1 og A549 celler, der var både cisplatin-resistente celler.

OSU-HDAC-44 inducerer cytokinese hæmning og apoptose

for at undersøge den underliggende mekanisme af cellevækst undertrykkelse af OSU-HDAC-44, virkningerne af OSU-HDAC-44 på cellecyklusprogression blev vurderet ved flowcytometri. Behandling med 2,5 pM OSU-HDAC-44 i 24 timer medførte A549 og H1299-celler til at akkumulere i G2 /M-fase (4N celler) og efterfølgende ført til apoptose (sub-G1 celler) ved 48 timers behandling, mens eksponering for højere koncentration (5 uM), i SAHA i 48 timer havde lignende effekt (fig. 2A), hvilket indikerer, at OSU-HDAC-44 udøvede en mere potent cellecyklus deregulering effekt end gjorde SAHA. For at undersøge de cellulære konsekvenser af OSU-HDAC-44-medieret akkumulering af 4N celler blev time-lapse mikroskopiske analyser udført. Som vist i fig. S1A, OSU-HDAC-44 forårsagede udseendet af defekte spaltning fure struktur og de to datterceller blev fusioneret sammen igen, mens ubehandlede celler passeret normalt gennem celledeling. Samstemmende, blev omkring 20% ​​celler behandlet med OSU-HDAC-44 akkumuleres som bi-kerneholdige celler, sammenlignet med mindre end 5% af kontrolceller (fig. 2B og fig. S1B). OSU-HDAC-44 forårsagede også mikronuclei dannelse og forstyrret normale struktur F-actin af A549 og H1299 celler (Fig. 2B). Derfor er disse resultater antydede, at OSU-HDAC-44 kan forårsage afvigende cytokinese og efterfølgende førte til apoptose i lunge kræftceller.

(A) Virkningerne af OSU-HDAC-44 på cellecyklusfordeling i A549 og H1299 celler. Celler blev behandlet med 2,5 pM OSU-HDAC-44 eller 5 pM SAHA angivne antal gange og vurderet ved flowcytometri.

Venstre

, resultater fra et repræsentativt forsøg er vist.

Right

den gennemsnitlige procentdel af G2 /M og sub-G1 fraktion befolkning er plottet i histogrammet. (B) De bi-celler med kerne og dysregulering af F-actin induceret af OSU-HSAC-44. Celler blev behandlet med 2,5 pM OSU-HDAC-44 i 48 timer, og derefter fikseret og farvet med DAPI (DNA) og phalloidin (F-actin). Asterisk pegede på bi-kernen. Scale bars: 30 uM. (C) OSU-HDAC-44 induceret nedbrydning af Aurora B og survivin via 26S proteasom pathway.

Upper

, tidsafhængige fald i Aurora B og survivin protein niveauer efter 2,5 uM OSU-HDAC-44 behandling.

Mellemøsten

, A549-celler blev behandlet med 2,5 pM OSU-HDAC-44 i nærvær eller fravær af MG132 i 24 timer.

Lower

, A549-celler blev behandlet med 2,5 pM OSU-HDAC-44 i 24 timer og cellelysatet blev underkastet IP-assay ved anvendelse af anti-Aurora B eller anti-survivin specifikke antistoffer og blottet med anti-ubiquitinering antistof ( Anti-Ub). (D) Caspase aktivitet assay (

venstre)

og Western blot-analyser (

højre)

bekræftede, at OSU-HDAC-44 induceret iboende apoptose pathway. Celler blev behandlet med 2,5 pM OSU-HDAC-44 angivne antal gange og udsat for caspaseaktivitet assay og Western blot-analyser. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg. *

P

0,05; **

P

. 0,01

For at identificere den molekylære mekanisme er involveret i OSU-HDAC-44-induceret cytokinese hæmning blev cellecyklus-regulerende proteiner undersøgt. Svingningerne i mitotisk inhibitor Weel og mitotiske markører phosphoryleret histon H3 og cyclin B-ekspression viste, at OSU-HDAC-44-behandlede celler var i M-fasen efter 12 timers behandling og efterfølgende forladt M fase (fig. S1c), ledsaget af cytokinese defekt. Desuden OSU-HDAC-44 forårsagede fald i protein niveauer af Aurora B og survivin (figur 2C,. Øvre), som er afgørende for udviklingen af ​​mitose og cytokinese [15], [16]. Især OSU-HDAC-44 induceret ubiquitinering af Aurora B og survivin, og samtidig behandling med proteosomspecificitet inhibitor MG132 forhindrede OSU-HDAC-44-induceret nedbrydning af Aurora B og survivin (figur 2C,. Midten og lavere). Dernæst brugte vi nocodazol at synkronisere celler ved præ-metafase og for yderligere at bekræfte, at OSU-HDAC-44 faktisk udløst unormal nedbrydning af Aurora B og survivin på mitotisk fase. Som vist i fig. S1D og E, behandling med nocodazol i 24 timer medførte akkumulering i Aurora B og survivin proteiner, hvorimod kombinationen af ​​OSU-HDAC-44 og nocodazol resulterede i aftager Aurora B og survivin proteinniveauer ved 24 timer efter behandling. Disse resultater antydede, at OSU-HDAC-44-medieret svigt af cytokinese delvis kan skyldes den nedregulering af Aurora B og survivin proteiner via 26S proteasom pathway.

OSU-HDAC-44 aktiverer den intrinsiske apoptotiske vej

for yderligere at belyse den OSU-HDAC-44-induceret apoptose, udførte vi phosphatidylserin (PS) farvning analyser for at detektere tidlige proces af apoptose. Som vist i fig. S2, OSU-HDAC-44 behandling i 24 timer øget intensiteten af ​​PS-farvning i modsætning til lav farvningsintensitet upon DMSO behandling i A549 og H1299-celler. Desuden OSU-HDAC-44 behandling signifikant stimulerede caspase-3 og caspase-9 (en indikator for den indre mitokondrielle pathway) aktiviteter efter 24 timers behandling henviser aktiviteten af ​​caspase-8 (en indikator for den ydre membran receptor pathway) forblev upåvirket i A549 og H1299-celler (fig. 2D, venstre). Desuden behandling med 2,5 pM OSU-HDAC-44 i 12 timer medførte et fald i anti-apoptotisk protein Bcl-x

L, mens den steg pro-apoptotisk protein, Bad, inden 6-12 timers behandling i A549 og H1299-celler (fig. 2D, højre). Frigivelse af cytochrom c i cytosolen ledsaget af spaltningen af ​​pro-caspase-9 blev også set efter OSU-HDAC-44 behandling i 24-48 timer. Disse resultater yderligere bekræftet, at OSU-HDAC-44 kunne fremkalde den iboende apoptosecyklus i lunge kræftceller.

OSU-HDAC-44 inducerer protein acetylering med sin evne til at målrette adskillige HDAC

biomarkører af HDAC hæmning er acetylering af histon og ikke-histon proteiner, og induktion p21

Cip1 udtryk i en p53-uafhængig måde [17], [18]. Udsættelse for OSU-HDAC-44 induceret acetylering af histon H3, histon H4 og p53 i en dosisafhængig måde (fig. 3A) og tidsafhængig måde (fig. 3B), mens det ikke påvirker de HDAC1 og HDAC6 proteinniveauer (fig. 3B og fig. S3). Især sådanne virkninger var større sammenlignet med den for SAHA. Trods p53 status, OSU-HDAC-44 inducerede ekspression af p21

Cip1 mRNA og protein i A549 og H1299 celler (Fig. S4). For at undersøge mål-specificiteten af ​​OSU-HDAC-44 på klasse I, II og IV HDAC,

in vitro

HDAC-inhibering blev udført. Som vist i fig. 3C, de deacetylase aktiviteter af forskellig HDAC isotyper herunder klasse I (HDAC1 og HDAC8), klasse II (HDAC4 og HDAC6), og klasse IV (HDAC11) var signifikant hæmmet af OSU-HDAC-44. Sådanne virkninger var større sammenlignet med den for SAHA, en kendt pan-HDAC inhibitor. Disse resultater antydede, at OSU-HDAC-44 induceret protein acetylering ved at udøve bred inhiberende aktivitet på mange HDAC’er.

dosisafhængige virkninger (A) og tidsafhængige virkninger (B), i OSU-HDAC-44 på histon og ikke-histon proteiner. Ac-H3, acetyleret histon H3; Ac-H4, acetyleret histon H4; Ac-p53, acetyleret p53; p53, total p53. (C) OSU-HDAC-44 undertrykt aktiviteter klasse I (HDAC1 og HDAC8), klasse II (HDAC4 og HDAC6), og klasse IV (HDAC11) HDAC’er. Forskellige HDAC isotyper blev immunfældet fra H1299 kerneekstrakt af specifikke antistoffer, og derefter udsat for

in vitro

HDAC inhiberingsassay som beskrevet i Materialer og Metoder sektion. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg. **

P

0,01; ***

P

. 0,001

OSU-HDAC-44 øger genekspression ved at løsne kromatinstruktur

For at bestemme de direkte virkninger af OSU- HDAC-44 om kromatinstrukturen og genekspression, kromatin-immunopræcipitation (chip) -on-chip-analyse blev udført under anvendelse af antistof mod den løse kromatin mærket, acetyleret lysiner 9 og 14 i histon H3 (H3K9K14Ac) efter 2,5 uM OSU- HDAC-44 behandling i 2 timer i A549 og H1299-celler. Induktion af histonacetylering i 33 fælles gen loci af A549 og H1299 blev identificeret efter OSU-HDAC-44 behandling (tabel S1). Flere af disse 33 gener var blevet påvist at spille en vigtig rolle i visse signalveje, såsom apoptose, oxidativ stress respons, axon vejledning og protein ubiquitinering pathways (tabel 1). For at bekræfte microarray data, vi valideret kromatin struktur nogle af genet loci herunder

srGAP1

,

NR4A1

og

FOXO4

af Chip-PCR ved hjælp af antistof mod H3K9K14Ac. Som vist i fig. 4A, behandling med 2,5 pM OSU-HDAC-44 i 2 timer øget mængden af ​​

srGAP1

,

NR4A1

og

FOXO4

promotor DNA med løs kromatin struktur i forhold til ubehandlet celler. Samstemmende, mRNA niveauerne af

srGAP1

,

NR4A1

og

FOXO4

blev forøget efter OSU-HDAC-44 behandling i 24 timer (fig. 4B).

(A) kromatin-immunopræcipitation-PCR-analyser bekræftede, at behandling med 2,5 pM OSU-HDAC-44 i 2 timer induceret acetylering af histon H3 (H3K9K14Ac) i promotorregionen af ​​

srGAP1

,

NR4A1

og

FOXO4

gener. (B) OSU-HDAC-44 øget mRNA niveauer af

srGAP1

,

NR4A1

og

FOXO4

gener ved hjælp af real-time RT-PCR-analyser. Celler blev behandlet med 2,5 pM OSU-HDAC-44 i 24 timer og totalt RNA blev ekstraheret for real-time RT-PCR-analyser. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg. *

P

0,05. (C) immunopræcipitationsassay viste, at øget samspil mellem srGAP1 og RhoA blev induceret af OSU-HDAC-44. A549-celler blev behandlet og ubehandlet med 2,5 uM OSU-HDAC-44 i 24 timer og underkastet IP-Western-analyser. (D) si-srGAP1 ophævede OSU-HDAC-44-induceret fald i RhoA aktivitet (

øvre

) og reddede normale struktur F-actin efter OSU-HDAC-44 behandling (

lavere

). A549-celler transficeret med srGAP1 siRNA blev behandlet med 2,5 pM OSU-HDAC-44 i 24 timer og underkastet RhoA aktivering assay og immunofluorescens-analyser. Scale barer:. 30 um

OSU-HDAC-44 nedregulerer F-actin dynamik via srGAP1 induktion

OSU-HDAC-44 behandling induceret F-actin sammenlægning (fig. 2B). Tidligere undersøgelse har vist, at srGAP1 binder sig til de aktive former af RhoA og Cdc42 og hæmmer deres aktiviteter i reguleringen actin polymerisation i neuron celler [19]. Men den biologiske funktion af srGAP1 binding til RhoA fortsat uklart i andre celler. Brug immunpræcipitering (IP) -Western, viste vi, at OSU-HDAC-44 steg samspillet mellem srGAP1 og RhoA i A549 lungekræft celler (fig. 4C). Interessant knockdown af srGAP1 ikke kun afskaffede OSU-HDAC-44-medieret fald i RhoA-GTP niveau (fig. 4D, øvre), men også restaureret dynamikken i F-actin efter OSU-HDAC-44 behandling (fig. 4D , lavere). Disse resultater viste, at OSU-HDAC-44 nedreguleret RhoA aktivitet dels via srGAP1 induktion, hvilket fører til ødelæggelse af normale F-actin fibre.

OSU-HDAC-44 hæmmer lunge tumor xenograft vækst

in vivo

for yderligere at vurdere antitumoraktiviteten af ​​OSU-HDAC-44, pære /C null mus, der bærer A549 lunge tumor xenograft blev injiceret intraperitonealt med 7,5-30 mg /kg OSU-HDAC-44, 3 dage /uge i tre uger. TSA på 0,5 mg /kg, som har vist sig at udvise anti-tumor vækstvirkninger i xenograft af bryst- og blære cancerceller [20], [21], blev anvendt som en positiv kontrol med narkotika. Som vist i fig. 5A, behandling med 7,5, 15 og 30 mg /kg OSU-HDAC-44 inhiberede signifikant tumorvækst ved 62%, 78% og 90%, henholdsvis på dag 33 efter behandling sammenlignet med vehikelkontrol. Behandling med OSU-HDAC-44 ikke påvirke kropsvægten og forårsagede ingen påviselig toksicitet som undersøgt af hæmatoxylin og eosin farvning af vigtige organer (fig. 6A, B). Hæmatologiske biokemi undersøgelser er i de normale intervaller for OSU-HDAC-44 behandlede dyr (fig. 6C).

(A) mus, der bærer de etablerede A549 tumorer (-50 mm

3) blev injiceret intraperitonealt med 7,5, 15 eller 30 mg /kg af OSU-HDAC-44 eller 1,5 mg /kg af TSA 3 dage /uge i tre uger. Otte mus per gruppe blev anvendt i xenograft eksperimentet. Tumorvolumenerne af mus blev målt. Points, betyder; fejllinjer, 95% konfidensintervaller.

P

værdier var for sammenligninger med kontrol køretøj (*

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001). (B-D) mus bærende etableret (ca. 100~200 mm

3) A549 tumorer blev injiceret intraperitonealt med en enkelt dosis af OSU-HDAC-44 ved 60 mg /kg. Efter behandling i den angivne tid blev tumorer høstet og underkastet Western blot eller immunhistokemi analyser. (B) Tumorer fra to repræsentative mus af hvert tidspunkt (a-f) blev høstet og underkastet Western blot-analyser under anvendelse af de viste antistoffer. (C) Immunhistokemi analyser blev udført ved anvendelse af antistof mod spaltede-formen af ​​caspase 3 (brunlig farve). Original forstørrelse × 200. (D) Fluorescence immunhistokemiske analyser blev udført ved anvendelse af antistof mod Aurora B og DAPI (DNA). Billederne (d-f og j-l, skala barer: 10 pm) blev forstørret fra indrammet dem (a-c og g-I, skala barer: 30 pm).

(A) OSU-HDAC-44 behandlinger ikke forårsage betydelige vægttab af testede dyr. (B) H 0,05; **, P 0,01. *** P 0,001.