PLoS ONE: Interleukin-15 spiller en central rolle i Human Kidney Fysiologi og kræft gennem yc Signaling Pathway

Abstrakt

evne Interleukin-15 (IL-15) til at aktivere mange immun antitumor mekanismer gør cytokin- en god kandidat til terapi af faste tumorer, især renalcellecarcinom. Skønt IL-15 anvendes i øjeblikket i kliniske forsøg, funktionen af ​​cytokinet på nyre komponenter er ikke blevet grundigt undersøgt; undersøgte vi således rollen af ​​IL-15 på normale og tumorceller renale epitelceller. Heri, vi analyserede udtryk og de biologiske funktioner af IL-15 i normal renal proximal tubuli (RPTEC) og i deres neoplastiske kolleger, de renale klare celle carcinomer (RCC). Denne undersøgelse viser, at RPTEC udtrykker et funktionelt heterotrimert IL-15Rαβγc kompleks hvis stimulering med fysiologiske koncentrationer af rhIL-15 er tilstrækkelig til at inhibere epithelial mesenkymale overgang (EMT) tilsagn bevare E-cadherin ekspression. Faktisk IL-15 er ikke kun en overlevelsesfaktor for epitelceller, men det kan også bevare den renale epitheliale fænotype gennem yc-signalvejen, hvilket viser at cytokinet besidder en lang række foranstaltninger i epitelial homeostase. I modsætning hertil RCC

in vitro

in vivo

undersøgelser afslører en defekt i ekspression af yc-receptoren og JAK3 associeret kinase, som i høj grad konsekvenser IL-15-signalering. Faktisk, i fravær af yc /JAK3 par viser vi samlingen af ​​en hidtil uset funktionel høj affinitet IL-15Rαβ heterodimer, at som reaktion på fysiologiske koncentrationer af IL-15, udløser et ubalanceret signal forårsager nedregulering af tumor suppressor gen E-cadherin, begunstige RCC EMT-processen. Bemærkelsesværdigt, redning af IL-15 /yc-afhængig signalering (STAT5), ved co-transfektion af yc og JAK3 i RCC, inhiberer EMT reversion. Som konklusion, disse data fremhæve den centrale rolle, IL-15 og yc-receptor signalering i renal homøostase gennem styring af E-cadherin ekspression og bevarelse af epitelial fænotype både RPTEC (opregulering) og RCC (nedregulering).

Henvisning: Giron-Michel J, Azzi S, Khawam K, Mortier E, Caignard A, Devocelle A, et al. (2012) Interleukin-15 spiller en central rolle i Human Kidney Fysiologi og kræft gennem yc signalvejen. PLoS ONE 7 (2): e31624. doi: 10,1371 /journal.pone.0031624

Redaktør: Eliane F. Meurs, Institut Pasteur, Frankrig

Modtaget: April 15, 2011; Accepteret: 16 Jan 2012; Udgivet: 21 februar, 2012 |

Copyright: © 2012 Giron-Michel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Agence Française de biomedicin, ARC (Association pour la Recherche sur le Cancer) (N ° RAC11005LLA), Inca, NRB-vaincre le Cancer, AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) IG projekt 5642 og italienske ministerium Sundhedsstyrelsen. S.A. var en modtager af ARC og NRB-vaincre le Cancer ph.d. stipendier. K.K. var en modtager af ph.d.-stipendier fra Société française de néphrologie, ARC og NRB-vaincre le Cancer. M.C. var en modtager af et stipendium fra Fondazione Italiana per la Lotta al neuroblastom. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Interleukin-15 (IL-15) er et pleiotropisk cytokin, der indgår i medfødte immunitet samt funktioner uden for immunsystemet. IL-15 funktionel diversitet forklares delvist af dens komplekse virkningsmekanismer [1], [2] der ikke kun involverer opløselige og membran former af cytokin men også forskellige IL-15-receptorer (IL-15R) med specifikke tilhørsforhold og signaltransduktion veje [3], [4]. Faktisk IL-15 binder til IL-15Ra privat kæde med høj affinitet (Kd≥10

-11 M), som leverer en specifik signalering som respons på IL-15 (NF-KB, Syk). IL-15 aktier med IL-2 IL-2Rβ (CD122) og IL-2Ry (CD132, yc) underenheder, som danner enten en funktionel receptor for høj (IL-15Rαβγ, Kd≥10

-11 M) eller mellemliggende affinitet (IL-15Rβγ, Kd = 4 nM) for IL-15, hvilket tillader signalering gennem en kaskade, der involverer JAK /STAT, MAPK og PI3-K transduktionsveje.

den fælles yc receptor kæden er en centralt element i de fire-helix-bundle cytokiner familie, så gennem sit samarbejde med Janus tyrosinkinase 3 (JAK3), aktivering af STAT molekyler (Signal transducere og aktivatorer af transskription) [5]. JAK3 phosphorylerer forskellige downstream stats, i forhold til den type af receptor-komplekset involveret. Således IL-4 overvejende signaler gennem STAT-6, hvorimod IL-2, IL-7, IL-9 og IL-21 handling gennem STAT-1 og STAT-3 og IL-15 hovedsagelig aktiverer STAT-5 [6], [7], [8]. Både yc og JAK3 er essentielle for funktionen af ​​alle cytokinreceptorer af denne familie og er nødvendige for udviklingen af ​​det lymfoide cellesystem. Faktisk genetiske defekter af yc eller JAK3 resulterer i en svær kombineret immundefekt (SCID), kendetegnet ved manglen på T, B og NK-celler i både mus og mennesker [9], [10], [11]. Dog skal det bemærkes, at i SCID patienter, kan den korrigerende genterapi til yc fungere som en bidragyder til tilblivelsen af ​​celle lymfekræft [9], [11]. IL-2Ry kæde udtrykkes også i ikke-lymfoide celler og detekteres for eksempel på visse tumorale epitelceller [12], [13], [14], hvor mængden af ​​yc er involveret i de mekanismer, der styrer cellevækst. IL-2Ry findes også i normale epitelceller hvor det modulerer signaltransduktion af forskellige medlemmer af yc familien, selvom dens specifikke biologiske funktioner endnu ikke er blevet klart defineret [13], [15], [16].

de humane epitelceller fra forskellige væv producerer IL-15, som virker ikke alene på immunceller (f.eks IELs i tarmen), men også på epitelceller, hovedsageligt via dets anti-apoptotiske indsats [17], [18] [19], [20]. Det blev således vist, at human og muse renal tubulære epitelceller (RPTEC) konstitutivt udtrykker receptoren IL-15Rαβγ [15] og udskiller cytokinet IL-15 [21], som spiller en vigtig rolle i renal fysiologi som en autokrin overlevelsesfaktor . Faktisk, øget følsomhed af celler for apoptose observeres i den beskadigede nyre af IL-15 – /-, IL-15Ra – /- knockout-mus eller under akut nyreskade induceret af forskellige protokoller, der inducerer et fald i IL-15-produktion af epitelial celler [20], [22]. IL-15 forbedrer tarmens barrierefunktion ved at fremme dannelsen af ​​tætte forbindelser mellem epithelceller [23]. Disse resultater tyder på, at IL-15 overlevelse faktor kan have andre funktioner, der mangler at blive udforsket i renale epitelceller [15], [24], [25], [26].

På grund af sin immuno -stimulating aktivitet i flere prækliniske modeller, kunne anvendelsen af ​​IL-15 være et nyttigt cytokin til behandlingen af ​​nyre kræft. Skønt IL-15 i øjeblikket bliver testet i kliniske forsøg til behandling af nyrekræft (NCT01021059 Protocol) [2], forbliver funktionerne af cytokinet på normale epitelceller samt tumorceller dårligt undersøgt. For bedre at forstå de funktioner cytokin, foreslår vi at studere IL-15 /IL15R-system på humane nyre epitelceller fra normal oprindelse (RPTEC) og på celler af tumor oprindelse (RCC).

Vores data viser, at både

in vitro og in vivo

primære normale renale proximale tubulære celler (RPTEC) udtrykker IL-15Rαβγ receptor, hvorimod udtryk for yc-kæden og JAK3 er alvorligt svækket i renale klare kræftceller (RCC) . Den differentielle ekspression af yc-kæden og JAK3 har en markant indvirkning på renal homøostase eftersom opløseligt IL-15 i RPTEC gennem yc-kæden signalvejen bevarer ekspressionen af ​​tumorsuppressorgen E-cadherin, inhibering deres epitel-mesenkymale overgang (EMT) tilsagn . Derimod tab af yc-kæden og JAK3 i primære RCC fører til dannelse af en hidtil uset funktionelt IL-15Rαβ høj affinitet heterodimer, hvis stimulering med opløseligt IL-15 forårsager nedregulering af E-cadherin ekspression begunstige EMT-processen .

Materialer og Metoder

Antistoffer, cytokiner og reagenser

Antistoffer (Abs) mod IL-15 (L-20), IL-15Ra (sc-9172) , IL-2Rβ (sc-1046), IL-2Ry (sc-670), JAK3 (sc-513), og vimentin (sc-73260) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA). Antistoffer mod phosphoryleret ERK (4377), phosphoryleret IKB (4921), STAT5 (9358) phosphoryleret STAT5 (9356), og Alexa Fluor-konjugeret kanin-monoklonalt antistof mod phosphoryleret STAT5 (3939) blev opnået fra Cell Signaling (Beverly, MA). Antistoffer mod IL-15Ra (AF247), E-cadherin (AF648) og PE-konjugeret anti-E-cadherin (FAB18381P) blev opnået fra R R 5′-TGCCTGTGGCCCTGTGGATA; IL-2Rβ F 5′-GAATTCCCTGGAGAGATGGCCACGGTCCCA; R 5′-GAATTCGAGGTTTG GAAATGGATGGACCAAGT; yc kæde F 5′-CCAGGACCCACGGGAACCCA; R 5′-GG TGGGAATTCGGGGCATCG; JAK3 F 5′-CGTTCATGCAGCCTCTTGTTC; R 5′-GCGCA CCGTCCTCCGAATAC; β-actin F 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA; R 5′-CTCCTTA ATGTCACGCACGATTTC.

IL-15 bindingsanalyser

Menneskelig rIL-15 var radioaktivt mærket med jod (specifik radioaktivitet ca. 2000 cpm /fmol) ved hjælp af en metode kloramin T og bindende eksperimenter blev udført som tidligere [30] beskrevne. Ikke-specifik binding blev bestemt i nærvær af 100 gange overskud af umærket cytokin. For IL-15 bindingsforsøg blev RCC7 celler inkuberet med stigende koncentrationer af mærket rIL-15. Regressionsanalyse af bindingsdata blev udført under anvendelse af en én-site ligevægtsbinding ligning (Grafit, Erithacus Software, Staines, UK), og data blev plottet i Scatchard-koordinatsystemet. For inhibering af IL-15 bindingsforsøg blev RCC7 celler inkuberet i nærvær af forøgede koncentrationer af ioderet rIL-15, og faste koncentrationer af neutraliserende antistoffer mod IL-2Rβ (Mikβ1, 10 ug /ml) eller IL-2Ry (mAB2842 , 1 ug /ml) kæder. Regressionsanalyse af data blev udført under anvendelse af en 4-parameter logistisk ligning (Grafit, Erithacus Software).

plasmider og transient transfektion

pCMV6 vektor, der koder fuld-længde cDNA Myc-DDK-mærkede ORF human interleukin 2 receptor gamma (IL2Rγ) blev indkøbt fra Origene Technologies Inc (Rockville, MD, USA) og fuld længde human JAK3 cDNA subklonet mellem EcoRI-Xhol-restriktionssteder i

pcDNA3.1

eukaryote ekspressionsvektor var en slags gave fra Dr. Franck Gesbert (UMR1004, Inserm, Frankrig). Plasmider blev transformeret til Top 10 kompetente bakterieceller ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen, Carlsbad, CA), ekstraheret under anvendelse af et Maxiprep kit (Qiagen, Valencia, CA), og amplificeret ved dyrkning i Luria-Bertani-ampicillin bouillon. cDNA’er blev transient transficeret ind i celler ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev celler udpladet i seks-brønds plader (0,25 × 10

6 celler /brønd) og dyrket natten over i komplet medium. Den forbigående blanding, som indeholdt 1,0 ug plasmid-DNA og 6 pi Fugene 6 transfektionsreagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) i 100 pi serumfrit DMEM-medium (Invitrogen), blev blandet i 20 minutter ved stuetemperatur og derefter tilsat til hver brønd med komplet medium i 48 timer. Den tomme

pcDNA3,1

vektor blev transficeret som kontrol.

flowcytometri Analyser

For alle analyser er beskrevet nedenfor, erhvervede vi fluorescensdata til 10.000 celler på en FACScalibur flowcytometer (BD Biosciences), og dataene blev analyseret under anvendelse af CellQuest software (BD Biosciences). Tre gentagelser anvendtes for hver tilstand, og forsøget blev gentaget mindst tre gange.

Ekspression af celleantigener.

Ekspression af celleoverfladen (E-cadherin) og intracellulære (vimentin, Pan- CK) antigener blev analyseret ved flowcytometri som beskrevet tidligere [29], [31], [32]. Kort fortalt blev suspensioner af enzymatisk løsnede celler permeabiliseret eller ikke med BD Cytofix /Cytoperm reagens (BD Pharmingen, Le Pont De Claix, Frankrig), og 10

5 celler blev suspenderet i RPMI-medium suppleret med 1% FCS og farvet med konjugeret antistoffer rettet mod de ovennævnte cellemarkører. Efterfølgende blev cellerne fikseret ved inkubering med 1% paraformaldehyd i phosphatbufret saltvand (PBS) i 20 minutter ved stuetemperatur og analyseret ved flowcytometri.

STAT5 Aktivering.

Vi undersøgte STAT5 aktivering i RCCWT (RCC vildtype) og IL-2Ry og /eller JAK3-transficerede RCC ved at behandle celler med 10 pg /ml rhIL-15 under 40 minutter. Behandlede og ubehandlede celler blev løsnet med trypsin, vasket og fikseret ved inkubering med 1% paraformaldehyd i PBS i 20 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev permeabiliseret ved resuspension, med hvirvelbehandling i iskold methanol og inkuberet ved 4 ° C i 10 minutter. Cellerne blev vasket i 1% BSA i PBS og inkuberet med en Alexa Fluor 488-konjugeret monoklonalt museantistof mod phosphoryleret STAT5 i 60 minutter ved 4 ° C.

Immunpræcipitation og immunoblot Analyser

Alle immunoblotting (WB) blev udført som tidligere beskrevet [29]. For immunopræcipitation blev PBS-vasket cellepellet lyseres i 1 ml 1% NP-40 og 0,1% SDS, 50 mM natriumphosphatbuffer, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM natriumorthovanadat, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM AEBSF, aprotinin, leupeptin og pepstatin (5 ug /ml hver). Efter 15 min rystning ved 4 ° C blev suspensionen centrifugeret (30 minutter ved 14.000 rpm, 4 ° C). Supernatanten blev sat til 20 pi Sepharose-konjugeret-M161 (anti-IL-15Ra, 2 pg /pl). Efter 4 timer omrøring ved 4 ° C blev immunkomplekserne vasket 5 gange med 1 ml lysepuffer og anvendes 10% PAGE-SDS. Blots blev behandlet som beskrevet tidligere [29].

Immuncytokemi

Cellerne blev dispenseret i otte-brønds rum i Lab-Tek vævskultur chamber slides (1 × 10

5 celler pr ;. Nunc, Naperville, Ill) og ved konfluens, behandlet eller ikke med 10 pg /ml rhIL-15 i 5 dage. For membran farvning blev cellerne fikseret med kold methanol:acetone (01:01) ved -20 ° C i 10 minutter, vaskes derefter blokeret med PBS 3% BSA i 60 minutter. Celler blev inkuberet med anti-humant E-cadherin eller FITC-konjugerede anti-ASO2 antistoffer natten over ved 4 ° C. Efterfølgende blev cellerne vasket, inkuberet i 30 min med en AlexaFluor488-konjugeret kanin-anti-gede-antistof. Til intracellulær farvning blev cellerne fikseret med 4% (vægt /volumen) paraformaldehyd i PBS og permeabiliseret ved inkubation i 1 minut med 0,5% Triton X-100 i PBS. Cellerne blev inkuberet med blokeringsopløsning (3% BSA i PBS) og inkuberet natten over ved 4 ° C med de forskellige antistoffer. Cellerne blev derefter vasket og inkuberet med Alexa Fluor 488-konjugeret kanin-anti-muse eller anti-gede-IgG fortyndet i blokeringsopløsning og inkuberet i 30 minutter. F-actin organisation blev afsløret farvning af cellerne med 0,2 ug /ml rhodamin-konjugeret phalloidin i 20 minutter. Cellerne blev vasket med PBS, monteret i 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrig) og visualiseret ved fluorescensmikroskopi (Leica, Tyskland).

Immunhistokemi på paraffin- Embedded renal tumor og normale prøver

Biopsier fra 3 normale og 10 tumor sektioner fra nefrectomiserede nyrer med renalcellecarcinom blev snittet ved 4 pm på Superfrost plus dias. Deparaffinerede objektglas blev rehydreret i graduerede alkoholer og udsat for varme epitopgenfinding ved at nedsænke dem i 0,01 mol /l citratbuffer (pH 6,0). Snit blev inkuberet natten over ved 4 ° C med anti-IL-2Rβ (AB364), anti-IL-2Ry (sc-670) eller anti-JAK3 (07-1488) Abs, PBS-skyllet og inkuberet med HRP-sekundær Ab for 45 min. Analyse blev udført ved standardmetoder ved anvendelse af diaminobenzidin efter kontrafarvning afsnittene med hematoxylin. Den negative kontrol blev underkastet alle behandlinger udelade primært antistof. Slides blev scannet ved hjælp af en Aperio scanner (Vista, CA) og farvning blev kvantificeret ved hjælp af en morfometrisk TRIBVN software (Montrouge, Frankrig).

Resultater

IL-15R udtryk i RPTEC og RCC primære kulturer

for at belyse funktionen af ​​IL-15 i den renale menneskelige model, undersøgte vi udtryk for IL-15 receptor-underenheder (IL-15Rαβγ) på primære kulturer af normal renal proksimal Tubular epitelcelle ( RPTEC) og klar celle nyrecarcinomer (RCC).

RT-PCR-analyse (figur 1A, øverste panel) viser, at RPTEC efter aftale med den positive PBL kontrol, udtrykke forskellige udskrifter for IL-15Ra kæde ( 432 og 531 bp), den udskrift for IL-15Rβ (542 bp) og udskrift til yc-kæden (480 bp). I modsætning hertil kun IL-15Ra og p-kæder, men ikke yc-kæden, blev påvist enten på RCC (RCC5 og RCC7) eller ACHN-cellelinje. Da JAK3 kinase specifikt interagerer med dens beslægtede receptor yc-kæden, og ekspression af begge molekyler er indbyrdes afhængige [33], vi yderligere analyseret ved RT-PCR, JAK3-ekspression i normale og tumorceller nyreceller (figur 1A, nedre panel). JAK3 kinase blev detekteret i positiv hæmatopoietisk kontrol cellelinie TF1β og RPTEC, mens en svag messenger beløb eller fraværende (RCC8) blev påvist i RCC analyseret. Nr JAK3 messenger blev detekteret i MCF-7 kontrolcelle [34].

Analyse af IL-15R og JAK3-ekspression blev udført ved RT-PCR (A) og immunoblotting (B) på primær normal (RPTEC) og tumoral (RCC5, RCC7, RCC8) epitelceller og ACHN cellelinje. Data viser, at RPTEC udtrykke de tre kæder af IL-15R (αβγ) og JAK3 henviser yc og JAK3 proteiner ikke blev påvist i RCC. Specifikke primere eller Abs mod IL-15Ra (AF247), IL-2Rβ (sc-1046), IL-2Ry (sc-670) og JAK3 (sc-513) blev anvendt. PBL, TF1β, MCF7 og IFNy-aktiverede U937-celler blev anvendt som kontroller. Husholdning β-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.

For at bekræfte den differentielle ekspression af receptor-underenheder og JAK3 kinase på proteinniveauet, immunoblotting blev udført på både normale og tumorceller. Analysen bekræftede, at RPTEC, RCC og TF1β celler udtrykker to større bånd af 46 og 56 kDa specifik for IL-15Ra (figur 1B, øverste panel) og en 75 kDa bånd for IL-15Rβ kæde (figur 1B, midterste panel) . Fraværet af yc-kæden i RCC blev bekræftet, da 64 kDa-båndet udelukkende detekteres i positiv kontrol-cellelinier (TF1β og IFN-γ behandlede U937) og RPTEC (figur 1B, midterste panel). JAK3 molekyle (116 kDa) blev påvist i TF1β og RPTEC celler, hvorimod immunoblotting fandt ikke kinasen i RCC, samt i MCF-7 og IFN-γ behandlede U937 kontrol cellelinier som tidligere rapporteret [34], [35] (figur 1B, nedre panel). I alle ovennævnte eksperimenter, vi også studeret renal ATCC-CRL-1611 cellelinje (ACHN), som display IL-15R og JAK3 udtryk homologe til dem observeret i RCC delprøver.

Tab af yc kæde i nyre- klar celle karcinom væv prøver

for at bekræfte vores

in vitro

data IL-2Rβ kæde, yc kæde og JAK3 immunhistokemiske farvninger blev udført på normale og tumor sektioner af nefrectomiserede nyrer med nedsat celle carcinom. Hematoxylin farvning af paraffinindlejrede humane nyresektioner afsløret under lysmikroskopi tilstedeværelsen af ​​glomeruli (Gl) og flere distal (Dt) og proksimale (PT) tubuli i de normale vævsprøver (figur 2). Derimod disse nyre strukturer er ikke længere til stede i renalt carcinom snit, visende tumorceller med klar cellemorfologi, kendetegnet ved optisk klare cytoplasma og skarpt skitseret cellemembran.

Hematoxylin farvning af biopsier fra 2 normale prøver afslører tilstedeværelsen af ​​de normale nyre strukturer (glomerulus (GL), distal (Dt) og proksimale (PT) tubuli), mens analysen af ​​to forskellige cancer prøver viser, at det normale væv arkitektur er helt tabt og erstattes af tumorceller med klar celle morfologi, kendetegnet ved optisk klare cytoplasma og skarpt skitseret cellemembran. Henviser observeres ingen forskel på IL-2Rβ mellem normale og tumorale vævsprøver, IL-2Ry farvning lokaliseret til både proximale og distale tubuli i normale vævsprøver, er ikke fundet i tumorprøverne. En stærk JAK3 farvning er lokaliseret til både proximale og distale tubulære celler normalt væv, mens en meget svag JAK3 protein ekspression detekteres i tumorprøver. To repræsentative prøver af i alt ti vises for hver farvning. Negativ kontrol blev underkastet alle behandlinger udelade primært antistof. Målestokke 50 uM. Farvning blev kvantificeret ved anvendelse af en morfometrisk TRIBVN software (Montrouge, Frankrig) og resultaterne præsenteres som histogrammer.

Immunohistokemisk farvning på to forskellige normale renale prøver viser, at IL-2Rβ kæde, yc-kæden og en stærk JAK3-ekspression detekteres på proximale og distale tubulære celler. Derimod analyse af forskellige tumorprøver afslørede fravær af yc kæde farvning (P 0,01) med en meget svag JAK3-protein-ekspression (P 0,01), mens, ingen signifikante forskelle (P 0,05 versus kontrol, Mann-Whitney-test. Et eksperiment repræsentativt for i alt tre er vist.

For at bekræfte tilstedeværelsen af ​​en IL-15Ra /IL-2Rβ kompleks heterodimer, de potentielle interaktioner mellem IL-15Ra og IL-2Rβ kæder i RCC blev undersøgt udføre co-immunopræcipitationsforsøg på RCC7 cellelysater ved immunoadsorption til Sepharose-konjugeret anti-IL-15Ra (M161) (figur 3B). Anti-IL-2Rβ immunblotting afslører tilstedeværelsen af ​​en specifik 75 kDa protein (øvre panel), mens anti-IL-15Ra-blot, udført på den samme membran, viser ekspressionen af ​​specifikke bånd af 56 og 46 kDa (nedre panel) indikerer, at IL-2Rβ og IL-15Ra receptorunderenheder er konstitutivt associeret, danner en IL-15Rαβ heterodimer i fravær af cytokinet.

for at afgøre, om IL-15Rαβ komplekset udtrykt på RCC er funktionel, undersøgte vi signaltransduktion aktivering i normale og tumorceller renale celler behandlet med fysiologiske (10 pg /ml) og supra-fysiologiske (10 ng /ml) koncentrationer af rhIL-15 (figur 3C). Stimulering med rhIL-15 (10-40 min) induceret i RCC7 phosphoryleringen af ​​MAPK ERK1 /2 ved begge koncentrationer, mens ingen STAT5 phosphorylering blev observeret selv i nærværelse af 10 ng /mL rhIL-15 (figur 3B, øvre panel ). I modsætning hertil RPTEC udtrykker heterotrimere receptorkompleks blev aktiveringen af ​​MAPK ERK1 /2 og STAT5 induceret som respons på 10 pg /ml og 10 ng /ml rhlL-15. Desuden er der en hurtig phosphorylering af kBa, en central begivenhed i aktiveringen af ​​transkriptionsfaktoren NF-KB, i RPTEC og RCC7 som reaktion på fysiologisk rhIL-15 koncentration (figur 3B nederste panel), hvilket indikerer, at IL-15Rαβ kompleks binder IL-15 ved høj affinitet og er funktionel.

Opløselig IL-15 kontroller E-cadherin ekspression på renale epitelceller

E-cadherin er ansvarlig for at opretholde interaktioner af epitelceller og er ofte nedreguleres under tumorprogression [37]. Således har vi undersøgt effekterne af rhIL-15 på E-cadherin-ekspression på både RCC7 og RPTEC ved immunfluorescens analyse (figur 4A) og immunoblotting (figur 4B). For at vurdere effekten af ​​rhIL-15 på normal RPTEC, vi brugte en celle model, hvor fratagelsen af ​​kortikosteroider, som er stærke inducere af E-cadherin [38], sammen med manglen på daglig medium fornyelse fører inden for fem dage til faldet af E-cadherin ekspression uden at påvirke cellernes levedygtighed (97%, data ikke vist). Immunofluorescensanalyse (figur 4A), viser, at normale epitelceller RPTEC i de første passager (p2) vise et epitel-lignende morfologi karakteriseret ved en høj grad af membran E-cadherin ekspression (basal d0) i modsætning til fem dage gammel RPTEC (basal d5 ), der udviser lav E-cadherin ekspression i fravær af daglig fornyelse af mediet. Tilsætning af 10 pg /ml rhIL-15 i fem dage bevarer den oprindelige E-cadherin niveau og dermed en epitel-lignende morfologi. I modsætning til RPTEC, RCC7 på dag 0 og dag 5 display en svag E-cadherin ekspression, som forsvinder efter 5 dage af rhIL-15-behandling (figur 4A). Immunoblotting-analyse (figur 4B) viser tydeligt de modsatte virkninger af rhIL-15 på ekspressionen af ​​det modne 120 kDa E-cadherin form på RPTEC versus RCC (dag 5).

Immunofluorescensanalyse (A) og immunoblot ( B) viser, at 5 dage rhIL-15 behandling (10 pg /ml) bevarer membran E-cadherin ekspression på primære normale epitelceller RPTEC, mens det inducerer sin nedregulering på RCC7. Mediet kultur RPTEC blev ikke ændret med henblik på at inducere faldet i E-cadherin ekspression. Behandling med rhIL-15 blev fornyet på dag 3. histogrammer repræsenterer densitometri sammenligning af E-cadherin immunoblots normaliseret til p-actin i 3 forskellige RCC (RCC5, RCC7, RCC8) celler og 3 RPTEC batches.