PLoS ONE: Rhabdastrellic Acid-A induceret Autophagy-Associeret Cell Død gennem Blokering Akt Pathway i humane cancerceller

Abstrakt

Baggrund

Autophagy er en evolutionært bevaret protein nedbrydningsvej. En defekt i autophagy kan bidrage til tumorigenese. Autophagy inducere kunne have en potentiel funktion i forebyggelse og behandling tumor.

Metodologi /vigtigste resultater

Vores resultater viste, at Rhabdastrellic acid-A, et isomalabaricane triterpenoid isoleret fra svampen Rhabdastrella globostellata, hæmmet spredning af humane cancercellelinier Hep3B og A549 og induceret caspase-uafhængig celledød i begge cellelinier. Yderligere undersøgelser viste, at Rhabdastrellic acid-A induceret autofagi af kræftceller bestemt ved YFP-LC3 punctation og øget LC3-II. Forbehandlingen med autophagy inhibitor 3-MA inhiberede Rhabdastrellic syre-A-induceret celledød. Knockdown af autophagy-relateret gen Atg5 inhiberede Rhabdastrellic syre-A-induceret celledød i A549-celler. Også, phospho-Akt og dens downstream mål faldt signifikant efter behandling med Rhabdastrellic syre-A i begge cancercellelinjer. Transfektion af konstitutiv aktiv Akt plasmid ophævet autofagi og celledød induceret af Rhabdastrellic syre-A.

Konklusioner /Signifikans

Disse resultater antyder, Rhabdastrellic acid-A kunne inducere autofagi-associeret celledød gennem blokering Akt vej i kræftceller. Det giver også dokumentation for, at Rhabdastrellic acid-A fortjener yderligere undersøgelse som en potentiel anticancer eller kræft forebyggende middel

Henvisning:. Li DD, Guo JF, Huang JJ, Wang LL, Deng R, Liu JN, et al . (2010) Rhabdastrellic Acid-A induceret Autophagy-Associeret Cell Død gennem Blokering Akt Pathway i humane cancerceller. PLoS ONE 5 (8): e12176. doi: 10,1371 /journal.pone.0012176

Redaktør: Gian Maria Fimia, INMI, Italien

Modtaget: Februar 19, 2010; Accepteret: 21 juli 2010; Udgivet: 17 August, 2010

Copyright: © 2010 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er støttet af tilskud fra National Nature Science Foundation of China (30873085, 30972882) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default124.htm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Marine svampe har vist sig at være en særdeles frugtbar kilde til usædvanlige terpenoider [1], [2]. Rhabdastrellic acid-A (fig. 1), en isomalabaricane triterpenoid, blev isoleret fra den gule svamp Rhabdastrella globostellata (Carter) indsamlet fra det Sydkinesiske Hav nær Hainan Island, Folkerepublikken Kina. Dens struktur blev fastlagt på grundlag af UV, IR, MS,

1 H-NMR,

13C-NMR, og 2D NMR spektrometri [3], [4]. De relative og absolutte stereokemier blev løst ved NOESY og CD studier hhv. Det er blevet rapporteret, at Rhabdastrellic acid-A kan inhibere væksten af ​​cancer cellelinie HCT-116. Tasdemir et al. fandt, at stellettin B og E, to terpenoider fra Rhabdastrella globostellata med struktur svarende til Rhabdastrellic syre-A, fortrinsvis inhiberer p21 – /- HCT-116 cellevækst [5]. Andre isomalabaricane triterpenoids fandtes at inducere reaktive oxygenarter (ROS), fald mitrokondriemembranen, øge niveauet af Bax og cytochrom c, nedsætte mængderne af Bcl-2 og medierer en caspase-3 apoptosecyklus, men de molekylære mekanismer ansvarlige for triterpenoids celledød er ikke blevet belyst endnu [5]. viste også, vores undersøgelse, at Rhabdastrellic acid-A-induceret apoptose i HL-60 celler [4], men udviklingen af ​​apoptotiske funktioner i Hep3B og A549 celler efter udsættelse for Rhabdastrellic acid-A blev ikke observeret.

Autophagy er en lysosomal nedbrydningsvej, som er essentielt for overlevelse, udvikling og homeostase [6]. Autophagy tjener hovedsagelig en adaptiv rolle at beskytte organismer mod diverse patologier, herunder infektioner, kræft [7], neurodegeneration [8], aldring, og hjertesygdomme. Autophagic celledød har morfologiske og biokemiske funktioner adskiller den fra både apoptose og nekrose. På den tidlige fase af tumor udvikling, autofagi fungerer som en tumor suppressor

39. Fejl i autophagy føre til genomisk ustabilitet og tumorigenese. Imidlertid tumorcellerne, der er placeret i det centrale område af tumormassen undergår autofagi at overleve under iltfattige og lav næringsstoffer betingelser. Det blev rapporteret, at autophagy beskyttet nogle kræftceller mod kræft behandlinger ved at blokere apoptotiske vej. Derimod kan andre kræftceller undergå autophagic celledød efter behandlinger mod kræft [9].

rolle autophagy i mediere den cellulære reaktion på stress er blevet gennemgået af interferencing ekspression af pattedyr orthologer af ATG-genet [ ,,,0],10]. For eksempel Beclin 1 (BECN1, også kendt som Atg6) er en del af et sammensat herunder klasse III phosphotidylinositol-3-kinase, der er stimulerende for autophagy. Beclin 1 (ATG6) er også kendt for at interagere med Bcl-2-familiemedlemmer, Bcl-2 og Bcl-XL [11], [12]. Induktionen af ​​Beclin 1-ekspression kan findes under autofagi i forskellige celletyper [13]; og ATG5 er påkrævet for autofagi men kan også inducere celledød via dens interaktion med Fas protein gennem dødsdomæne [14]; Derfor er resultaterne af disse vigtige eksperimenter kan ikke på nuværende tidspunkt tages som et endeligt bevis for den rolle, autophagy som enten en gerningsmand eller en skade-forbedring middel under stress, men mere som en demonstration af de vigtige roller sine regulatorer spiller i cellulær homeostase og tumorigenese [15].

En række signalveje er involveret i reguleringen af ​​autofagi. En af de centrale regulatorer af autofagi er mål for rapamycin, TOR kinase, som er den største inhiberende signal, der undertrykker autofagi i nærvær af vækstfaktorer og rigelige næringsstoffer. Klasse I PI3K /Akt signalmolekyler link receptortyrosinkinaser til TOR aktivering og derved undertrykke autofagi i respons på insulin-lignende og andre vækstfaktor-signaler [16]. Nogle af de andre regulatoriske molekyler, der styrer autofagi omfatter 5′-AMP-aktiveret protein kinase (AMPK), der reagerer på lavt energiforbrug; den eukaryote indledning faktor 2α (eIF2α), som reagerer på næringsstofudsultning, dobbeltstrenget RNA, og endoplasmatisk reticulum (ER) stress [17], [18]. Undertrykkelsen af ​​autophagic celledød ved caspase-8 i pattedyrceller viste, at caspaser kan regulere både apoptotiske og ikke-apoptotisk celledød [19].

I de sidste årtier har forskere fokuseret på den centrale rolle, Akt i mange menneskelige kræftformer [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Akt signaleringsvej har vist sig som en central rute til regulering flere cellulære processer, herunder overlevelse og proliferation af mange celletyper. Til dato, mange menneskelige kræftformer viser hyperaktivering af Akt kinaser og dermed hæmning af Akt vej betragtes som en lovende strategi for behandling af kræft [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32].

i den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, at muligheden for, at Rhabdastrellic acid-A dræbte humane cancerceller via induktion af autofagi. Vi fandt, at Hep3B og A549-celler behandlet med Rhabdastrellic syre-A undergik morfologiske og biokemiske ændringer i overensstemmelse med induktion af autofagi og celledød. Mekanismen for autophagy induktion ved Rhabdastrellic syre-A er forbundet med hæmning af Akt pathway.

Resultater

1. Rhabdastrellic acid-A induceret caspase-uafhængig celledød i Hep3B og A549-celler

Behandlingen af ​​Hep3B og A549-celler i 3 dage med forskellige koncentrationer af Rhabdastrellic syre-A resulterede i inhibering af cellevækst i en dosisafhængig måde. IC

50 værdien var 0,42 ug /ml og 2,50 ug /ml (fig. 2A). Inhibering af cellevækst kan være resultatet af induktionen af ​​apoptose, autofagi og /eller cellecyklusstandsning. Hep3B og A549-celler behandlet med forskellige koncentrationer af Rhabdastrellic syre-A i 48 timer og analyseret for cellecyklussen ved flowcytometri. Fig. 2B viste, at Rhabdastrellic acid-A ikke inducerede cellecyklusstop i Hep3B og A549 celler inden for disse koncentrationsintervaller på 48 t. Derved har vi undersøgt, om Rhabdastrellic acid-A kunne inducere apoptose eller autofagi-associeret celledød i Hep3B og A549 celler.

A. Cancerceller blev udpladet med en densitet på 8000 celler /brønd i en 96-brønds plade. Bestanden af ​​Rhabdastrellic syre-A blev sat til brøndene. Celler blev dyrket i 3 dage. MTT-assayet blev udført. B. Hep3B og A549-celler blev behandlet med angivne koncentrationer af Rhabdastrellic syre-A i 48 timer og analyseret for DNA-indhold ved flowcytometri. Resultaterne var repræsentative for 3 eksperimenter.

Mange former for anticancermidler tjener til at inducere apoptose af cancerceller, som er karakteriseret ved caspase-3 og PARP-spaltning. At afgøre, om celledød var caspase-afhængig, først påvist vi spaltningen af ​​caspase-3. Brug af immunoblotting-analyse blev spaltningen af ​​caspase-3 i både kræftcellerne ikke observeret efter behandling med Rhabdastrellic syre-A. Spaltningen af ​​PARP var også upåviselig (fig. 2A). Spaltningen af ​​caspase-3 og PARP blev også påvist i begge cellelinier behandlet med adriamycin. Resultaterne viste, at pro-caspase-3 blev spaltet til dannelse af en 17 KDa fragmentering og PARP blev spaltet i 89 KDa fragmentering efter adriamycin behandling (fig. 3A). Endvidere pan-caspaseinhibitor, z-VAD-fmk, inhiberede ikke Rhabdastrellic syre-A induceret celledød (fig. 3B). For yderligere at bekræfte, at Rhabdastrellic acid-A hovedsagelig inducerede ikke-apoptotisk celledød, Hep3B og A549-celler udsat for forskellige koncentrationer af Rhabdastrellic syre-A blev analyseret ved 48 timers intervaller efter Annexin V-FITC /PI-farvning-assay. Som vist i fig. 3C, de højeste apoptotiske satser var 4,4% i Hep3B celler og 0,2% i A549-celler efter behandling. Disse resultater kraftigt indikerede, at Rhabdastrellic acid-A inducerede en caspase-uafhængig celledød i Hep3B og A549 celler.

A. i Hep3B og A549-celler, blev Cellelysater fremstilledes fra 0,1% DMSO, 1 ug /ml Rhabdastrellic syre-A eller 4 uM adriamycin i 24 timer og 48 timer. Western blot-analyse blev udført med caspase-3 og PARP-antistoffer. B. Celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af Rhabdastrellic syre-A i nærvær eller fravær af 20 uM z-VAD-fmk i 3 dage. MTT-assayet blev udført. Resultater (gennemsnit ± S.E.) Repræsenterer gennemsnittet af tre eksperimenter. C. Hep3B og A549-celler blev behandlet med 0 og 4 ug /mL Rhabdastrellic syre-A i 48 timer. Efter behandling blev cellerne indsamlet sekventielt og farvet med Annexin V og PI og analyseret af flowcytometri analysen.

2. Autophagy-associeret celledød induceret af Rhabdastrellic syre-A i cancerceller

Rhabdastrellic acid-A inducerer dannelsen af ​​autophagosomes.

Membranen-associeret let kæde 3 protein, MAP LC3 (Atg8) , lokaliseres forlængelsen membranen og forbliver i membranen, indtil autophagosome modning. Det er en vigtig markør for autofagi. Efter induktion af autophagy, er LC3-I omdannes til LC3-II, som er mest sandsynligt konjugeret til phosphatidylethanolamin (PE) og tæt bundet til de autophagosomal membraner danner ringformede strukturer i cytoplasmaet. For at måle autophagy blev Hep3B og A549-celler transficeret med en ekspressionskonstruktion til LC3 fusioneret til gult fluorescerende protein (YFP-LC3). I DMSO-behandlede kontrolceller blev YFP-LC3 jævnt fordelt i hele cytoplasmaet. Efter Rhabdastrellic acid-A behandling, ringformede strukturer var påviselige i cytosolen, hvilket viser foreningen af ​​YFP-LC3 med autophagosomal membraner efter en induktion af autofagi (Fig 4A). Ultrastrukturelle analyse af Rhabdastrellic syre-A-behandlede A549-celler ved elektronmikroskopi viste store autophagic vakuoler i modsætning til kontrolceller, hvor sådanne vakuoler kunne detekteres (fig. 4B).

A. Hep3B og A549-celler blev transficeret med en ekspressionskonstruktion til LC3 fusioneret til gult fluorescerende protein (YFP-LC3) i 24 timer. Derefter blev celler behandlet med eller uden 1 mikrogram /ml eller 4 ug /ml Rhabdastrellic syre-A i 36 timer, og visualiseret under et konfokalt mikroskop. B. Electron mikrograf viser autophagic vacuole af A549 celler efter 4 pg /mL Rhabdastrellic syre-A behandling. C. Rhabdastrellic acid-A tidsafhængigt inducerede dannelsen af ​​LC3-II, en markør for autofagi. Hep3B og A549-celler blev behandlet med 1 ug /ml Rhabdastrellic syre-A i de angivne tidsrum. Lysater blev analyseret ved immunblotting med LC3 antistof.

LC3-II-ekspression induceret af Rhabdastrellic syre-A i kræftceller.

Mængden af ​​PE-konjugeret form for LC3 (LC3- II) korrelerer godt med antallet af autophagosomes. Efter Rhabdastrellic acid-A behandling i de angivne tidsrum, blev LC3 påvist ved immunoblotting-analyse. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​LC3-II gradvist blev opreguleret (Fig 4C). Dette bekræftede resultaterne af YFP-LC3 transfektion og indikerede, at Rhabdastrellic acid-A kunne fremkalde autofagi i Hep3B og A549 celler.

Autophagy-associeret celledød induceret af Rhabdastrellic syre-A i kræftceller.

for at bekræfte, at Rhabdastrellic acid-A induceret autofagi-associeret celledød, Hep3B celler blev behandlet med Rhabdastrellic syre-A og /eller 3-methyladenin (en hæmmer af PI3K-C3 almindeligt anvendt til specifik inhibering af autofagi). I modsætning til kontrolceller, efter Rhabdastrellic syre-A behandling, de fleste af Hep3B celler dukkede runde, nogle blev løsnet fra overfladen af ​​brøndene, og antallet af celler blev reduceret (figur 5A). Imidlertid blev virkningerne af Rhabdastrellic syre-A behandling vendes ved 3-MA (Fig 5A). Det blev foreslået, at induktionen af ​​celledød ved Rhabdastrellic syre-A-behandling blev blokeret, når cellerne var i parallel behandlet med autophagy inhibitor 3-MA.

A. Hep3B celler blev behandlet med 1 ug /ml Rhabdastrellic syre-A og /eller 10 mM 3-MA i 36 timer og derefter undersøgt ved omvendt mikroskop. *, P 0,05 vs. Rhabdastrellic syre-A- /3-MA-. **, P 0,05 vs. Rhabdastrellic acid-A + /3-MA-. B. Lysater fra A549-vektor og A549-shAtg5 celler blev analyseret ved immunblotting med Atg5 og LC3 antistoffer. C. A549 vektor-celler og A549-shAtg5 celler blev dyrket ved 6000 celler per brønd i en 96-brønds plade, udsat for forskellige koncentrationer af Rhabdastrellic syre-A fra 0,05 til 3.2 ug /ml i 72 timer. Vækstinhiberingen blev påvist under anvendelse MTT assay. Rapporterede værdier er gennemsnit ± SD af tredobbelte prøver fra et repræsentativt eksperiment. * P-vlaue 0,05 sammenlignet med celler behandlet på samme måde, men transficeret uden shRNA. D. A549-celler blev inkuberet med 4 ug /ml Rhabdastrellic syre-A og /eller 10 mM 3-MA i 24 timer. Celledød blev kvantificeret ved anvendelse af flowcytometri som PI-farvning-assay. Forsøget blev gentaget 3 gange.

shRNA-baserede udtømning af en væsentlig autophagy protein Atg5, blokeres effektivt Rhabdastrellic syre-A-induceret LC3-II akkumulering (fig 5B). Og inhiberingen af ​​autophagy ved udtømning af Atg5 inhiberede Rhabdastrellic syre-A-induceret celledød i A549-celler inden for de koncentrationsgrænser ligger i intervallet fra 0,05 til 3.2 ug /ml (Fig 5C).

A549-celler udsat for 4 uM Rhabdastrellic syre-A og /eller 3-MA blev analyseret for celledød ved 24 timer ved flowcytometri. Propidiumiodid (PI) positiv blev talt som “døde” celler. Den celledød induceret af Rhabdastrellic syre-A blev undertrykt, når cellerne blev behandlet i kombination med 3-MA (fig. 5D).

3. Rhabdastrellic acid-A hæmmede Akt pathway i Hep3B og A549-celler

Rhabdastrellic syre-A kunne hæmme Akt pathway i HL-60-celler [4]. Det var derfor interessant at teste, om det var den samme i andre cancerceller. Som vist i figur 6A, efter Rhabdastrellic syre-A behandling for de angivne tider eller forskellige koncentrationer, Rhabdastrellic syre-A inhiberede phosphorylering af Akt i Hep3B og A549-celler.

Hep3B og A549-celler blev behandlet med Rhabdastrellic syre -A i de angivne koncentrationer i 36 timer eller behandlet med 1 ug /ml eller 4 ug /ml Rhabdastrellic syre-A i de angivne tidsrum. A. Celler blev sekventielt høstet og lyseret. cellelysater blev analyseret ved immunblotting med phospho-Akt eller Akt antistoffer. B. mTOR, phospho-mTOR, FKHR, phospho-FKHR, STAT3 og phospho-STAT3 blev analyseret ved immunblotting. Forsøget blev udført 3 gange.

mTOR, FKHR og STAT3 er tre vigtige downstream mål for Akt pathway og spille nøgleroller i autophagy og apoptose [33]. Som vist i resultaterne (fig 6b) blev phosphorylering af mTOR, FKHR og STAT3 havde dramatiske fald efter Rhabdastrellic syre-A behandling i en tidsafhængig måde i begge cellelinier. Disse resultater viste, at AKT pathway blev inhiberet af Rhabdastrellic AICD-A i Hep3B og A549-celler.

4. Induktion af autophagy af Rhabdastrellic acid-A blev ophævet ved konstitutiv aktiv Akt ektopisk udtryk

Rhabdastrellic acid-A kunne hæmme Akt vej og fremkalde autofagi i Hep3B celler. For yderligere at bekræfte en iboende rolle Akt i autofagi induceret af Rhabdastrellic syre-A, transficerede vi de Hep3B celler med MYR-Akt1- plasmider (aktiveret) og udvælges positive klon ved hjælp G418. Sammenlignet med kontrolcellerne (Hep3B celler transficeret med vektor-plasmidet), den exogene Akt ekspression steget betydeligt i Hep3B /MYR-Akt1- celler (fig. 7A). Endvidere blev markør for autofagi bestemt mens konstitutiv aktiv Akt udtryk i Hep3B celler. Sammenlignet med kontrolcellerne blev massiv induktion af autofagi observeret i Hep3B celler, der angives med stigning på LC3-II. Imidlertid udtrykker konstitutiv aktiv Akt blokeret stigning på LC3-II (figur 7B). Overensstemmelse med den opfattelse, at nogle population af LC3-II nedbrydes i lysosomer [34], behandling med lysosomal enzymhæmmere pepstatin A resulterede i akkumulering af LC3-II i cancerceller (fig 7c), var dette fænomen også forringet mens konstitutiv aktiv akt ektopisk ekspression. Endvidere kunne konstitutiv aktiv Akt ekspression redde Hep3B celler fra Rhabdasterllic syre-A-medieret vækstinhibering under behandling af Rhabdastrellic syre-A (fig. 7D). Disse resultater er vist i figur 7 viste, at konstitutiv aktiv Akt ekspression kunne inhibere Rhabdastrellic syre-A-medieret autophagy.

A. A. den positive klon udtrykte stabilt myr-Akt1 blev analyseret ved immunoblotting med Akt antistof. B. Hep3B celler blev behandlet med 1 ug /ml Rhabdastrellic syre-A i 36 timer i fravær eller nærvær af konstitutiv aktiv Akt ektopisk ekspression. Derefter LC3 proteinekspression blev analyseret. C. Cancer celler blev behandlet med 1 ug /ml Rhabdastrellic syre-A og /eller 10 pg /ml pepstatin A (pepA) i 36 timer, blev derefter LC3 proteinekspression analyseret. D. Efter behandling blev levedygtige celler fra to cellelinier målt. *, P. 0,05 vs. Rhabdastrellic acid-A (vektor)

For at undersøge, om andre veje er involveret i autophagy fremkaldt af Rhabdastrellic syre-A, vi analyserede niveauerne af Bip, CHOP, phospho -EIF2α og phospho-AMPK i Hep3B celler efter Rhabdastrellic syre-A behandling. Resultaterne viste, at phosphorylering af AMPK, EIF2a og CHOP steg efter Rhabdastrellic syre-A behandling på en dosis-afhængig måde i Hep3B celler. Der blev imidlertid ikke påvist en stigning på Bip (vist i fig. S1). Disse resultater viste, at flere veje kan være involveret i Rhabdastrellic acid-A-induceret autophagy.

Diskussion

De her beskrevne resultater viser, at Rhabdastrellic acid-A kunne fremkalde autofagi i menneskelige kræftceller . Rhabdastrellic acid-A kunne blokere Akt pathway i Hep3B og A549-celler, og konstitutiv aktiv Akt ekspression kunne inhibere Rhabdastrellic syre-A-medieret autofagi. Disse resultater viste, at inhibering af Akt /mTOR pathway er involveret i Rhabdastrellic syre-A induceret autofagi og celledød.

Autophagy er blevet rapporteret at være en proces, hvor dobbelt membran vakuoler betegnes autophagosomes formular rundt, opsluge, cytosol og organeller. Selvom autophagy blev rapporteret at bevirke en prosurvival reaktion, i nogle tilfælde, er cytotoksiciteten af ​​arsentrioxid, imatinib, ioniserende stråling etc. til nogle celletyper medieres ved induktion af autofagi. Under disse omstændigheder, autofagi udgør en nonapoptotic vej for programmeret celledød. Mange rapporter viser, at triterpenoids have potentiale cytotoksicitet til kræft cellelinjer [35], [36]. Rhabdastrellic acid-A er et af de triterpenoids der inducerede ikke-apoptotisk celledød i Hep3B og A549-celler. Derfor undersøgte vi, om induktionen af ​​autofagi var nødvendig for Rhabdastrellic syre-A-medieret celledød i disse to cancercellelinier. Autophagic celler forstør uden permeabilisering af plasmamembranen, konvertere LC3-I til LC-II, show punktformet cytoplasmatisk LC3 translokation og udvikle autophagosome. I denne undersøgelse Hep3B og A549-celler udviste morfologiske og biokemiske træk der er karakteristiske for celler, der undergår autofagi, ikke apoptose efter Rhadastrellic syre-A behandling. Også, væksthæmning af Rhabdasterllic syre-A i A549-celler var svagere end den, Hep3B celler. Men Rhabdasterllic acid-A steg mere LC3-II-ekspression. Omdannelse af LC3-I til LC3-II kan observeres i autophagy indvielse. Men delvis LC3-II kan nedbrydes når autofagi modning. Kun LC3-II-ekspression kunne ikke angive følsomheden over for autophagy.

Tidligere undersøgelser om mekanisme ligger til grund for reguleringen af ​​autofagi i kræftceller viste, at autophagy blev reguleret af flere signalveje så forskellige som klasse III-PI 3-kinase og proteinkinaser mTOR, ERK, og p38. Afvigende aktivering af Akt /mTOR-signalvejen blev impliceret i en række humane malignances [20], [21], [22], [23], [24], [25], [37]. Phosphoryleret Akt spiller centrale roller i nogle fundamentale processer, herunder celledeling, celledød, cellemotilitet /vedhæftning, celletransformation, og neovaskularisering. Når den er aktiveret, Akt virker som en overlevelsesfaktor ved at forhindre frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier og inaktivering FKHR som vides at inducere ekspression af pro-apoptotiske faktorer, såsom Fas-ligand [38]. Inhibering af mTOR inducerer apoptose i nogle typer af tumorceller, hvorimod de udløser autofagi i andre sammenhænge. Rapamycin, en inhibitor af mTOR, blev rapporteret at inducere den klassiske autophagic celledød i cancerceller. Vores tidligere undersøgelse viste også, at Rhabdastrellic acid-A inhiberede PI3K /Akt pathway og inducerede apoptose i human leukæmi HL-60-celler [4]. Så hæmning af Akt kan aktivere nogle Autophagy-relaterede proteiner og inducere autofagi. I overensstemmelse med dette fund, bemærkede vi, at Rhabdastrellic acid-A kunne hæmme phosphorylering af Akt i Hep3B og A549 celler. Phosphorylering af mTOR, FKHR og STAT3 også faldt dramatisk efter Rhabdastrellic acid-A behandling. Endvidere kunne ektopisk konstitutiv aktiv Akt ekspression blokere autofagi induceret af Rhadastrellic syre-A. Tilsammen Rhadastrellic syre-A induceret autophagy gennem hæmning af Akt /mTOR pathway.

Sammenfattende er de nuværende undersøgelser viser, at Rhabdastrellic acid-A dræber Hep3B og A549-celler via induktion af autofagi. Inhibering af Akt /mTOR pathway spiller en central rolle i Rhabdastrellic syre-A-medieret autofagi. Som tumorceller ofte erhverve defekter i autofagi sammenlignet med normale celler, farmakologisk aktivering af autophagy gennem hæmning af Akt /mTOR pathway kan dræbe kræftceller og begrænse tumorigenese, især i kræft med defekter i apoptose. Vores undersøgelse giver også dokumentation for, at Rhabdastrellic acid-A fortjener yderligere undersøgelse som en potentiel anticancermiddel eller cancer forebyggende middel.

Materialer og metoder

Narkotika og reagenser

Rhabdastrellic syre -A blev isoleret fra svampen Rhabdastrella globostellata og indledningsvist opløst i 100% dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevaret ved -20 ° C. Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) og 3-methyladenin (3-MA) ​​blev indkøbt fra Sigma Co. (Sigma Aldrich, M2128). RPMI-medium 1640 blev indkøbt fra Invitrogen (Invitrogen, 11875).

cellelinier og Cellekultur

Humant hepatocellulært carcinom cellelinie Hep3B [39] og human lunge adenocarcinom epitelcellelinie A549 [40] blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 ug /ml). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i befugtet 5% CO2.

MTT assay

Celler blev udpladet i 96-brønds plade. Bestanden af ​​Rhabdastrellic syre-A blev fortyndet, tilsat til brøndene for den ønskede endelige assay-koncentration. Efter 3 dage udsat for Rhabdastrellic syre-A, blev 10 pi MTT (5 mg /l) tilsat til hver brønd og inkuberes i yderligere fire timer, hvorefter væsken i brøndene blev inddampet. 100 pi DMSO blev sat til hver brønd. Absorbansen blev detekteret i mikropladelæseren 550 model med 565 nm bølgelængde (Bio-Rad Co., 17024). Væksthæmning blev beregnet og IC

50 værdi blev bestemt ved anvendelse af Bliss Software.

Annexin V-FITC /PI farvning assay

Celler med forskellige behandlinger blev indsamlet, resuspenderes med 10% 1640 medium, indstillet koncentration cellesuspensionen til ca. 1 × 10

6 celler /ml og overført 0,5 ml cellesuspension til et mikrofugerør. Efter tilsat 10 pi medier bindingsreagens og 1,25 pi Annexin V-FITC blev celler inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter i mørke, derefter centrifugeret og fjernes medier. Når resuspenderet i 0,5 ml koldt 1 × bindingsbuffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20% BSA pH 7,4), blev cellerne tilsat 10 pi propidiumiodid (30 ug /ml), anbringelse prøver på is og væk fra lys. Apoptose blev analyseret ved flowcytometri ((Beckman Coulter, Fullerton, CA) ved en bølgelængde på 488 nm med det samme.

Cell cyklus påvisning

Celler blev opsamlet, resuspenderet med 1 ml forafkølet 70% ethanol og fikseret i 4 ° C natten over. efter fjernet ethanol og tilsættes 0,5 ml farveopløsning (50 ug /ml PI, 100 ug /ml RNaseA, 0,2% Triton-100), cellerne blev inkuberet i 37 ° C i 30 minutter i mørke. cellecyklusfordeling blev analyseret ved flowcytometri ((Beckman Coulter, Fullerton, CA) ved en bølgelængde på 488 nm med det samme.

PI-farvning-assay

Celler blev trypsinbehandlet med 0,5 ml 0,25% trypsin i 3 min, opsamlet og resuspenderet med 1 ml forafkølet PBS. efter tilsat 0,5 ml farveopløsning (50 ug /ml PI, 100 pg /ml RNaseA, 0,2% Triton-100), cellerne blev inkuberet i 37 ° C i 30 minutter i mørke. Celledød blev påvist ved flowcytometri ((Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Konfokal mikroskopi og indirekte immunofluorescens

Celler blev dyrket på dækglas og transficeret med pYFP-LC3 for Hep3B og A549-celler. 36 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med Rhabdastrellic syre-A og analyseret efter yderligere 36 timer. Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur, blev objektglassene monteret i anti-fading opløsning og opbevaret ved 4 ° C. De dækglas blev set med en laser-scanning konfokal mikroskop (Olympus, FV-1000).

Elektronmikroskopi

Celler blev fikseret ved nedsænkning i en blanding af 2,5% glutaraldehyd, 2,5% paraformaldehyd og 0,05% picrinsyre i 0.067M cacodylatbuffer (pH 7,4). Postfiksering blev udført i 1% osmiumtetroxid efterfulgt af en overnatning nedsænkning med 0,3% uranylacetate opløst i 50 mM maleat buffer (pH 5,0). Standard procedurer for dehydrering og forankring i Epon var ansat. Tynde snit blev yderligere farvet med bly citrat, og blev undersøgt i et elektronmikroskop (Philip, CN10).

Western blot-analyse

Lysater blev fremstillet ud fra 4 × 10

5 celler ved opløse cellepellets i 100 pi lysisbuffer (20 mM Na

2PO

4 (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% aprotinin, 1 mM phenymethysulfonyl fluorid, 10 mg /ml leupeptin, 100 mM NaF, og 2 mM Na

3VO

4). Lysater blev centrifugeret ved 12.000 rpm i 10 min. Supernatanten blev opsamlet. Proteinindholdet blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad proteinassay. SDS-PAGE-prøvebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 0,2 M DTT) blev tilsat til lysater. Lysater blev opvarmet til 100 ° C i 5 minutter, og 40 ug protein blev påsat i hver brønd på en 4-20% SDS-PAGE-gel. Opløste proteiner blev elektroforetisk overført til nitrocellulose og inkuberet sekventielt med primært antistof og peberrodsperoxidase-konjugeret ged anti-mus IgG (Santa Cruz, sc-2005) eller gede-anti-kanin-IgG (Santa Cruz, sc-2004). Efter vask blev det bundne antistof-komplekset detekteres ved anvendelse LumiGLO reagens (Cell Signaling Technology, # 7003) og XAR-film (Kodak, XBT-1) som beskrevet af producenterne. De følgende primære antistoffer blev anvendt: caspase-3-antistof (Santa Cruz, sc-7272), PARP-antistof (Santa Cruz, sc-7150), glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase-antistof (Santa Cruz, sc-47.724), LC3 antistof (Novus Biologicals, NB100-2220), Atg5 antistof (Cell Signaling Technology, # 2630), Phospho-Akt1 /2/3 (Ser473) antistof (Santa Cruz, sc-7985-R), Akt1 antistof (Santa Cruz, sc-1618) , Phospho-mTOR (ser2448) antistof (Cell Signaling Technology, # 2971), mTOR antistof (Cell Signaling Technology, # 2972), Phospho-FKHR (ser256) antistof (Cell Signaling Technology, # 9461), FKHR antistof (Cell Signaling Technology , # 9462), Phospho-STAT3 (ser727) antistof (Santa Cruz, sc-8001-R), STAT3 antistof (Cell Signaling Technology, # 9132).

plasmider og transfektion

myr -Akt1 (aktiveret # 21-151) eller tomme plasmid (pUSEamp (+) # 21-147) blev erhvervet fra upstate Co. Hep3B celler blev podet i 6-brønds plade dagen inden transfektion. Transfektioner af myr-Akt1 (aktiveret) eller tomme plasmid (vektor) blev udført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11.668.019) i overensstemmelse med protokollen foreslået af fremstillingen. Efter 48 timers transfektion blev de positive kloner valgt under G418 (1000 mg /ml).

Konstruktioner, retroviral infektion, og RNA-interferens

For stabil ATG5 siRNA udtryk, den retrovirusvektor ( pSUPER. puro, en gave af professor Musheng Zeng, Cancer center, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Kina) koder hårnål RNA-sekvenser blev bygget. Et særskilt korte hårnål RN (shRNA) sekvenser mod ATG5 (shATG5) blev genereret og klonet ind i ekspressionsvektoren.