PLoS ONE: kallikreiner 5, 6 og 10 differentielt Alter patofysiologi og samlet overlevelse i en kræft i æggestokkene xenograftmodel

Abstrakt

Humane væv kallikreiner (KLKs) er medlemmer af en multigenfamilie serinproteaser afvigende udtrykt i mange cancertyper. I kræft i æggestokkene, er 12 KLKs opreguleres, og af dem KLK5, 6 og 10 har været i fokus for efterforskningen af ​​nye diagnostiske og prognostiske biomarkører. Men lidt om bidrag KLK5, 6 og 10 til kræft i æggestokkene patofysiologi.

I denne undersøgelse et panel af 13 humane ovariecancer cellelinjer blev screenet ved ELISA for sekretion af KLK5, 6, 8 , 10, 13, og 14. ES-2-cellelinje, blottet for disse kallikreiner, blev transficeret med ekspressionsvektorer KLK5, 6 og 10 enkeltvis eller parvis. Co-ekspression af KLK5, 6 og 10 blev korreleret med formindsket aggressivitet æggestokkene cancercellelinier som defineret ved reduceret kolonidannelse i blød agar og tumorigenicitet i nøgne mus. ES-2 kloner overekspression KLK5, 10/5, 10/6, 5/6 gjort væsentligt færre kolonier i blød agar. Sammenlignet med kontrolmus, overlevelsen af ​​mus injiceret med ES-2-kloner, der overudtrykker KLK10, 10/5, 10/6, 5/6 var signifikant længere, mens KLK6 var kortere. Alle grupper viser en overlevelse fordel også afveg kvantitativt og kvalitativt i deres præsentation af ascites, med både en reduceret forekomst af ascites og et fravær af cellulære aggregater inden for disse ascites. Overlevelsen fordel, KLK10 overekspression kunne sammenfattet med eksogene administration af en rekombinant KLK10. Afslutningsvis disse resultater viser, at KLK5, 6 og 10 kan modulere udviklingen af ​​kræft i æggestokkene, og interagere sammen til at ændre tumor patofysiologi. Desuden resultater støtter den formodede rolle KLK10 som en tumor suppressor og foreslå det kan holde terapeutisk potentiale i æggestokkræft

Henvisning:. Pépin D, Shao ZQ, HÜPPE G, Wakefield A, Chu CW, Sharif Z, et al. (2011) kallikreiner 5, 6 og 10 differentielt Alter patofysiologi og samlet overlevelse i en kræft i æggestokkene xenograftmodel. PLoS ONE 6 (11): e26075. doi: 10,1371 /journal.pone.0026075

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: 23. maj 2011; Accepteret: September 19, 2011; Udgivet 15. november, 2011

Copyright: © 2011 Pépin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af et stipendium fra Ontario Graduate Scholarship i videnskab og teknologi til D. Pépin. Denne bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Principal midler til forskning blev leveret af IBEX Pharmaceuticals, Inc., der beskæftigede nogle af de forfattere, der har bidraget til udformningen af ​​undersøgelserne samt indsamling og analyse af data. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Z.-Q. Shao, G. Hüppe, A. Wakefield og C.-W. Chu var medarbejdere i IBEX Pharmaceuticals, Inc., på tidspunktet for dataindsamlingen. D. Pépin, Z. Sharif og f.Kr. Vanderhyden øjeblikket ansat af IBEX Pharmaceuticals, Inc. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

nyligt opdagede væv kallikreiner er en familie af udskilte serinproteaser der omfatter 15 medlemmer (KLK1- 15) hvis gener (KLK1-15) er grupperet i tandem på en 300 kb region på kromosom 19q13.4 [1]. KLK proteiner detekteret i mange biologiske væsker, herunder blod, sædvæske, sved, spyt, cerebrospinalvæske, mælk og interstitielle rum, hvor de kan aktiveres og /eller inaktiveres ved enzymatisk [2] spaltning. KLKs spalte en lang række substrater, herunder ekstracellulær matrix (ECM) proteiner, insulin-lignende vækstfaktor-bindende proteiner, protease-aktiverede receptorer (PAR), andre kallikreiner og endda selv [2]. Desuden er KLKs udtrykkes ofte i grupper, såsom KLK3, 4, 5, 6, 8, 10, 13 og 14 i bryst eller KLK2, 3, 4, 5, 11, og 15 i [2] prostata. Disse observationer har ført til den hypotese, at kallikreiner kan fungere i en kaskade til at mediere deres biologiske virkninger, også kendt som KLK activome [3]. F.eks foreløbige beviser tyder på, at KLK5 kan være en initiator af KLK kaskader, stand til at aktivere pro-KLK2, 3, 6, 7, 11, 12, 14, hvilket resulterer i nedbrydningen af ​​ECM komponenter af sæd, og fortætning [4] .

kallikreiner har været impliceret i en række sygdomme, såsom Alzheimers og multipel sklerose [5], [6], inflammatorisk tarmsygdom [7], artritis [8], sepsis [9], diabetes [10 ], hudsygdomme [11] og cancer [12]. Fordi KLKs udskilles og let påviselig i biologiske væsker, har de vist sig som potentielt værdifulde biomarkører, især i cancer, hvor KLK3 (også kendt som prostataspecifikt antigen) har vist sig at være nyttig til overvågning af prostatacancer. De fleste KLK udtryk er under hormonal kontrol, og reaktionsevne KLK2 og 3 til androgener i prostata cancer cellelinjer [13], og KLK6 og 10 til østrogener i brystcancercellelinier er veldokumenteret [14], [15]. Mønsteret af udtryk KLKs, samt deres hormonelle regulering, antyder, at de kan være involveret i endokrine adenocarcinomer i reproduktive tarmkanalen, såsom prostata, testikel, brystkræft, livmoderhalskræft, og ovariecancer.

Akkumulerende beviser tyder på, at mindst 12 af de 15 kallikreiner er opreguleret i kræft i æggestokkene. Af dem, KLK4, 5, 6, 7, 10 og 15 er forbundet med ugunstige prognose mens ekspressionen af ​​KLK8, 9, 11, 13, og 14 er forbundet med en gunstig prognose [12]. Denne undersøgelse fokuserer på KLK5, 6 og 10, som ofte overudtrykkes i ovariecancer og fundet i forhøjede niveauer i ascites og serum fra patienter [16] – [18]. Især serum KLK6 og KLK10 er indikatorer for dårlig prognose [19], [20], og høj KLK6 er forbundet med kortere recidiv overlevelse og lavere samlet overlevelse [21]. Høje niveauer af KLK10 i serummet er forbundet med fremskreden serøse tumorer med stor residual sygdom og dårlig respons på kemoterapi [22], mens lave niveauer af KLK10 i tumoren forudsige dårlig total overlevelse [23]. De histologiske undertyper af epitelial ovariecancer, såsom serøs, mucinous, endometroid, klar celle og udifferentierede tumorer kan afspejle forskellige ontogenies og bliver stadig vigtigere at skræddersy behandling [24]. Udtrykket af KLKs er bemærkelsesværdigt ens på tværs histologiske undertyper. For eksempel er alle undertyper udtrykker KLK6, med måske en lidt større andel af klare celle tumorer, der viser stærk immunfarvning for KLK6 [21], [25]. Tilsvarende patienter med tumorer af hver undertype har detekterbare niveauer af KLK10 i deres cytosol, med en let, men signifikant højere andel af KLK10 høje patienter er af den serøse subtype [26]. Endelig synes KLK5 udtryk til at være mere udbredt i serøse og udifferentierede tumorer [27], [28].

Mens lidt om det biologiske grundlag for bidrag KLK5, 6 og 10 til kræft i æggestokkene, den evne KLK5 og 6 til spaltning ECM-proteiner [4], [29], og aktivere PAR signalering [30], tyder på, at de er direkte impliceret i forskellige aspekter af carcinogenese. Nedbrydning af ECM komponenter kan lette frigørelse af maligne celler fra tumoren og invasionen af ​​normale væv, mens nogle af de frigivne ECM peptiderne kan have både pro og antiangiogene egenskaber [29], [31]. Desuden PAR signalering har vigtige roller i vasoreguleringsanordning, cellevækst og inflammation [32], [32,33]. KLK10 blev identificeret som en formodet tumor suppressor i brystet [34] og gastrisk kræft [35], og er ofte bragt til tavshed i æggestokkene kræft cellelinjer og tumorer [36], på trods af sit udtryk i serum er en ugunstig prognostisk markør. Denne tilsyneladende paradoks eksemplificerer tvedeling af kallikreiner som både positive og negative regulatorer af processer involveret i carcinogenese såsom angiogenese, vækst, invasion, og metastase [37].

Mens tegn på afvigende ekspression af flere kallikreiner i kræft i æggestokkene er montering, vides der kun lidt om deres bidrag til sygdommens patofysiologi. Heri rapporterer vi det første forsøg på at optrævle bidrag KLK5, 6 og 10 i en xenograft model af kræft i æggestokkene, og den første terapeutiske anvendelse af en rekombinant KLK10 protein

in vivo

.

Materialer og metoder

Cell kultur

oprindelsen [38], og den type af tumorer dannet i xenografter [39] for de æggestokkene kræftceller Caov-3 (adenocacinoma [40]), OVCAR -3 (svagt differentieret serøs adenocarcinom [41]), OVCAR-4 (adenocarcinom [42]), OV2008 (endometreoid adenokarcinom med skællede differentiering [39]), C13 (endometreoid adenokarcinom med skællede differentiering [39]), OVCA433 (adenocarcinom [ ,,,0],43]), SKOV-3 (klar celle adenocarcinom [39]), OVCA429 (klar celle adenocarcinom [39]), Hey (udifferentierede [39]), ES-2 (udifferentierede [39]), OCC-1 (udifferentierede [ ,,,0],39]), A2780cp (udifferentierede [39]), og A2780s (udifferentierede [39]), der anvendes i denne undersøgelse, såvel som deres dyrkningsbetingelser blev beskrevet i en tidligere publikation [39]. Cellelinierne HT1080 og NIH3T3, der anvendes som kontroller, blev anskaffet fra ATCC (Manassas, VA, USA) og dyrket i henhold til deres anbefalinger.

Konstruktion af stabilt transficerede ES-2-cellelinier overudtrykker kallikreiner

De plasmider pcDNA3.1D /V5-His /lacZ (Invitrogen, Mississauga, ON, Canada) med geneticin modstand, og pIRESpuro-2 (Clonetech, VWR, Mississauga, ON, Canada) med puromycin modstand blev brugt som rygrad og stabilt transficeret ind i ES-2-cellelinje for at tilvejebringe vektor kontrol. Kort sagt, flere kloner stabilt transficeret med pIRESpuro-2 blev anvendt som enkelte vektor kontrol, og flere kloner successivt transficeret af pcDNA3.1.1D /V5-His /lacZ og pIRESpuro-2 blev anvendt som dobbelt vektor kontrol. CDNA’erne for KLK5, KLK6 og KLK10, samt pcDNA-KLK5 ekspressionskonstruktionen på en pcDNA3.1D /V5-His-TOPO backbone, blev venligst stillet til rådighed af Dr. E.P. Diamandis (Toronto, ON, Canada). Den KLK10 ekspressionsvektor pCMV-neo blev leveret af Goyal et al. og tidligere er blevet beskrevet [44]. Kort beskrevet PCR-amplifikation, restriktionsfordøjelse og ligering af DNA-fragmenter, der repræsenterer cDNA’er af KLK5, 6 og 10 i ekspressionsvektorerne pIRESpuro-2 blev udført, og de resulterende konstruktioner blev stabilt transficeret ind i ES-2-celler. Mindst 3 kloner af hver blev udtaget og en blev tilfældigt valgt til at udlede de respektive cellelinier ES-2-KLK5, ES-2-KLK6, og ES-2-KLK10 efter

in vivo

eksperimenter. For dobbelte transfektanter blev mindst 3 uafhængige kloner af pCMV-neo udtrykkende KLK10 yderligere transficeret med pIRES-puro-2 udtrykkende KLK5 eller KLK6 og en af ​​hver blev tilfældigt udvalgt til at generere henholdsvis ES-2-KLK5 /10 og ES -2-KLK6 /10 cellelinjer. Cellelinien ES-2-KLK5 /6 blev genereret fra en af ​​de 3 kloner ved stabilt at transficere ES-2-KLK6 cellelinje med pcDNA-KLK5 konstruktionen. Transfektion af ES-2-celler blev udført ved anvendelse Lipofectomine ™ 2000 (Invitrogen, Mississauga, ON, Canada) ifølge protokollen tilvejebragt af producenten. De ovenfor beskrevne kloner blev selekteret og opretholdt i DMEM-medier (Thermo Scientific, Waltham MA, USA) indeholdende geneticin (400 ug /ml) og /eller puromycin (10 ug /ml) (Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA).

Cell proliferation Assay

for at vurdere spredning, cellevækst blev analyseret i forældrenes ES-2 celler linjer og 3 eller flere kloner stabilt transficeret med konstruktioner til KLK5, KLK6, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10 eller Vektorstyring anvendelse af 12-brønds plader med indledende udpladning densiteter på 10.000 celler /brønd. Efter 96 timer blev cellerne trypsineret og efterfølgende talt med en Coulter Counter (Beckman Coulter Inc., Fullerton CA, USA).

Forankringsuafhængig vækst

Den anvendte protokol er tidligere beskrevet af M. Pace et al [45]. Kort fortalt, 5 × 10

3 celler blev suspenderet i 3 ml komplette medier indeholdende 3,5% lavt smeltepunkt agarose og hældt oven på bundlaget 7% agarose i det samme medium i brønde i en 6-brønds plade. Medier (0,5 ml) blev tilsat til hver brønd og skiftes hver 2-3 dage. En opløsning af

s

-iodonitrotetrazolium violet (1 ml) blev tilsat til hver brønd på dag 7, og kolonier blev farvet i 24 timer, talt og fotograferet.

Invasion assay

for invasionen analyse på kallikrein overekspression kloner, brugte vi HTS Transwell 96 System® (Corning, Lowell, MA). Kort fortalt blev transbrøndene overtrukket med kælder membranekstrakter som anvist af fabrikanten, og 5 × 10

4-celler i 50 pi serumfrit medium blev derefter tilsat til toppen kammer, mens 150 pi medier med 10% serum var tilsat til reservoiret. Pladen blev inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2 atmosfære i 24 timer. De celler, som migrerede til bunden af ​​indsatsen blev farvet med hematoxylin ifølge fabrikantens protokol, og membranerne blev monteret på objektglas, scannes ved hjælp af ScanScope (Aperio, Vista, CA), og mængden af ​​blå pixels blev kvantificeret under anvendelse af Aperio software (Aperio, Vista, CA). Dataene blev afbildet som% invasion, sammenlignet med mængden af ​​celler på en kontrol transwell membran beklædt med kælder membranekstrakter.

xenotransplantat

Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse, var i overensstemmelse med

retningslinjer for pasning og anvendelse af dyr

oprettet af den canadiske Rådet om Animal Care, og blev godkendt af Animal Care udvalget ved University of Ottawa (protokol ME-196). Female CD-1 nu /nu mus (Charles River Laboratory, Wilmington, MA, USA) i alderen 5-6 uger blev huset med mad og vand

ad libitum

, på en 12 h dagslys cyklus. Tumorcellen IP xenograft metode blev beskrevet tidligere [39]. Kort fortalt efter en uges akklimatisering blev musene injiceret intraperitonealt (IP) med 10

7 ES-2-celler, eller en af ​​dens afledte kloner tilfældigt udvalgt fra cellelinier stabilt transficeret med KLK5, KLK6, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10, Vector enkelt kontrol eller Vector dobbelt kontrol, resuspenderet i 0,8 ml phosphatbufret saltvand. Grupper blev derefter blindet for ionvestigators indtil slutningen af ​​eksperimentet på dag 56. Sygdomsprogression blev overvåget dagligt, baseret på et sæt af generelle wellness kriterier, som dyret pleje udvalg og body mass blev registreret to gange om ugen, indtil en forudbestemt endpoint var nået. Det tidspunkt, hvor symptomerne på sygdommen først dukkede op, såsom mild abdominal udspiling, eller små håndgribelig masse blev registreret. Endepunkter omfattede: dehydrering og /eller vægttab på over 15% på trods af væsketerapi, tegn på åndedrætsbesvær, kropsvægt stigning på over 5 g fra gennemsnittet kropsvægt kontrol mus på samme alder i samme population, tilstedeværelse af en håndgribelig abdominal masse, der svækker mobiliteten, fodring eller påvirker wellness og endelig tilstedeværelsen af ​​abdominal udspiling, der svækker mobiliteten eller påvirker wellness eller forårsager betydelig misfarvning tydeligt på den dorsale eller ventrale hud.

Ved obduktion blev tumorprøver vejet og delt at være enten straks flash-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -20 ° C, eller fikseret i 10% bufret formalin (VWR, Mississauga, ON, Canada) i 24 timer og opbevaret i 70% ethanol før forarbejdning til paraffinindlejret blokke, som blev skåret i 5 pm sektioner for hematoxylin og eosin (H 0,05

Resultater

Sekretion af kallikreiner 5, 6 og 10 korrelerer med nedsat aggressivitet i et panel af æggestokkene kræft cellelinjer, men kan påvises i ascites af Ovariecancerpatienter

Ekspression af kallikrein klynge herunder KLK4 til KLK14 er tidligere blevet rapporteret i ovariecancer [37]. Men det er også blevet rapporteret, at forskellige kallikreiner kan have diametralt modsatte virkninger på patienten prognose i en række forskellige cancere [37]. At kontrollere, at kallikrein udtryk sammenfattet i æggestokkene kræft cellelinjer, et panel af tretten æggestokkene kræft cellelinier (CAOV-3, OVCAR-3, OVCAR-4, OV2008, C13, OVCA433, SKOV-3, OVCA429, Hey, ES- 2 blev OCC-1, A2780cp, A2780s) screenes for sekretion af KLK 5, 6, 8, 10, 13 og 14 i dyrkningsmediet ved ELISA (tabel S1). På grundlag af kallikrein ekspression, kan cellelinierne holdes adskilt i ikke-ekspressorer (SKOV-3, OVCA429, Hey, ES-2, OCC-1, A2780cp, A2780s) og ekspressorer (CAOV-3, OVCAR-3, OVCAR -4, OV2008, C13, OVCA433). I sidstnævnte gruppe, alle delte fælles udtryk for KLK5 /6, og 5 af 6 udtrykte KLK10, 4 af 6 KLK8, 3 af 6 KLK13 og ingen udtrykte KLK14. At undersøge enhver forbindelse mellem kallikrein ekspression og aggressivitet af cellelinierne blev disse to grupper sammenlignet for deres evne til at invadere i matrigel, danner kolonier i blød agar og udvikle tumorer intraperitonealt i nøgne mus (data ikke vist). En løs korrelation blev observeret, omend med visse undtagelser, at i modsætning til de ikke-ekspressorer, de celler, der udtrykker kallikreiner ikke invadere matrigel, dannede ikke kolonier i blød agar, og som tidligere rapporteret af os [39], var meget dårlig ved dannelse af tumorer i nøgne mus (tabel 1).

Stabil overekspression af KLK 5, 6 og 10, alene eller i par, i kloner af kallikrein-deficiente ES-2-cellelinje, resultater i ændret forankringsuafhængig vækst, men påvirker ikke cellulær proliferation eller invasive potentielle

KLK5, 6 og 10 var de mest almindeligt udtryk kallikreiner i mindre aggressive æggestokkene kræftceller tyder på en sammenhæng mellem forekomsten af ​​de kallikreiner og tumorigen potentiel. For at drille hinanden roller hver kallikrein og deres interaktioner på tumorigenicitet blev ES-2 celler, der ikke udtrykker nogen af ​​de testede kallikreiner (tabel 1) stabilt transficeret med ekspressionsvektorer for KLK5, 6, 10 alene eller i par. 3 eller flere kloner af KLK5, 6, 10, 5/6, 5/10, 6/10 sammen med tomme plasmid kontrol og umodificerede ES-2-celler blev sammenlignet for forankringsuafhængig vækst, spredning og invasion (fig. 1). Angivelse af KLK5, 5/6, 5/10, og 6/10 var tilstrækkelig til at reducere muligheden for ES-2-celler til at danne kolonier i blød agar i forhold til vektor-kun kontrol, men ændrede ikke hastigheden af ​​spredningen end 96 timer eller modulere evne af klonerne til at invadere i en transwell assay.

Tre eller flere kloner af ES-2-cellelinje, der overudtrykker KLK5, 6 eller 10 eller par af KLK5 /6, KLK5 /10 og KLK6 /10 blev sammenlignet med forældrenes ES-2 celler eller vektor-transficerede kontroller

in vitro

for deres tumorfremkaldende egenskaber. A) Kloner blev dyrket i blød agar, og antallet af kolonier blev talt og repræsenteres som procent af cellerne, som dannede kolonier. B) Kloner blev dyrket i 96 timer i serum-holdige medier og celleantal blev talt. C) Klonale celler resuspenderet i serumfrit medium blev deponeret i en indsats, overtrukket med basalmembran ekstrakt og fik lov at invadere transwell badning i medier med 10% serum i 24 timer og migrerende celler blev kvantificeret. Resultaterne er vist som middelværdien af ​​3 eller flere kloner +/- SEM, og signifikans er udledt ved envejs ANOVA med post test, hvis p 0,05. Forskellige små bogstaver over hver bar indikerer statistisk signifikante forskelle mellem værdier (p 0,05). I C, er dataene normaliseret til forældrekontrol.

Stabil overekspression af KLK 5, 6 og 10, alene eller i par i kloner af kallikrein-mangel ES-2-cellelinje, resultater i ændret overlevelse for en mus xenotransplantationsmodel

for at undersøge, om forskellen kallikrein udtryk kunne regulere aggressivitet ovariecancerceller

in vivo

blev en intraperitoneal (IP) xenograftmodel ansat. Til dette formål er ES-2 æggestokkræft cellelinie er ideel, da det ikke udtrykker kallikreiner 5, 6 og 10 (tabel 1) og danner let hurtigt progredierende tumorer IP i nøgne mus, der ledsages af ascites, hvilket efterligner sygdomsprogression i mennesker [39]. Kloner afledt fra denne cellelinie, der stabilt secernerende KLK5, 6, 10, 5/6, 5/10 og 6/10 i dyrkningsmedierne sammen med de passende tom vektor kontrol (tabel 2) blev injiceret IP i immunsvækkede nu /nu-mus . Musene blev injiceret med 10

7 celler af hver klon per dyr, i grupper på 8, som derefter blev blindet, og overvåges nøje for endpoints. Median overlevelsestid for forældrenes linje var 16d hvorimod enkelt ekspressor kontrol var 19.5d og dobbelt ekspressor kontrol var 15d. Overlevelse af gruppen udtrykker KLK5 (24.5d) adskilte sig ikke fra kontrolgruppen (fig. 2), mens overlevelsen af ​​de grupper, der udtrykker KLK10 (32.5d), KLK5 /6 (25,5), KLK5 /10 (23,5), og KLK6 /10 (23,5) var signifikant længere end deres passende kontroller ved logrank test (fig. 2). Overlevelse af gruppen overudtrykker KLK6 (15d) alene var signifikant kortere end kontrollen cellelinie, men ikke den parentale linje. Grupperne KLK5, KLK10, KLK5 /6 og KLK5 /10 hver havde én sygdomsfri overlevende mus, mens gruppe KLK6 /10 havde to efter studiet afslutning på dag 56, mens alle de mus i kontrolgrupperne udviklede sygdommen.

A) kloner af ES-2-cellelinje, der overudtrykker KLK5, 6 eller 10 eller B) par KLK5 /6, KLK5 /10 og KLK6 /10 blev injiceret IP i nøgne mus og overlevelse blev sammenlignet med kontrolmus xenotransplanterede med de passende vektor backbone kloner. Resultaterne er vist som en Kaplan-Meier plot, og signifikans under anvendelse af en logrank test versus passende kontrol blev udledt ved p lt; 0,05. * Betegner p 0,05, ** angiver p 0,01, og *** p. 0,001

Mus xenotransplanteret med kallikrein-secernerende tumorer vise ændringer i patofysiologi

for at tydeliggøre forbindelsen mellem KLK sekretion og overlevelse blev flere sygdomsrelaterede målinger sammenlignet på tværs af alle grupper på obduktion (tabel 3). Den mest udbredte endpoint var abdominal distension (82%) som følge af ascites akkumulering, efterfulgt af åndedrætsbesvær (8%) forårsaget af pleurale effusioner, dehydrering og vægttab (7%), og endelig nedsat mobilitet (3%). Nogle dyr blev ikke målt på endpoint statistikker på grund af fravær af sygdom ved afslutning af studiet (N = 8), eller fordi de døde af sygdommen, før den endpointed (N = 6). Tumor histologi, spredt og steder af metastaser var ens blandt grupper, med en præference for omentum, peritoneale membran, membran, kønsorganer, lever og tarme. Både tumorbelastning og ascites volumen blev registreret hos dyr, der nåede endepunkt, og ikke-nul-værdier blev anvendt til at beregne den gennemsnitlige (tabel 3). Mean ascites volumen afveg ikke mellem grupperne med undtagelse af kontrol-dobbelt, som skred forbi deres udspiling endpoint før bliver ofret på grund af deres hurtige sats for sygdomsprogression. En statistisk signifikant sænket forekomst af ascites ved obduktion blev observeret hos dyr i gruppe KLK5 /10 (p 0,01) og KLK6 /10 (p 0,01) med kun 37,5% forekomst rate sammenlignet med kontrolgrupper, som alle udviklede ascites. Paradoksalt nok KLK6 /10 gruppe havde også i gennemsnit en højere tumor byrde (p 0,01), sandsynligvis på grund af den længere ascites-fri overlevelse. Blandt de dyr, der har udvikler ascites inden for grupper af KLK5, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10, en signifikant lavere forekomst af flercellede frit flydende aggregater i ascites blev registreret (tabel 3). Aggregaterne stede i ascites var kompakte kugler af celler af ensartet størrelse (~ 1 mm

3) synlig for det blotte øje. Kallikrein koncentrationer målt ved ELISA i ascites udviste niveauer af KLK6 (tabel 3) at være sammenlignelige med niveauet i patientens ascites, mens niveauer af både KLK10 og KLK5 var forhøjet i sammenligning med de patientprøver, især i kombinationsgrupperne.

overlevelsestiden for hver gruppe af mus kan opdeles i en periode forud for indtræden af ​​symptomer, efterfulgt af en symptomatisk periode som kulminerer ved endepunktet. Variabilitet mellem grupper er allerede til stede, når man ser på begyndelsen af ​​symptomer (tabel 3), kan tyder kallikreiner påvirke tidlig sygdomsprogression. At følge den tidlige sygdomsprogression, blev plasmakallikrein niveauer målt ved ELISA i hvert dyr hver uge og ved obduktion at tjene som en surrogatmarkør for tumorbyrde. Kallikreiner var påviselige i plasmaet godt før indtræden af ​​de første symptomer i alle mus, hvilket antyder, at asymptomatisk spor sygdom kan påvises ved at måle cirkulerende kallikreiner.