PLoS ONE: Hæmning af Hedgehog Signaling antagoniserer serøs kræft i æggestokkene Vækst i en primær xenograftmodel

Abstrakt

Baggrund

Nye beviser forbinder afvigende aktivering af Hedgehog (Hh) signalering med patogenesen af ​​flere kræftformer, herunder medulloblastom, basal celle, småcellet lungekræft, bugspytkirtel, prostata og æggestokke. Denne undersøgelse blev designet til at bestemme, om hæmning af denne vej kunne hæmme serøs æggestokkene vækst kræft.

Metode

Vi udnyttet en

in vivo

præklinisk model af serøs ovariecancer at karakterisere anti-tumor aktiviteten af ​​Hh pathway hæmmere cyclopamin og en klinisk anvendelig derivat, IPI-926. Primære humane serøs ovarietumor væv blev anvendt til at danne tumortransplantater i mus, der efterfølgende blev behandlet med cyclopamin eller IPI-926.

vigtigste resultater Salg

Begge forbindelser viste signifikant antitumoraktivitet som enkelte midler . Når IPI-926 blev anvendt i kombination med paclitaxel og carboplatin (T /C), blev ikke observeret nogen synergistisk virkning, selvom langvarig behandling med IPI-926 efter ophør af T /C fortsat at undertrykke tumorvækst. Hh pathway aktivitet blev analyseret ved RT-PCR for at vurdere ændringer i

Gli1

transkriptniveauer. En enkelt dosis af IPI-926 hæmmede mus stromale

Gli1

transkriptniveauer på 24 timer med uændret menneske intra-tumor

Gli1

niveauer. Kronisk IPI-926 terapi i 21 dage inhiberede imidlertid Hh-signalering i både mus stromale og humane tumorceller. Expression data fra mikro-dissekeret stroma i humane serøse ovarietumorer bekræftede tilstedeværelsen af ​​

Gli1

udskrift og en signifikant sammenhæng mellem forhøjede

Gli1

transkriptniveauer og forværret overlevelse.

konklusioner /betydning

IPI-926 behandling hæmmer serøs tumorvækst tyder på Hh signalvejen bidrager til patogenesen af ​​kræft i æggestokkene, og kan holde løftet som en ny terapeutisk mål, især i indstillingen vedligeholdelse.

Henvisning: McCann CK, Growdon WB, Kulkarni-DATAR K, Curley MD, Friel AM, Proctor JL, et al. (2011) Hæmning af Hedgehog Signaling antagoniserer serøs kræft i æggestokkene Vækst i en primær xenograftmodel. PLoS ONE 6 (11): e28077. doi: 10,1371 /journal.pone.0028077

Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget: Juni 24, 2011; Accepteret 31. oktober, 2011; Udgivet: November 29, 2011

Copyright: © 2011 McCann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af tilskud fra æggestokkene Cancer Research Fund (BRR), Advanced Medical Research Foundation (BRR), og Vincent Memorial forskningsmidler (BRR). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Jennifer L. Proctor, Hana Sheikh, Igor Deyneko, Jeanne A. Ferguson, og John R. MacDougall er medarbejdere i Infinity Pharmaceuticals. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

I USA, er kræft i æggestokkene skønnes at hjemsøge ca. 22.000 kvinder og forårsage næsten 14.000 dødsfald årligt. Den levetid risiko for at udvikle kræft i æggestokkene er en i 70, og det er den femte mest dødbringende kræft hos kvinder [1]. De fleste æggestokkene kræftpatienter til stede med sene sygdom, der behandles med kirurgisk debulking og platinbaseret kemoterapi. Selv 70-80% af kvinderne opnå en fuldstændig klinisk respons, vil et flertal af disse patienter udvikler tilbagevendende sygdom, der ofte kemoterapi. Novel behandling indflyvninger ved anvendelse af konventionelle cytotoksiske behandlinger i kombination med molekylært målrettede behandlinger rettet mod specifikke signalveje, der kræves for tumor udvikling og progression potentielt holde lovende som strategier for varig behandling af primær og recidiverende ovariecancer [2].

The Hedgehog (hh) signaltransduktionsvej omfatter en familie af stærkt konserverede proteiner, som primært virker under embryogenese til regulering stamcelle skæbne og organogenese, og fremme proliferation, regenerering og differentiering af somatiske væv i den voksne [3]. Patched 1 (Ptch1), en membran-receptor, inhiberer normalt membranproteinet Smoothened (Smo) i at aktivere Gli1. Bindingen af ​​Hh ligand (Sonic, indisk eller Desert) til Ptch1 ophæver sine undertrykkende virkninger på SMO tillader translokation af Gli1 til kernen, hvor det inducerer ekspression af målgener [4], [5]. Aberrant aktivering af Hh-vejen i voksenalderen er blevet forbundet med udviklingen af ​​malign transformation i en række forskellige humane cancere [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11] , [12]. Derudover har tumorfremkaldende celler i visse kræftformer blevet vist at være afhængig af vedvarende Hh induceret signalering og efterfølgende aktivering af Gli1 følge af ligand over-ekspression eller mutations aktivering af Hh-vejen [6], [13]. Behandlingsregimer med Hh pathway antagonister i kombination med konventionelle molekylære og cytotoksiske behandlinger har vist

in vitro

in vivo

aktivitet mod spredning i medulloblastom, basal celle, bryst, småcellet lungekræft, prostatakræft og pancreas cancer modeller [10], [11], [12], [14], [15], [16], [17]. Disse antagonister er i øjeblikket i fase I og kliniske fase II forsøg.

Aktivering af Hh-vejen er blevet dokumenteret i kræft i æggestokkene som en potentiel mekanisme er involveret i neoplasi. Ændrede gen og protein udtryk for HH pathway medlemmer Gli1, SMO, Ptch1, Desert pindsvin (Dhh) og Sonic pindsvin (Shh) i æggestokkræft er blevet rapporteret, selv om den nøjagtige forekomst og mønster mangler at blive afklaret [18], [19 ], [20], [21]. Mens mange undersøgelser tyder på, at 50-60% af invasive tumorer i æggestokkene manifest Hh-aktivering, andre forskere har hævdet, at meningsfuld aktivering via ændret ekspression af flere pathway proteiner forekommer i mindre end 20% af kliniske prøver testet [19], [20]. Mens en direkte korrelation mellem ekspression af Dhh og kliniske stadium, histologisk undertype eller overlevelse er blevet rapporteret, er det i øjeblikket uklart, om ekspression af Dhh ligand er associeret med nedsat overlevelse [20]. Andre analyser af ovariecancer prøver har foreslået, at forhøjet Gli1 proteinekspression er en uafhængig faktor forbundet med nedsat overlevelse, når der korrigeres for alder, stadie, grad og histologiske type [18].

In vitro

og begrænsede

in vivo

undersøgelser giver grund til at formode, at Hh signalvej spiller en vigtig rolle i æggestokkræft celleproliferation. blev påvist Shh i en række æggestokkene cancercellelinier og tilføjelse af et monoklonalt antistof mod Shh resulterede i en dosisafhængig formindskelse i celleproliferation [21]. Tilsvarende behandling af dyrkede ovariecancerceller med Smo inhibitor cyclopamin har vist sig at inducere standsning af cellecyklus i G1 og fremme apoptose [20]. Desuden ektopisk udtryk for Gli1 i æggestokkene cancerceller resulteret i øget celleproliferation, mobilitet og invasive egenskaber [18]. Ovariecarcinom cellelinie afledt xenotransplantater er også modtagelige for Hh pathway inhibering som deres vækst er markant forringet efter behandling med cyclopamin [21]. De fleste af de foreliggende data tyder på, at en aktiveret Hh signaleringskaskade kan være en potentiel drivkraft for neoplasi i en betydelig del af epitelial ovariecancer gør det til et attraktivt mål for terapeutisk hæmning.

Vi har udforsket denne mulighed ved hjælp af Hh inhibitor IPI-926, et derivat af cyclopamin med øget oral biotilgængelighed og en længere halveringstid [22]. IPI-926 antagoniserer Hh-vejen ved at hæmme Smo. IPI-926 inducerer en dosisafhængig reduktion i

Gli1

mRNA-ekspression og holdbar tumor remission i en murine medulloblastom model [22]. Selvom IPI-926 havde ingen virkning som et enkelt middel i en musemodel af småcellet lungecancer før kemoterapi, dyr behandlet med IPI-926 efter kemoterapi udviste en dramatisk inhibering i tumorgenvækst [22]. På baggrund af disse prækliniske data, vi søgte at afgøre, om hæmning af Hh vej ved cyclopamin eller IPI-926 havde en effekt på væksten af ​​humane papillære serøse ovariecancer implanteret afledt af primære humane væv opnået på tidspunktet for første operation. Vi vurderede derefter anti-tumor aktivitet af IPI-926 i vores xenograftmodel i kombination med paclitaxel og carboplatin og som et enkelt middel vedligeholdelsesbehandling. Endelig blev virkningen af ​​en enkelt dosis og længerevarende IPI-926 behandling på Hh pathway aktivitet bestemt i både stromale og tumorcellepopulationer. Vores resultater understøtter den hypotese, at Hh signalvejen bidrager til patogenesen af ​​serøs ovariecancer og hæmning af denne vej kan have terapeutisk fordel.

Materialer og metoder

immunhistokemisk analyse

En æggestokkene kræftvæv microarray (T8235725, Biochain, Hayward, CA), som omfatter 64 godartede og ondartede æggestokkene humane tumorer blev anvendt til immunhistokemisk analyse af Shh protein-ekspression. Antigen genfinding blev udført i citrat Target Retrieval puffer under anvendelse af en trykkoger i 40 minutter og blev snittene behandlet med 3% hydrogenperoxid og inkuberet i Background Sniper (Biocare, Concord, CA) for at blokere ikke-specifik binding. Inkubation af sektionerne med det anti-Shh-monoklonalt antistof ab53281 (Abcam, Cambridge, MA) fortyndet 1:2000 i DaVinci Green fortyndingsmiddel (Biocare Medical, Concord, CA) blev udført ved stuetemperatur i 90 minutter. Snittene blev derefter inkuberet med kanin på gnaver polymersystem (Biocare Medical, Concord, CA) i 45 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev derefter behandlet med 3, 3′-diaminobenzidin chromagen (DAB) i 5 minutter for visualisering. Snit blev derefter modfarvet med hematoxylin, dehydreret og monteret. Samlet kanin IgG i stedet for de primære antistoffer tjente som en negativ kontrol.

Tumor indsamling og udbredelse

in vivo

Overskydende humane tumorceller eller ascites prøver blev opnået gennem en IRB godkendt centraliseret bank infrastruktur på Massachusetts General Hospital (MGH). Skriftligt informeret samtykke er modtaget fra alle deltagere. Der var ingen prøver afledt af mindreårige i denne undersøgelse. Den MGH Gyn væv repository protokol (07-049) blev revideret og godkendt af Dana-Farber Harvard Cancer Center (DFHCC). Desuden har vi udnyttet arkiverede prøver stammer fra MGH patologi under en institutionel godkendt protokol (2008P001695).

Single-suspensioner fra enten enzymatisk behandlet fast tumorvæv eller ascites blev derefter forarmet af hæmatologiske komponenter som beskrevet [23]. En angivet antal celler blev suspenderet i PBS:Matrigel® (01:01) og injiceret subkutant (s.c.) i 6-8 uger gamle NOD /SCID-mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Dyrene blev overvåget regelmæssigt for at bestemme tumor dannelse og aflives, da de blev døende eller havde for stor tumor byrde. Alle eksperimenter dyr blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Massachusetts General Hospital Sub-udvalg for forskning og Animal Care (protokol nummer 2005N000273). Alle bestræbelser var at minimere lidelse.

For fortsat formering i mus blev xenotransplantattumorer skåret ud og enzymatisk behandlet til en enkelt celle suspension. Suspensionen blev udtømt for muse H-2K

d + celler under anvendelse MACS perler (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland) og de resterende tumorafledte celler blev reinjiceret subkutant i ny modtager NOD /SCID-mus. Alle de primære humane papillære serøse tumorer i æggestokkene udnyttes i denne undersøgelse havde gennemgået 4-5 passager

in vivo

og serøs histologi af hver blev opretholdt over seriel transplantation processen. Dyrene blev huset og vedligeholdes i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier.

Behandling af mus med Hh pathway hæmmere

Cyclopamin.

Mus bærer matchede mellemstore tumorer (300-600 mm

3) fra den humane serøs ovariecancer prøve SOC11 blev randomiseret i to grupper på seks mus. Hver kohorte fik enten 25 mg /kg cyclopamin eller bærer (30% (vægt /volumen) 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPBCD) i 0,1 M natriumcitrat, pH 3,0) ved daglig oral sondeernæring. Behandlingen periode strakte sig 13 dage. Tumormålinger og animalske vægte blev vurderet hver 4. dag. Tumorer blev målt ugentligt med skydelærer og tumorvolumen (mm

3) blev bestemt ved anvendelse af formlen [længde (mm) x bredde (mm) x bredde (mm)] /2. Mus vægte blev vurderet hver 4-7 dage for at overvåge potentielle toksicitet forbundet med hver behandling. Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden blev dyrene aflivet, og tumorerne blev høstet til yderligere analyse

IPI-926:.

Fireogtyve mus med SOC12, SOC13 eller SOC14 xenotransplantattumorer blev randomiseret i fire kohorter med matchede tumor volumen (300-600 mm

3). Paclitaxel /carboplatin (T /C) alene kohorte modtaget ugentlig intraperitoneal (ip) injektion af 15 mg /kg paclitaxel og 50 mg /kg carboplatin og IPI-926 køretøj 5% (vægt /volumen) (HPBCD) administreret hver anden dag ved oral sondeernæring. IPI-926 alene kohorte fik 40 mg /kg IPI-926 hver anden dag ved oral sonde og Cremophor:ethanol (01:01, paclitaxel køretøj) og saltvand (carboplatin køretøj) med ugentlig intraperitoneal indsprøjtning. Mus i T /C + IPI-926 kohorte modtog ugentlige paclitaxel (15 mg /kg, i.p.) og carboplatin (50 mg /kg, i.p.) og 40 mg /kg IPI-926 (hver anden dag, oral sonde). Kontrolgruppen kohorte modtaget paclitaxel, carboplatin og IPI-926 køretøjer på dosering passende for hver. Tumorvolumener og mus vægte blev vurderet hver 4-7 dage som beskrevet ovenfor.

sidste dosis i T /C kohorten blev administreret på dag 14. Efter 21 dage mus i kontrolgruppen og IPI-926 alene kohorter blev aflivet, og deres tumorer blev høstet. Portioner af hver tumor blev lynfrosset til RNA-analyse og indlejret i paraffin til histologisk analyse.

Efter afslutningen af ​​T /C-behandling, mus i T /C alene og T /C + IPI-926 kohorter fortsatte at modtage enten IPI-926 køretøj (T /C alene gruppen) eller 40 mg /kg IPI-926 (T /C + IPI-926-gruppen) hver anden dag ved oral sondeernæring. Denne vedligeholdelsesbehandling blev udført i 18-30 dage. Ved slutningen af ​​reservekravsperioden, blev dyrene aflivet og tumorer blev høstet og forarbejdet til RNA og histologiske analyser som beskrevet ovenfor.

Akut IPI-926 behandling

Mus huser xenografter (300-600 m

3) afledt af SOC12, SOC13 eller SOC14 blev behandlet med enten 40 mg /kg IPI-926 eller IPI-926 køretøj ved oral sondeernæring. Efter 24 timer blev dyrene aflivet. Deres tumorer blev høstet og portioner af hver blev lynfrosset til RNA-analyse og indlejret i paraffin.

RT-PCR-analyse

RNA blev isoleret fra frosset tumorvæv under anvendelse af GenElute ™ pattedyr-RNA-ekstraktionskit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved at følge producentens instruktioner. To mikrogram isolerede RNA blev anvendt til at syntetisere cDNA under anvendelse af Invitrogen Superscript ™ Vilo kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Primere og prober til mus

Gli1

blev købt fra Applied Biosystems Inc. (Carlsbad, CA, katalognummer Mm00494645_m1). Primere og prober til menneske

Gli1

var designet in-house: fremad: 5′-CTTTCATCAACTCGCGATGC-3 ‘; omvendt: 5’-GCTCATGGTGCCAATGGAG-3 ‘; sonde: 5’FAM-CATCTCCAGGAGGCTCCTACGGTCA TC TAMRA-3 ‘. Primere blev designet til at spænde over exon-exon junctions at forhindre detektion af genomisk DNA. Ekspressionsniveauerne for de menneskelige og mus

Gli1

gener blev normaliseret til GAPDH og kvantificeres som beskrevet af Applied Biosystems Inc.

Ud over

Gli1

mRNA, analyserede vi

SHH

,

SMO

,

og Ptch1

mRNA-niveauer i de 4 patientprøver anvendes til at generere tumoreksplantater til afprøvning af inhibering af Hhog pathway. Primere og prober til menneskelig

SHH

(katalog nummer Hs00179843_m1),

SMO

(katalog nummer Hs00170665_m1), og

Ptch1

(katalog nummer Hs00970980_m1) blev købt fra Applied Biosystems Inc . (Carlsbad, CA).

ekspressionsniveauerne for mennesket

SHH

,

SMO

,

og Ptch1

gener blev normaliseret til GAPDH og kvantificeres som beskrevet af Applied Biosystems Inc.

Analyse af

Gli1

udtryk i menneskelig æggestokkene tumor stroma

High-grade sene stadier serøse primære ovarietumorer prøver blev indhentet før kemoterapi fra 19 ovariecancerpatienter indlagt på Brigham and Women Hospital mellem 1990 og 2000. Klassifikation blev bestemt i henhold til den Internationale sammenslutning af gynækologi og obstetrik standarder. Alle prøver og deres tilsvarende kliniske oplysninger blev opnået under IRB-godkendte protokoller. Mikrodissektion og RNA-isolering blev udført som tidligere beskrevet [24]. Kort fortalt blev fibroblaster fra 7 um frosne snit mikrodissekeres anvendelse af en MD LMD laser microdissecting mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland) og lyseret i RLT lysepuffer (Qiagen, Valencia, CA). RNA blev ekstraheret og oprenset under anvendelse af RNeasy Micro (Qiagen, Valencia, CA). Total RNA prøver blev kvantificeret og kontrolleret for kvalitet med en Bioanalyzer 2100-system (Agilent, Palo Alto, CA) og derefter amplificeret som tidligere beskrevet [24]. Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) blev udført på 50 ng dobbelt-amplificeret produkt fra de 19 prøver vha primer sætter specifik for

Gli1

(fremad ACCCCCTGGACTCTCTTGAT, omvendt GACACTCATGTTGCCCACAG). En iCycler iQ Real-time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) blev anvendt i forbindelse med Superscript III Platinum SYBR Green One-Step QRT-PCR-kittet (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner.

Statistical Analysis

Ikke-parametriske Wilcoxan Rank sum test for uparrede prøver blev anvendt til at sammenligne tumor størrelser i cyclopamin og IPI-926 behandling eksperimenter. Students t-test blev anvendt til bestemmelse af den statistiske signifikans af resultater opnået i IPI-926 akut og langvarig behandling eksperiment. Signifikans blev sat til p ≤ 0,05. STATA (College Station, TX) v10 software blev anvendt. Overlevelsen blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-version 5.00 til Windows (GraphPad Software, San Diego California USA).

Resultater

Shh og Gli1 udtryk i humane ovarietumorer

Seneste undersøgelser har understreget den rolle, som Hh signalvejen i udviklingen og progressionen af ​​faste tumorer [25]. Vi vurderede den relative ekspression af HH pathway medlemmer Shh og Gli1 i en delmængde af tumorer i æggestokkene. Som vist i figur 1A, immuohistochemical analyse af Shh-ekspression på et væv microarray omfatter godartede og ondartede tumorer bestemt, at 47% af de vurderede maligne epiteliale tumorer i æggestokkene havde påviselige niveauer af Shh-ekspression. Til sammenligning blev Shh-ekspression påvist i kun 1 af 5 ikke-epiteliale ovarietumorer. Som det fremgår af de i figur 1A eksempler, både niveauet og distribution af Shh udtryk varierede meget i de analyserede tumorer. Vi undersøgte derefter udtryk for

Gli1

mRNA i de enkelte primære humane papillære serøse ovarietumorer SOC1-SOC10 (se tabel S1 for patient detaljer) ved RT-PCR. Vi observerede en lang række

Gli1

mRNA-ekspression over de analyserede tumorer (figur 1B). Derudover analyserede vi

SHH

,

SMO

,

Ptch1

,

og Gli1

mRNA niveauer i de 4 individuelle patientprøver vi bruges til at generere tumor xenotransplantater til analyse virkningen af ​​Hh pathway inhibering på æggestokkene tumorvækst

in vivo

(figur 2). I hver af de tumorer,

Gli1

SMO

blev mere rigeligt udtrykt i forhold til

Ptch1

. Der var lidt at ingen

SHH

mRNA udtrykt i disse prøver. Tilsammen er disse udtryk analyser antyder, at Hh signalvejen aktiveres i en undergruppe af humane ovarietumorer som tidligere rapporteret.

A. Immunohistokemisk analyse af Shh-ekspression blev udført på et væv microarray bærer 64 individuelle primære ovarietumorer at vurdere både hyppigheden og omfanget af Shh-ekspression i human ovariecancer. The Shh farvning i en dårligt differentieret serøs cystadenocarcinoma (øverste venstre panel), en dårligt differentieret mucinøs cystadenocarcinoma (øvre højre panel), en veldifferentieret cystadenocarcinoma (nedre venstre panel), og en dårligt differentieret adenocarcinom (nederste højre panel) er vist. Tabellen opsummerer hyppigheden af ​​Shh farvning i de godartede tumorer og ikke-epitelial og epitelial maligniteter stede i æggestokkene tumor microarray. B. Real-time Q-PCR blev udført til analyse af

Gli1

mRNA-niveauer i 10 primære humane papillære serøse æggestokkene kræftsvulster. Primere specifikke for menneskers

Gli1

og

GAPDH

blev brugt. For hver prøve niveauet af

Gli1

mRNA i forhold til niveauet af

GAPDH

mRNA vises.

udtryk for

Gli1

,

Ptch1

,

SHH

og

SMO

blev analyseret ved RT-qPCR i 4 primære humane serøse tumorer i æggestokkene (SOC11-SOC14) etableret som xenotransplantater i NOD /SCID-mus . Primere specifikke for hvert menneske gen og menneskelige

GADPH

blev brugt. For hver tumor, niveauerne af hvert gen i forhold til

GADPH

mRNA vises.

Hæmning af Hh signalering blokerer væksten af ​​humane serøse æggestokkene tumorxenoplantater

for at vurdere den funktionelle betydning af Hh-vejen i progressionen af ​​ovariecancer, vi behandlede mus, der huser humane serøse æggestokkene tumorxenotransplantater frembragt fra platin følsomme tumor SOC11 med enten Hh inhibitor cyclopamin eller køretøj og vurderes regelmæssigt virkningen af ​​hver behandling på tumorvolumen. I de cyclopaminbehandlede mus blev tumorvækst udelukket i behandlingsperioden tretten dage resulterer i en signifikant (p 0,004) faldt tumorvolumen på dag 13 i forhold til den, der blev observeret i de bærerbehandlede dyr (figur 3). Minimal toksicitet blev observeret i cyclopaminbehandlede behandlede dyr uden observeret statistisk forskellige ændringer i mus vægt (Figur S1).

Mus bærer menneskelige papillære serøse æggestokkene tumorxenoplantater fra prøve SOC11 blev randomiseret i 2 kohorter med matchede tumor volumen og behandlet med enten vehikel eller cyclopamin. Tumorvolumener blev vurderet regelmæssigt. Ændring i tumorvolumen er vist i forhold til tumorvolumen ved begyndelsen af ​​eksperimentet. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (S.E.M.). Betydningen blev bestemt ved anvendelse af en Wilcoxon rank sum test.

Vores analyser af cyclopamins virkning på tumor- xenograft vækst foreslået, at inhibering af Hh-signalering kan være en effektiv metode til styring af æggestokkene tumorprogression. Vi næste udført tilsvarende forsøg ved hjælp af mere kemisk potente og klinisk relevant Hh pathway inhibitor IPI-926 i øjeblikket i fase I /II kliniske forsøg i ikke-æggestokkene solide tumorer. IPI-926 er afledt af cyclopamin og har forbedret farmaceutiske egenskaber, herunder højere potens, en længere halveringstid og øget biotilgængelighed. Vi var især interesseret i at undersøge den mulige nytte af IPI-926 i kombination med standard første linje kemoterapi. Vi udførte tre separate forsøg under anvendelse af uafhængige primære humane serøse æggestokkene xenotransplantattumorer (SOC12, SOC13, og SOC14) at analysere antitumoraktiviteten af ​​IPI-926 alene eller i kombination med paclitaxel og carboplatin (T /C). De tumorxenografter blev afledt fra 2 patienter med platin resistent sygdom (SOC12, SOC13) og 1 patient med platin følsom sygdom (SOC14) og resultaterne af disse analyser er vist i figur 4. Mus der bærer primære humane serøse æggestokkene tumorxenografter blev randomiseret i fire behandlingsgrupper, der modtog enten vehikel kontrol, IPI-926 alene, T /C alene eller IPI-926 og T /C. Over den indledende behandling (dag 0-21), tumorvolumen i mus behandlet med vehikelkontrollen steget dramatisk (Figur 4A, 4B, 4C). Behandling af SOC12, SOC13 og SOC14 xenotransplantater med T /C alene resulterede i et signifikant fald i tumorvolumen (p 0,05; p 0,007; p 0,001) i forhold til kontrollen behandling. Ligesom cyclopamin, IPI-926 som et enkelt middel havde en statistisk signifikant hæmmende virkning på tumorvækst i forhold til køretøjet kontrol for både SOC13 (figur 4B, s 0,007) og SOC14 (figur 4C, s 0,01). Kombinationen af ​​IPI-926 og T /C viste ingen større antitumoraktivitet end T /C alene for alle testede tumorer. I disse analyser, observerede vi ingen signifikant vægttab i dyr behandlet med IPI-926 som et enkelt middel sammenlignet med bærerbehandlede dyr (figur S2).

Mus bærer tumorer afledt fra patienter diagnosticeret med serøs ovariecancer randomiseredes i 4 kohorter (n = 4-6 dyr pr behandling kohorte) med matchede tumor mængder og udsat for de angivne behandlingsregimer. Tre uafhængige papillære serøse ovariecancer prøver, SOC12 (A), SOC13 (B) og SOC14 (C) blev anvendt som biologiske replikater. Kohorter blev indledningsvis behandlet med vehikel alene (kontrol), paclitaxel og carboplatin (T /C) alene, IPI-926 alene eller T /C + IPI-926 som angivet. Den sidste T /C dosis blev afgivet på dag 14 (angivet med den stiplede linje). Procentvise ændring i tumorvolumen repræsenterer ændringen i tumorvolumen i forhold til tumorvolumen ved begyndelsen af ​​eksperimentet. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (S.E.M.). Signifikans blev bestemt under anvendelse af en Wilcoxon rank sum test.

Vi undersøgte dernæst anti-tumor aktiviteten af ​​IPI-926 efter ophør af T /C-behandling. For disse analyser, de mus, der modtager enten T /C alene eller i kombination med IPI-926 blev administreret deres tredje og sidste ugentlige dosis af T /C på dag 14 af behandlingsplanen (stiplet linje, figur 4). Dyrene blev derefter opretholdt på begge køretøj (T /C alene behandlet kohorte) eller IPI-926 (T /C + IPI-926 behandlede kohorte) og tumorvolumener blev vurderet med jævne mellemrum. Som vist i figur 4A, 4B og 4C, fortsat administration af IPI-926 efter afslutningen af ​​T /C-behandling opretholdes tumorregression, og i et tilfælde (SOC13, figur 4B), resulterede i et yderligere fald i tumorvolumen til niveauer, der var næsten ikke målbart. I modsætning hertil observerede vi støt stigende tumorvækst i mus behandlet med vehikel efter ophør af T /C administration. Således fortsatte IPI-926 behandling resulterede i en signifikant (p 0,02). Forskellen i tumor volumen i forhold til den observeret i køretøjer behandlede mus for alle tre individuelle primære tumorer

IPI-926 hæmmer Hh pathway aktivitet i både stromaet og tumor

Nye data har antydet, at Hh-signalering i stroma er påkrævet for tumorudvikling i muse xenograftmodeller af pancreas og colon cancer (25). For at vurdere virkningsstedet af IPI-926 i vores system, vi analyserede

Gli1

mRNA-ekspression i både mus stroma og humane tumorceller efter enten akut eller langvarig behandling med IPI-926. For de akutte undersøgelser blev mus, der huser xenotransplantater genereret fra SOC12, SOC13 og SOC14 behandlet med enten bærer eller IPI-926 i 24 timer. Efter tumor høst, den relative ekspression af muse og human

Gli1

blev vurderet ved RT-PCR under anvendelse af artsspecifikke primere. Den akutte IPI-926 behandling førte til en hurtig markant fald i mus

Gli1

med ingen hæmning af menneskelig

Gli1

udtryk (figur 5, øverste panel). Vi analyserede også stromale og tumorspecifikke

Gli1

ekspression i SOC12, SOC13 og SOC14 xenotransplantater høstet fra mus behandlet med enten vehikel eller IPI-926 i 21 dage i undersøgelserne vist i figur 4. Ligesom i den akutte indstilling, langvarig IPI-926 behandling ført til en betydelig hæmning af

Gli1

mRNA ekspression i stromale (p 0,05) rum (figur 5, nederste panel). I modsætning til hvad også blev observeret i den akutte indstilling, moderat inhibering af

Gli1

mRNA-ekspression blev observeret i tumoren (p 0,03). Efter længere tids behandling

Gli1

mRNA ekspressionsniveauer i xenotransplantattumorer afledt af SOC12, SOC13, og SOC14 blev analyseret ved real time kvantitativ PCR efter behandling af mus med IPI-926 i 24 timer (øverste panel) eller 21 dage (nederste panel). De relative niveauer af humant (venstre panel) og mus (højre panel)

Gli1

mRNA-ekspression blev analyseret under anvendelse artsspecifikke primere. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (S.E.M.). Betydningen (# p≤0.03, * p = 0,05, ** p≤0.001) blev bestemt ved hjælp af Students t-test.

Høj

Gli1

udtryk i stroma af menneskelig papillære serøse ovarietumorer korrelerer med dårlig overlevelse

for at validere, at

Gli1

mRNA udtrykkes i stroma af humane serøse tumorer i æggestokkene, vi undersøgte den relative ekspression af

Gli1

i stroma mikrodissekeres fra en anden kohorte af 19 humane primære æggestokkene serøse tumorer (tabel S2). Mikro-dissekeret stroma af disse tumorer demonstrerede et komplet udvalg af

Gli1

mRNA-ekspression (data ikke vist). Univariate overlevelse analyse viste, at høj

Gli1

mRNA ekspression i stroma korreleret med en betydeligt forværret overlevelse (figur 6).

Overlevelse analysedata opnået for

Gli1

mRNA udtryk på Mikrodissekterede stroma prøver af 19 patienter, der anvender QRT-PCR validering. Højere

Gli1

mRNA-ekspression korreleret med nedsat overlevelse (Log-rank test, p 0,015) med en median overlevelse på 26.50 måned for patienter med lav

Gli1

mRNA-ekspression versus 16 måneder for de patienter, som havde tumorer med højere

Gli1

mRNA-ekspression i stroma.

diskussion

Mange forskere har dokumenteret rolle Hh signalvejen i udvikling og vedligeholdelse af solide tumorer [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Nylig dokumentation antyder, at aktivering af denne pathway er involveret i patogenesen af ​​ovariecancer (18, 20, 21). I vores undersøgelse terapeutisk målretning af denne vej førte til inhibering af human papillære serøs tumorvækst.