PLoS ONE: Resveratrol Forbedrer antitumoraktivitet af TRAIL i prostatakræft Xenografter gennem Aktivering af FOXO Transskription Factor

Abstrakt

Baggrund

Resveratrol (3, 4 ‘, 5 tri-hydroxystilbene), en naturligt forekommende polyphenol, udviser anti-inflammatorisk, antioxidant, cardioprotektive og antitumoraktiviteter. Vi har for nylig vist, at resveratrol kan øge apoptose-inducerende potentiale TRAIL i prostata kræftceller via flere mekanismer

in vitro

. Derfor blev nærværende undersøgelse designet til at validere, om resveratrol kan øge apoptose-inducerende potentiale TRAIL i en xenograft model af prostatakræft.

Metodologi /vigtigste resultater

Resveratrol og TRAIL alene hæmmet vækst af PC-3 xenotransplantater i nøgne mus ved inhibering af tumorcelleproliferation (PCNA og Ki67-farvning) og inducere apoptose (TUNEL-farvning). Kombinationen af ​​resveratrol og TRAIL var mere effektive til at hæmme tumorvækst end enkelt middel alene. I xenotransplanterede tumorer, resveratrol opreguleres udtrykkene for TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, Bax og p27

/K IP1, og inhiberede ekspression af Bcl-2 og cyclin D1. Behandling af mus med resveratrol og TRAIL alene inhiberede angiogenese (som påvist ved reduceret antal blodkar og VEGF og VEGFR2 positive celler) og markører for metastase (MMP-2 og MMP-9). Kombinationen af ​​resveratrol med TRAIL yderligere inhiberede antallet af blodkar i tumorer, og cirkulerende endotelvækstfaktorreceptor 2-positive endotelceller end enkelt middel alene. Endvidere resveratrol inhiberede cytoplasmatiske phosphorylering af FKHRL1 resulterer i dens forbedrede aktivering som påvist ved forøget DNA-bindingsaktivitet.

Konklusioner /Signifikans

Disse data antyder, at resveratrol kan øge apoptose-inducerende potentiale TRAIL ved at aktivere FKHRL1 og dets målgener. Evnen af ​​resveratrol til at hæmme tumorvækst, metastase og angiogenese, og forbedre det terapeutiske potentiale TRAIL antyder, at resveratrol alene eller i kombination med TRAIL kan anvendes til styring af prostatacancer

Henvisning:. Ganapathy S, Chen Q, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) Resveratrol Forbedrer antitumoraktivitet af TRAIL i prostatakræft Xenografter gennem Aktivering af FOXO Transskription Factor. PLoS ONE 5 (12): e15627. doi: 10,1371 /journal.pone.0015627

Redaktør: Hiranmoy Das, The Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: September 19, 2010; Accepteret: November 17, 2010; Udgivet: December 28, 2010

Copyright: © 2010 Ganapathy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Resveratrol (3, 4 ‘, 5 tri- hydroxystilbene), et naturligt forekommende polyphenol, udviser pleiotropiske sundhedsmæssige fordele, herunder anti-inflammatorisk, antioxidant, cardioprotektive og antitumoraktiviteter [1], [2], [3], [4]. I øjeblikket talrige prækliniske resultater antyder resveratrol som et lovende middel til forebyggelse og /eller behandling af kræft. Som en potentiel anti-cancer middel, er resveratrol vist sig at hæmme eller forsinke væksten af ​​forskellige kræftceller

in vitro

og implanteret tumorer in vivo [5], [6], [7], [8] , [9]. Resveratrol er blevet vist at inhibere aktiveringen af ​​JAK2-STAT3, Src-STAT3, AKT og IKK-NFKB veje og til at inducere apoptose i flere cancercellelinier [10], [11], [12], [13]. Vi har for nylig vist, at resveratrol nedreguleret ekspression af Bcl-2, Bcl-X

L og survivin og opreguleres ekspressionen af ​​Bax, Bak, PUMA, Noxa, og Bim og dødsreceptorer (TRAIL-R1 /DR4 og trail R2 /DR5) [1], [14], [15]. Desuden behandling af prostatacancer celler med resveratrol resulterede i dannelse af reaktive ilt arter (ROS), translokation af Bax til mitokondrier og efterfølgende fald i mitochondriemembranpotential, frigivelse af mitokondrielle proteiner (cytochrom c, Smac /DIABLO, og AIF) til cytosol aktivering af effektor caspase-3 og caspase-9, og induktion af apoptose [1], [14], [15]. Resveratrol-induceret ROS produktion, blev caspase-3-aktivitet og apoptose inhiberet af N-acetylcystein, hvilket tyder på ROS produktion, i det mindste delvis, spiller en rolle ved mediering anticancer aktiviteter af resveratrol [1], [14], [15]. Resveratrol forbedret apoptose-inducerende potentiale TRAIL i PC-3 celler og sensibiliserede TRAIL-resistent prostatacancer LNCaP celler

in vitro

[1], [14], [15]. Samlet set antyder disse data at resveratrol kan regulere flere signalveje og har flere terapeutiske fordele.

PI3K signalering spiller en central rolle i intracellulære signaltransduktionsveje der er involveret i cellulær transformation, cellevækst, og tumorigenese [16], [ ,,,0],17]. Inaktivering af Akt resulterer i dephosphorylering og aktivering af FOXO transkriptionsfaktorer, rapporteret at mediere cellecyklusstandsning, DNA-reparation, og apoptose [18], [19]. Disse transkriptionsfaktorer, hører til ‘O’ undergruppe af vingede-helix /forkhead transskription-faktor familie, består hovedsagelig af fire medlemmer FOXO1, FOXO3a, FOXO4, og FOXO6 [20]. FOXO proteiner er evolutionært bevarede transkriptionsfaktorer impliceret i flere grundlæggende cellulære processer, der fungerer som slutpunkt for transkriptionelle programmer involveret i apoptose, stress respons og lang levetid [21], [22]. Da der ofte observeres ophævelse af FOXO funktion i human cancer, vil reaktivering af FOXO proteiner være en attraktiv strategi for kræftbehandlingen og forebyggelse. De FOXO proteiner integrere regulerende input fra en række opstrøms signalveje, vigtigst i afhængighed vækstfaktor og stress signalering [23]. For nylig er FOXO faktorer blevet etableret som tumorsuppressorer, fremme transkriptionen af ​​pro-apoptotiske molekyler som FasL og Bim når PI3K /AKT pathway nedreguleres på grund af næringsstof eller serumudsultning og cellulær stress [24], [25]. Triple knockout musemodeller bevist tumor suppressor egenskaber Foxos, som mus samtidigt mangler de vigtigste medlemmer af pattedyr FOXO underfamilien, FOXO1, FOXO3a og FOXO4, er tilbøjelige til at udvikle hemangiomas og lymfoproliferative sygdomme [26]. Omvendt den enkelte eller parret inaktivering af FOXO1, FOXO3a eller FOXO4 resulterede i en mindre alvorlig fænotype, støtter tanken om funktionel redundans af disse FOXO faktorer [26]. Endvidere tvunget ekspression af FOXO er blevet vist, at inhibere tumorgenese i xenograftmodeller i nøgne mus [27], [28]. Derfor er reaktivering af FOXO baseret på dens tumorundertrykkende egenskaber betragtes som en meget attraktiv anti-cancer-strategi. Da FOXO proteiner blev rapporteret til at være kritiske formidlere af apoptose induceret af lægemidler mod cancer, vi postuleret, at FOXO udtryk eller transkriptionsaktivitet kunne være vigtig begivenhed i mediere effekten af ​​resveratrol.

TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL ) har vist sig at TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 [29]. Vi og andre har vist, at TRAIL kan inducere apoptose i forskellige cancer celletyper [29], [30], [31], [32], [33]. Baseret på prækliniske data fremgår det, at TRAIL har meget lovende som et selektivt anticancer middel [31], [32]. Resveratrol har vist sig at forbedre det terapeutiske potentiale af TRAIL

in vitro

[14], [34]. Samspillet af resveratrol og TRAIL blev blokeret af enten dominant negativ FADD eller caspase-8 siRNA [14], [15]. Kombinationen af ​​resveratrol og TRAIL forbedret de mitokondrielle dysfunktioner under apoptose. Resveratrol behandling kan aktivere den ydre TRAIL-receptor-medieret død pathway for derved at forøge følsomhed over for TRAIL i prostatacancerceller. Men de molekylære mekanismer, som resveratrol kan øge terapeutiske potentiale af TRAIL

in vivo

er ikke blevet undersøgt.

Formålet med vores undersøgelse var at undersøge de molekylære mekanismer, som resveratrol forbedrer den terapeutiske potentiale af TRAIL i prostatacancer-xenotransplantater i nøgne mus. Vores resultater viste, at resveratrol inhiberede PC-3 xenograft vækst og markører for metastase, og angiogenese gennem aktivering af FOXO transkriptionsfaktorer. Således er vores data tyder på, at resveratrol kan bruges alene eller i kombination med TRAIL for forvaltningen af ​​af prostatakræft.

Resultater

Resveratrol forbedrer antitumor tumor aktivitet af TRAIL i PC-3 xenotransplantater

in vivo

Vi har for nylig vist, at resveratrol kan øge apoptose fremkaldende potentiale TRAIL

in vitro

. Derfor, i den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om resveratrol kan øge antitumoraktiviteten af ​​TRAIL

in vivo

. PC-3-celler blev xenotransplanteret i Balb c nøgne mus. Efter dannelse af tumorer, blev disse mus behandlet med resveratrol, TRAIL, eller resveratrol plus TRAIL i 6 uger, og virkningerne af disse agenter på tumorvækst blev undersøgt. Resveratrol og TRAIL alene hæmmede væksten af ​​PC-3-xenografter (fig. 1). Til sammenligning, kombinationen af ​​resveratrol og TRAIL var mere effektive til at hæmme tumorvækst end enkelt middel alene.

(A), blev PC-3-celler injiceret i de rigtige flanker af Balb c nøgne mus. Efter tumordannelse (ca. 100 mm

3), blev mus behandlet med saltvand, resveratrol (30 mg /kg, tre dage om ugen), TRAIL (15 mg /kg, fire gange i løbet første tre uger) eller resveratrol plus TRAIL . Tumorvolumen blev målt ugentligt. Data repræsenterer gennemsnit ± SE. *, # Og $ er væsentligt forskellige fra kontrol, P. 0,05)

Disse data tyder på, at resveratrol kan øge antitumoraktiviteten af ​​TRAIL i prostatakræft

Regulering af tumor. celleproliferation og apoptose ved resveratrol og /eller TRAIL i PC-3 xenotransplantater

tumorcelleproliferation og apoptose kan regulere størrelsen af ​​tumoren på et givet tidspunkt. Derfor udførte vi immunhistokemi i tumorvæv at måle ekspressionen af ​​Ki67 og PCNA, og TUNEL-assay til måling af apoptose (fig. 2A). Tumorcelleproliferation blev målt ved at tælle Ki67 og PCNA-positive celler, og apoptose blev målt ved at tælle TUNEL-positive celler (fig. 2B-D). Behandling af mus med resveratrol og TRAIL alene resulterede i inhibering af tumorcelleproliferation, og induktion i apoptose. Kombinationen af ​​resveratrol og TRAIL var mere effektive til at inhibere tumorcelleproliferation og inducere apoptose end enkelt middel alene. Disse data tyder på, at resveratrol har virket effektivt alene, kan øge antitumoraktiviteten af ​​TRAIL i prostatacancer.

(A), Immunhistokemi blev udført i tumorvæv afledt af kontrol, resveratrol og /eller TRAIL behandlede mus på uge 6 til måling af celleproliferation med Ki67 og PCNA-farvning og apoptose ved TUNEL-assay. (B, C og D), Kvantificering af Ki67, PCNA og TUNEL-positive tumorceller. Tumor lysbilleder af forskellige behandlingsgrupper blev visualiseret under mikroskop, og Ki67, PCNA og TUNEL-positive celler blev kvantificeret. Data repræsenterer gennemsnit ± SE. * Og ** er signifikant forskellige fra deres respektive kontroller, P. 0,05)

In vivo

regulering af døden receptor TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 af resveratrol og /eller spor

Da resveratrol forbedrer det terapeutiske potentiale af TRAIL ved at inducere apoptose

in vivo

, søgte vi at undersøge de molekylære mekanismer, som resveratrol forbedrer antitumoraktivitet TRAIL i PC 3 xenotransplantater. Vi næste undersøgt virkningerne af resveratrol og /eller TRAIL på ekspressionen af ​​dødsreceptorer (TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5) ved immunhistokemi i tumorvæv afledt

in vivo

eksperiment (fig. 3A , venstre og højre paneler). Behandling af mus med resveratrol forbedret udtrykkene for DR4 og DR5. TRAIL lidt inducerede ekspression af DR4 og DR5. På den anden side, behandling af mus med en kombination af resveratrol plus TRAIL viste forbedrede udtryk for DR4 og DR5 proteiner end det mus behandlet med resveratrol alene eller TRAIL alene væsentligt.

(A), Immunhistokemi blev udført for at måle udtrykkene for TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 i tumorvæv afledt fra kontrol og behandlede mus i uge 6. Kvantificering af DR4 og DR5 positive celler er også vist på højre panel. (B), blev Udtryk for TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5 og β-actin i tumorvæv afledt i uge 6. Western blot-analyse udført for at måle ekspressionen af ​​DRs (venstre panel). Kvantificering af DR4 og DR5 positive tumorceller (højre panel). (C), Måling af DR4 og DR5 ved ELISA. Proteiner ekstrakter blev fremstillet og udtrykkene for DRs blev målt i henhold til producentens anvisninger.

Vi bekræftede de immunhistokemiske data ved at undersøge ekspressionen af ​​disse proteiner ved Western blot analyse (fig. 3B). Behandling af mus med Resveratrol og TRAIL alene resulterede i opregulering af dødsreceptorer DR4 og DR5. Til sammenligning resveratrol plus TRAIL behandlinger havde flere virkninger på induktionen af ​​DR4 og DR5 sammenlignet med enkelt middel alene. Disse data er i overensstemmelse med immunhistokemiske data, hvor proapoptotiske DR4 og DR5 proteiner blev opreguleres.

Vi bekræftede næste i immunhistokemi og Western blot data ved at undersøge udtryk for DRs ved ELISA (fig. 3C, højre panel). Behandling af mus med resveratrol og TRAIL alene opreguleres ekspressionen af ​​dødsreceptorer (DR4 og DR5). Til sammenligning kombinationen af ​​resveratrol plus TRAIL inducerede flere DR4 og DR5 udtryk end enkeltstof alene. Disse data er i overensstemmelse med immunhistokemi og Western blot data, hvor proapoptotiske DR4 og DR5 proteiner blev opreguleret af resveratrol og TRAIL. Opregulering af DRs kan øge apoptose-inducerende potentiale TRAIL.

In vivo

regulering af Bel-2 familiemedlemmer og cellecyklusregulerende proteiner ved resveratrol og /eller TRAIL

Da Bcl-2-familiemedlemmer spiller en stor rolle i apoptose, forsøgte vi at undersøge ekspressionen af ​​Bax og Bcl-2 i tumorvæv afledt af resveratrol og /eller TRAIL-behandlede mus (fig. 4A, venstre panel). Behandling af mus med resveratrol og TRAIL alene resulterede i opregulering af Bax, og inhibering af Bcl-2-ekspression. Til sammenligning, kombinationen af ​​resveratrol plus TRAIL var mere effektiv til at opregulere Bax og inhibering Bcl-2. Vi bekræftede næste Western blot data ved at undersøge udtrykkene for disse proteiner ved immunhistokemi (fig. 4A, midterste og højre paneler). Behandling af mus med resveratrol opreguleres ekspressionen af ​​Bax og inhiberede ekspression af Bcl-2. Til sammenligning, behandling af mus med en kombination af resveratrol plus TRAIL havde flere virkninger på opregulering af Bax og inhibering af Bcl-2 end enkelt middel alene.

(A), Western blot-analyse blev udført for at måle udtryk for Bax og Bd-2 i tumorvæv afledt af kontrol, resveratrol og /eller TRAIL behandlede mus på uge 6 (venstre panel). Immunhistokemi blev udført for at måle udtryk for Bax og Bd-2 i tumorvæv afledt af kontrol og narkotika behandlede mus på uge 6 (midterste panel). Kvantificering af Bax og Bcl-2-positive celler i tumorceller (højre panel). (B), blev Western blot-analyse udføres for at måle udtrykkene for p27

/KIP1 og cyclin D1 i tumorvæv afledt af kontrol- og lægemiddelbehandlede mus på uge 6 (venstre panel). Immunhistokemi blev udført for at måle udtryk for p27

/KIP1 og cyklin D1 i tumorvæv afledt af kontrol og narkotika behandlede mus på uge 6 (midterste panel). Kvantificering af p27

/KIP1 og cyklin D1 positive celler i tumorvæv (højre panel).

Vi næste undersøgt virkningerne af resveratrol og /eller spor på ekspression af P27

/KIP1 og cyclin D1 i tumorvæv ved Western blotting og immunhistokemi (fig. 4B). Behandling af mus med resveratrol resulterede i induktion af cellecyklusinhibitor p27

/KIP1 og inhibering af cyclin D1-ekspression (fig. 4B). Til sammenligning TRAIL havde ingen signifikant virkning på p27-ekspression, men lidt inhiberede ekspression af cyclin D1 sammenlignet med kontrolgruppen. Men kombinationen af ​​resveratrol og TRAIL viste, opregulering af p27, og inhibering af cyclin D1 sammenlignet med enkelt middel alene. Vi bekræftede næste de Western blot data med immunhistokemiske data ved at undersøge udtryk for disse proteiner (fig. 4B, midterste og højre paneler). TRAIL har ingen signifikant virkning på ekspressionen af ​​p27, men lidt inhiberede ekspression af cyclin D1. Til sammenligning resveratrol inducerede udtrykkene for p27, og inhiberede ekspression af cyclin D1. Disse data tyder på, at resveratrol kan regulere cellecyklus ved opregulering af ekspressionen af ​​p27 og inhibere ekspressionen af ​​cyclin D1.

In vivo

regulering af MMP-2 og MMP-9-ekspression ved resveratrol og /eller spor

Forhøjede udtryk for matrixmetalloproteinaser (MMP’er) er forbundet med forøget metastatisk potentiale i mange tumorceller [35], [36], [37]. Vi søgte derfor at undersøge effekten af ​​resveratrol på MMP-2 og MMP-9 udtryk i tumorvæv afledt xenotransplanteret nøgne mus ved immunhistokemi og Western blot analyse. Behandling af xenogrfated mus med resveratrol resulterede i inhibering af MMP-2 og MMP-9 udtryk end hos kontrol- eller TRAIL-behandlede gruppe (fig. 5A og B). Kombinationen af ​​resveratrol og TRAIL var mere effektive til at inhibere MMP-2 og MMP-9 udtryk end enkelt middel alene. Vi bekræftede næste de immunhistokemiske data ved at undersøge udtrykkene for disse proteiner ved Western blot analyse (fig. 5C). TRAIL har ingen signifikant effekt på de udtryk for MMP-2 og MMP-9. Til sammenligning resveratrol eller resveratrol plus TRAIL inhiberede udtrykkene for MMP-2 og MMP-9. Disse data tyder på, at resveratrol og /eller TRAIL kan hæmme prostatakræft metastase ved at inhibere MMP-2 og MMP-9.

(A), Immunhistokemi blev udført for at måle udtrykkene for MMP-2 og MMP-9 i tumorvæv afledt af kontrol, resveratrol og /eller TRAILtreated mus i uge 6. (B), Kvantificering af MMP-2 og MMP-9-positive celler i tumorvæv. (C), blev Udtryk af MMP-2, MMP-9 og β-actin i tumorvæv målt på uge 6 ved Western blot-analyse.

In vivo

regulering af angiogenese ved resveratrol og /eller spor

Uanset om regression i tumorvækst ved resveratrol og /eller TRAIL skyldtes hæmning af angiogenese, vi analyserede markører for angiogenese ved immunhistokemi i tumorvæv afledt af kontrol og behandlede mus (fig . 6). Vi først undersøgt virkningerne af resveratrol og /eller TRAIL behandling på antallet af blodkar i tumorvæv ved at udnytte tre forskellige tilgange (Fig. 6A). Blodkar blev undersøgt ved farvning af tumorvæv af H E og antallet af blodkar blev talt ved 400 x forstørrelse. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD. * Eller ** = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. Midterste panel, blodkar kvantificering i tumorer afledt i uge 6. Tumor sektioner fra kontrol- og lægemiddelbehandlede mus blev farvet med anti-CD31-antistof, og antallet af CD31-positive blodkar blev talt. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD. * Eller ** = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. Højre panel blev tumorsnit fra kontrol- og lægemiddelbehandlede mus erhvervet om ugen 6 farvet med anti-von Willebrand faktor (vWF) antistof til at vurdere blodkar. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD. * Eller ** = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (B), venstre panel, immunohistokemi blev udført for at måle ekspressionen af ​​VEGF i tumorvæv afledt af kontrol- og lægemiddelbehandlede mus i uge 6. Højre panel, kvantificering af VEGF-positive celler i tumorvæv. Højre panel, kvantificering af VEGF-positive celler. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD. * Eller ** = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. Bundplade blev udtryk af VEGF og β-actin i tumorvæv afledt i uge 6 målt ved Western blot-analyse. (C), VEGF-receptor 2 (VEGF-R2) -positive cirkulerende endotelceller i mus i uge 6. De blodlegemer fra perifert blod fastgjort til objektglasset blev farvet med anti-VEGF-R2-antistof, og antallet af VEGF-R2 positive celler blev talt under et mikroskop. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD. * Eller ** = signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

Vi næste undersøgt ekspressionen af ​​VEGF ved immunhistokemi og Western blot analyse (figur 6). Undersøgelse af tumorvæv ved immunohistokemi viste, at kontrolmus var steget VEGF-positive endotelceller sammenlignet med resveratrol eller TRAIL-behandlede mus (fig. 6B, venstre og højre paneler). Kombinationen af ​​resveratrol plus TRAIL viste signifikant mindre VEGF farvning end enkeltstof alene. Vi bekræftede næste de immunhistokemiske data for VEGF-ekspression ved at undersøge protein- niveauer ved Western blot-analyse (fig. 6B, nedre panel). Behandling af mus med resveratrol og TRAIL alene inhiberede VEGF-ekspression. Til sammenligning resveratrol plus TRAIL inhiberede ekspressionen af ​​VEGF.

Vi har vist, at antallet af cirkulerende vaskulær endotelvækstfaktor receptor 2 (VEGF-R2) -positive endotelceller korrelerer direkte med stigningen i tumorangiogenese og kan tjene som

in vivo

indikatorer for tumor angiogenese [31], [38]. Som forventet var kontrolmus øget cirkulerende VEGF-R2-positive endotelceller sammenlignet med resveratrol behandlede mus (fig. 6C). Resveratrol plus TRAIL-behandlede gruppe viste signifikant færre VEGFR2-positive celler end resveratrol eller TRAIL behandlede gruppe. Disse data kraftigt viser, at resveratrol kan inhibere tumorvækst ved at inhibere angiogenese, og kan også fremme antitumoraktivitet TRAIL

in vivo

.

In vivo

regulering af transkriptionsfaktor FKHRL1

AKT har vist sig at phosphorylere FKHRL1, og inhiberingen af ​​FKHRL1 phosphorylering forårsager dets nukleare translokation, forstærket DNA-binding og transkriptionsaktivitet [39]. Vi undersøgte dernæst, om antitumoraktiviteter af resveratrol og /eller TRAIL udøves gennem aktivering af FKHRL1 (fig. 7). Resveratrol og TRAIL inhiberede phosphorylering af FKHRL1; dog resveratrol var mere effektivt end TRAIL. Kombinationen af ​​resveratrol og TRAIL havde mere effekt ved inhibering phosphorylering af FKHRL1 end enkelt middel alene. Vi undersøgte dernæst phosphoryleringen af ​​FKHRL1 i tumorvæv ved immunhistokemi (fig. 7B og C). Resveratrol og TRAIL inhiberede de cytoplasmiske niveauer af phosphoryleret FKHRL1 som vist i fig. 7B og kvantificeret i fig. 7C. Kombinationen af ​​resveratrol plus TRAIL havde mere effekt i at hæmme cytoplamic niveauer af phosphoryleret FKHRL1 end enkeltstof alene. Disse data tyder på, at resveratrol og TRAIL kan inhibere phosphorylering af FKHRL1, hvilket muligvis give dets nukleare translokation og aktivering.

(A), Inhibering af FKHRL1 phosphorylering med resveratrol. Western blot-analyse blev udført for at måle ekspressionen af ​​phospho-FKHRL1 i tumorvæv afledt fra kontrol og /eller lægemiddel-behandlede mus i uge 6. (B), Immunhistokemisk undersøgelse af phospho-FKHRL1. Immunhistokemi blev udført for at måle ekspressionen af ​​phospho-FKHRL1 i tumorvæv afledt af kontrol, resveratrol og /eller TRAIL behandlede mus i uge 6. (C), Kvantificering af FKHRL-positive celler i tumorvæv. (D), FKHRL1-DNA bindingsaktivitet. Nukleare ekstrakter blev fremstillet ud fra tumorvæv afledt fra kontrol og lægemiddelbehandlede mus. Gelshift assay blev udført for at måle FKHRL1-DNA-bindende aktivitet som beskrevet i Materialer og Metoder.

Vi næste undersøgte FKHRL1-DNA-bindingsaktivitet ved gelshift assay (fig. 7D). Nukleare ekstrakter blev fremstillet ud fra tumorvæv afledt af resveratrol og /eller TRAIL-behandlede mus. Gelshift data viste, at TRAIL og resveratrol forbedret FKHRL1-DNA bindende aktiviteter. Kombinationen af ​​resveratrol og TRAIL havde signifikant mere FKHRL1-DNA bindende aktivitet end enkeltstof alene. Samlet set antyder disse data at resveratrol og TRAIL kan inhibere phosphorylering af FKHRL1 fører til dens forbedrede nuklear translokation og DNA-bindende aktiviteter.

Discussion

Vi har for nylig vist, at resveratrol inducerer apoptose i trail følsomme PC-3 celler, og sensibiliserer TRAIL-resistente LNCaP celler

in vitro

gennem aktivering af flere signalveje [14], [15]. Resveratrol-induceret apoptose i indgreb mitochondrier, som blev vist ved et fald i mitokondrie membranpotentiale og aktivering af caspase-3 og caspase-9 i begge prostatacancer PC-3 og LNCaP-celler [14], [15]. Resveratrol induceret ekspression af proapoptotiske proteiner (Bax, Bak, PUMA, Noxa og Bim), dødsreceptorer (TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5) og hæmmet udtryk for anti-apoptotiske proteiner (bcl-2 og Bd-X

L) og IAP (XIAP og survivin). I vores seneste undersøgelse, resveratrol reguleret ekspression af TRAIL, DR4, DR5, Bim, p27

/KIP1 og cyklin D1 gennem FOXO transkriptionsfaktorer

in vitro

, og hæmning af FKHRL1, FKHR og AFX af RNAi blokeret disse påvirker af resveratrol [40]. I den foreliggende undersøgelse har vi valideret vores

in vitro

resultater og viste, at resveratrol og TRAIL alene hæmmede væksten af ​​PC-3 xenotransplantater, metastase og angiogenese gennem aktivering af FOXO transkriptionsfaktorer. Interessant kombinationen af ​​resveratrol og TRAIL havde større virkning på inhiberingen af ​​tumorvækst, metastase og angiogenese end hvert middel alene.

In vitro

resveratrol nedreguleret udtrykkene for Bcl-2 og Bcl -X

L og opreguleret udtrykkene for p53, Bax, Bak, PUMA, Noxa, og Bim på mRNA og protein niveauer i prostata kræftceller [41]. Vi har også påvist, at resveratrol opreguleres ekspressionen, phosphorylering og acetylering af p53 i androgenafhængige LNCaP-celler [41]. Evnen af ​​resveratrol til at regulere gentranskription var også tydeligt, som det forårsagede acetylering af histon H3 og H4 i LNCaP-celler [41]. Desuden behandling af LNCaP celler med resveratrol resulterede i translokation af Bax og p53 til mitokondrier, produktion af reaktive ilt arter, fald i mitokondrie membran potentiale, frigivelse af mitokondrielle proteiner (cytochrom c, Smac /DIABLO og Omi /HtrA2), og aktivering af caspase-3, der fører til apoptose [41]. Endvidere deletion af Bax og Bak-gener fuldstændigt inhiberet resveratrol-induceret cytochrom c og Smac /DIABLO-frigivelse i mus embryonale fibroblaster [42]. I den foreliggende undersøgelse, behandling af xenotransplanterede mus med resveratrol resulterede i nedregulering af Bcl-2 og opregulering af Bax. Kombinationen af ​​resveratrol plus TRAIL var mere effektive til at regulere Bcl-2-familiemedlemmer end enkelt middel alene. Vores tidligere publicerede

in vitro

data er i overensstemmelse med gældende

in vivo

undersøgelser, som viser, at resveratrol kan engagere celle-indre vej af apoptose ved at regulere ekspressionen af ​​Bcl-2 familie af proteiner.

FOXO transkriptionsfaktorer er tumorsuppressorer der inaktiveres i størstedelen af ​​humane cancere, på grund af overaktivering af PI3K /AKT pathway [43]. FOXO proteiner kan regulere en række gener, der påvirker celleproliferation, overlevelse, metabolisme og reaktion på stress [19], [20], [44]. FOXO transkriptionsfaktorer reguleres af syntese, acetylering, phosphorylering og ubiquitinering på tre forskellige niveauer: subcellulær lokalisering, stabilitets- og transkriptionel aktivitet [19], [20], [44]. Ved aktivering af PI3K /AKT-signalering, Foxos undergår AKT-medieret fosforylering, som fremmer binding til 14-3-3, nuklear eksport gennem CRM1 og cytoplasmatisk binding. Under stressbetingelser eller i fravær af vækst- eller overlevelsesfaktorer, når PI3K /AKT pathway inhiberes, FOXO proteiner translokerer til cellekernen, hvor deres transkriptionelle funktioner kan udføres [45]. Et andet regulerende lag er FOXO acetylering af p300, CBP (CREB-bindende protein) og Pcaf (p300 /CBP-associerede faktorer) som reaktion på oxidativt stress eller DNA-binding [46], [47], [48], efterfulgt af deacetylering ved klasse i og II histondeacetylaser [48], [49], [50], herunder SIRT1, NAD

+ – afhængig deacetylase kodes af ortholog af gær levetiden gen SIR2 [51]. Vi har for nylig demonstreret, at inhibering af PI3K /AKT pathway forbedret FOXO-DNA-binding og transkriptionsaktivitet [40], [52]. Endvidere phosphorylering deficient mutant af FOXO forbedret resveratrol-induceret FOXO transkriptionel aktivitet og apoptose. Post-translationel modifikation af FOXO proteiner er en vigtig mekanisme, der regulerer evne forskellige transkriptionsfaktorer til aktivering distinkte gensæt, der er involveret i cellecyklus inhibering [53], apoptose [54], forsvar mod oxidativt stress og DNA-reparation [55]. Den forbedrede DNA bindingsaktivitet tjener også til at begrænse adgangen til FOXO proteiner til phosphorylering af AKT [46]. I den foreliggende undersøgelse har vi vist at resveratrol-induceret apoptose i prostatacancerceller gennem aktivering af FOXO transkriptionsfaktorer. Ligeledes i en anden undersøgelse, har vi vist, at inhibering af FOXO transkriptionsfaktorer ved shRNA blokeret resveratrol-induceret opregulering af Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/Kip1 og apoptose, og resveratrol-induceret inhibering af cyclin D1 i prostatacancer celler

in vitro

[40]. Vore data tyder på, at resveratrol inducerer cellecyklusstop og apoptose gennem regulering af FOXO transkriptionsfaktorer i prostatacancerceller.

FOXO transkriptionsfaktorer er blevet vist at være konstitutivt aktiveret i forskellige humane maligniteter, herunder prostatacancer [39] , [56]. Foxos er vist at bidrage til udvikling og /eller progression af malignitet ved at regulere ekspressionen af ​​gener involveret i cellevækst, differentiering, apoptose, angiogenese og metastase [39], [56].