PLoS ONE: Kræft i æggestokkene kugleformede Celler med Stem Cell-lignende egenskaber Bidrage til Tumor Generation, Metastase og kemoterapi Resistance gennem Hypoxi-Resistant Metabolism

Abstrakt

Celler med kugle danner kapacitet, kugleformede celler, er til stede i malign ascites hos patienter med epitelial ovariecancer (EOC), og udgør en væsentlig hindring for effektiv behandling på grund af deres formodede rolle i progression, metastase og kemoterapi modstand. De præcise mekanismer, der ligger til grund for EOC metastaser og lægemiddelresistens er ikke klare. Forståelse biologi sfære dannende celler kan bidrage til identifikationen af ​​nye terapeutiske muligheder for metastatisk EOC. Her genererede vi sfæroide celler fra humane ovarie cancer cellelinjer og primære kræft i æggestokkene. Xenoengraftment af så få som 2000 dissocierede kugleformede celler i immun-mangel mus tillod fuld sammenfatning af den oprindelige tumor, mens 10

5 forælder tumorceller forblev ikke-tumorigen. De sfæroide celler viste sig at være beriget for celler med cancer stamcellelignende karakteristika såsom opregulering af stamcellelinjer gener, selvfornyelse, høj proliferativ og differentiering potentiale, og høj aldehyddehydrogenase (ALDH) aktivitet. Desuden kugleformede celler var mere aggressive i vækst, migration, invasion, scratch opsving, klonogene overlevelse, forankringsuafhængig vækst, og mere modstandsdygtige over for kemoterapi

in vitro

.

13C-glucose metaboliske undersøgelser afslørede, at kugleformede celler rute glukose overvejende anaerob glykolyse og pentose cyklus på bekostning af omdirigering glukose til anabolske formål. Disse metaboliske egenskaber af kugle dannende celler synes at give forøget modstand mod apoptose og bidrage til en mere aggressiv tumor vækst. Kollektivt, demonstrerede vi, at kugleformede celler med cancer stamcellelignende karakteristika bidrog til tumor generation, progression og kemoterapi modstand. Denne undersøgelse giver indsigt i forholdet mellem formidling tumor og metaboliske egenskaber af humane cancer stamceller og har kliniske implikationer for kræftbehandling

Henvisning:. Liao J, Qian F, Tchabo N, Mhawech-Fauceglia P, Beck A , Qian Z, et al. (2014) Kræft i æggestokkene kugleformede Celler med stamcelle-lignende egenskaber Bidrage til Tumor Generation, Metastase og kemoterapi Resistance gennem Hypoxi-Resistant Metabolisme. PLoS ONE 9 (1): e84941. doi: 10,1371 /journal.pone.0084941

Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget: 10. september 2013; Accepteret: November 29, 2013; Udgivet: 7 Jan 2014

Copyright: © 2014 Liao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af Cancer Research Institute Kræft i æggestokkene arbejdsgruppe Grant, Cancer Vaccine Collaborative Udstedelse af Cancer Research Institute og Ludwig Institute for Cancer Research, Anna-Maria Kellen Klinisk Investigator Award for Cancer Research Institute (til KO), Roswell Park Cancer Institute Alliance Foundation, NIH P30 CA016056; NIH R01CA158318-01A1 og RPCI-UPCI kræft i æggestokkene SPORE P50CA159981-01A1. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er den hyppigste årsag til dødsfald fra gynækologiske maligniteter. Der er mere end 23.000 sager om året i USA, og kan forventes 14.000 kvinder at dø af sygdommen [1]. Trods beskedne forbedringer i responsrater, progressionsfri og median overlevelse ved hjælp af adjuverende platin og taxan kemoterapi efter cytoreduktive kirurgi, samlet overlevelsesrater for patienter med fremskreden EOC og æggestokkene-lignende maligniteter (primær peritoneal) forbliver skuffende [2]. Dette er blevet tilskrevet flere grunde. Først, i modsætning til de fleste andre solide tumorer, mere end 75% af EOC patienter til stede med fremskreden sygdom (FIGO III eller IV). For det andet, selv om de fleste patienter i begyndelsen reagere på platin og paclitaxel kemoterapi, herunder komplette responser, tilbagefald sats er ca. 85%. Inden for 2 års cytoreduktive kirurgi og systemisk kemoterapi, svulster normalt gentage sig, og når tilbagefald, helbredende behandling er vanskelig. Derfor er det bydende nødvendigt at forstå den mekanisme (r) EOC metastaser og kemoterapi modstand for at forbedre kliniske resultater i denne sygdom.

Den primære funktion af fjernmetastaser i EOC indebærer nedlæggelsen af ​​celler fra den primære tumor, i bughulen, efterfulgt af implantation på mesothelial foring af peritoneum [3], [4]. I øjeblikket er der data til at demonstrere “sfære dannende celler” eller “sphæroider” er almindeligt forekommende i ascites og er i stand til tumorigenese

in vivo

, har et reduceret respons på kemoterapeutiske stoffer

in vitro,

og kan spille en vigtig rolle i metastatisk sygdom [5] – [9]. Fordi metaboliske ændringer kan give en fordel på evnen af ​​kræftceller til at overleve, formere sig, og invadere [10] – [12], vi hypotese, at kugle dannende celler sandsynligvis udvise metaboliske egenskaber, der fremmer deres evne til at overleve og metastaserer. I nærværende undersøgelse genererede vi sfæroide celler fra EOC cellelinier og fra patienter med primær ovariecancer. Vores

in vivo

in vitro

biologiske undersøgelser antydet, at disse sfære dannende celler er beriget i cancer stamceller-lignende celler (CSCL), der kritisk bidrager til kræft i æggestokkene tumorgenese, metastase og kemoterapi modstand. Vi udnyttede derefter isotop-baserede dynamisk metabolisk profilering [13], [14], til samtidig vurdere underlaget flux i og mellem store metaboliske veje for makromolekyle syntese og energiproduktion under forskellige fysiologiske betingelser. Vi fandt, at kugleformede celler øger anaerob glykolyse og pentose cyklus og mindske omdirigering af glukose til anabolske formål. Denne undersøgelse giver indsigt i forholdet mellem formidling tumor og metaboliske egenskaber af æggestokkene CSCL celler, og har kliniske implikationer for kræftbehandling.

Materialer og metoder

Isolering af tumorceller fra human kræft i æggestokkene

tumor prøver og ascitesvæske blev opnået fra patienter, der gennemgår tumor debulking operation for epitelial ovariecancer (EOC) ved Roswell Park cancer Institute (RPCI), Buffalo, NY. Alle prøver blev indsamlet under en godkendt protokol CIC 02-15 fra Institutional Review Board på RPCI, og informeret skriftligt samtykke blev opnået fra hver patient. Tumorceller fra ascites blev opnået fra centrifugerede cellepellets af ascitesvæske. Pelleterne blev vasket to gange i PBS, placeret på Ficoll-Hypaque densitetsgradienter og centrifugeret igen til høst tumorceller. Til opnåelse tumorceller fra fast tumor væv blev tumorprøver fint hakket i cellekulturmedium og enkeltcellesuspensioner blev vasket to gange i PBS efterfulgt af Ficoll-Hypaque oprensning.

Cell Culture

Primært EOC cellelinjer blev etableret fra solid tumor og ascites ved dyrkning af celler i 13 forskellige forhold [15], [16] fra 30 EOC patienter over en periode på 2 år. Sfæroid celler blev genereret fra nye EOC cellelinjer og fra en etableret æggestokkræft cellelinie, OV2774, der blev opnået fra Sloan Kettering Institute, New York, NY (høflighed af Lloyd J. Gamle, Ludwig Institute for Cancer Research, NY), ved fremgangsmåden som beskrevet [17] med modifikationer ved resuspendering 8 × 10

4-celler med serum-frit DMEM /F12 suppleret med 10 ng /ml human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF; Invitrogen), 10 ng /mL basisk fibroblastvækstfaktor faktor (bFGF, Invitrogen), og N2 supplement-A (StemCell Technologies Inc) i Ultra Low Attachment 6-brønde (Corning) og efterfølgende organisation i sfærer

In vivo

xenograft-Eksperimenter.

Alle dyreforsøg overholdes protokoller er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg RPCI. Dissocieret sfæroide eller forælder tumorceller blev talt, resuspenderet i 50 pi 1:01 RPMI /Matrigel (BD Biosciences), og injiceret subkutant (sc) i den højre ben 3- til 4-uger gamle SCID-mus (CB-IGH -1blcrTac-Prkdcscid /Ros) leveret af RPCI Animal Facility (stammer fra Taconic Farms, Hudson, NY). Indpodede mus blev inspiceret hver anden uge for tumor udseende ved visuel observation og palpering, og tumor latency blev bestemt. Mus blev aflivet ved cervikal dislokation på en tumor diameter på 1 cm eller efter 6 måneder efter transplantationen. Xenotransplantattumorer blev reseceret, fikseret i 10% neutral, bufret formalin, og indlejret i paraffin for sektionering (5 um) på en roterende mikrotom, efterfulgt af montering på objektglas, H 0,1 mm i diameter) efter 3 ugers vækst i blød agar blev talt; 10 forskellige felter blev kvantificeret per brønd og det gennemsnitlige antal kolonier pr felt blev beregnet. AIG (vækst forankringsuafhængig) indeks blev udtrykt i forhold til antallet af celler podet.

Kemoterapi Resistance Assay

Spheres blev dissocieret ved trypsinisering og pipettering, og celler blev podet ved 5000 celler per brønd (96-brønds plader; Corning) i 200 pi CM medium. Alle celler blev behandlet i 24 timer med fra 0 til 6 ug /ml cisplatin (BD Biosciences) eller mellem 0 og 18 ug /ml Paclitaxel (Sigma; n = 5 per dosis lægemiddel). Relative celleantal blev bestemt ved CellTiter-Glo Luminescent Cell Levedygtighed Assay [18]. Dosis-respons-eksperimenter blev udført in duplo. Procent celleoverlevelse udtrykkes i forhold til ubehandlet kontrol. Sfæroide celle drug cytotoksiciteter blev sammenlignet efter 48-h behandling med cisplatin (4 ug /ml). Efter lægemiddelbehandlinger blev celler inkuberet i 8 dage i stoffrie CM medium og celle kolonier blev undersøgt under mikroskopi.

Klonogen Survival Assay

Cellerne blev behandlet med forskellige mængder af cisplatin for 24 timer . Efter fjernelse af lægemidlet blev celler vasket med PBS, høstet og 300 af overlevende celler /brønd blev fodret igen med CM medium i pladen med 6 brønde. 10-14 dage senere blev kolonierne farvet med 0,1% krystalviolet og talt.

Immunhistokemi

tumorprøver blev fikseret med pufret formalin og indlejret i paraffin. Sektioner (5 um) blev anbragt på objektglas, opvarmet til 60 ° C i 20 minutter, og derefter afparaffiniseret med xylen og ethanol. For antigen hentning blev tumorprøver monteret på objektglas nedsænket i forvarmet antigen-genvinding opløsning (DAKO høj pH opløsning; DAKO, Carpinteria, CA) i 20 minutter og afkøledes i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter inaktivering af endogen peroxidase, oprenset specifikt monoklonalt antistof CA125 (Ov 185:1, Novocastra) (1:200 fortynding) og CK7 (Dako) (1:20 fortynding eller 75 ug /ml) blev derefter tilsat og inkuberet natten over ved 4 ° C. Det primære antistof blev påvist med et biotinyleret anti-mus IgG (DAKO). Diaminobenzidintetrahydrochlorid blev derefter tilsat til udvikling i 10 min, efterfulgt af modfarvning med hematoxylin-opløsning.

Biokemiske analyser

Anvendelse af [U-

13C

6] glukose tracer i kombination med massespektrometri tillader evalueringen af ​​metabolisk flux gennem de vigtigste veje letter energiproduktion og biosyntetiske metabolisme af cellen. Normale ovarieceller (RPNLOv78) blev venligst leveret af Dr. T Pejović [19]. Cellerne blev dyrket i 01:01 blanding af RPMI og DMEM (glucose-fri) + 10% FBS + 10 ug /ml insulin +10 ng /ml EGF + 0,1% Gentamicin + [U-

13C

6] glucose (180 mg /ml). Moderceller (RP-OV17534) blev dyrket i RPMI (glucose-fri) + 10% FBS + [U-

13C

6] glucose (180 mg /ml). RP-OV17534 sfæroide celler blev dyrket i DMEM /F12 (glucose-fri) + N2 Supplement-A + EGF 10 ng /ml + bFGF 10 ng /ml + [U-

13C

6] glucose (180 mg /ml). Efter 24 timers inkubation blev celler centrifugeret (1.500 rpm i 5 minutter) og inkubationsmediet og cellepellets blev opnået. Glucose og lactat inkubationsmediet blev bestemt som tidligere beskrevet [20]. Lactat fra celledyrkningsmediet blev ekstraheret ved ethylacetat efter syrning med HCI. Lactat blev derivatiseret til sin propylamid-heptafluorsmørsyre form, og

m /z

330 og 331 (carbon- 2-3 af lactat, kemisk ionisering) blev overvåget til påvisning af

m2

(

13C dobbelt-mærket laktat) og

m3

(triple-mærket lactat) til vurdering af pentose cyklus aktivitet versus anaerob glykolyse [21]. Glutamat blev separeret fra mediet ved hjælp af ionbytningskromatografi [22]. Glutamat blev omdannet til sit

n

-trifluoroacetyl-

n

butyl derivat og ion klynger

m /z

198 (kul 2-5 af glutamat, elektron indvirkning ionisering ) blev overvåget.

13CO

2 frigivelse blev målt med et Finnegan Delta-S ion-forhold massespektroskop og blev anvendt til at estimere glucose carbonudnyttelse gennem oxidation af cellelinierne [23]. Massespektralanalyser blev udført af tre uafhængige automatiske injektioner ved sampler og kun accepteres, hvis standard prøve afvigelsen var. 1% af den normaliserede peak intensitet

Dataanalyse og statistiske metoder

statistiske analyser blev udført ved hjælp af den parametriske uparret, tosidede uafhængig prøve

t

test med 99% konfidensintervaller.

Resultater

Generering af kugleformede Celler fra Primær kræft i æggestokkene Enheder og etablerede EOC cellelinier

Stabile cellelinjer blev etableret med succes fra 3 af 30 (10%) kulturer initieret fra primære EOC prøver over en periode på 2 år. RP-OV15526 blev der hidrører fra faste tumor, mens RP-OV17534 og RP-OV313777 stammede fra EOC ascites. Disse celler er blevet dyrket

in vitro

for 465, 312, og 125 dage med 68, 65 og 17 passager hhv. Alle linjer var fra sen-fase (IIIC eller IV) æggestokkene serøse adenocarcinom kræftpatienter. Konfluent monolag af primære humane EOC celler afbildet typisk epitel brosten morfologi med 3-dimensionel voksende opad i celle-kondenseret områder (fig. 1A). Undersøgelse af epiteliale markører CK-7 og CA-125 yderligere bekræftet epitel karakter af disse primære cellelinjer (fig. 1C). For at generere sfæroide celler blev ovariecancer cellelinje OV2774 eller primære EOC celler enzymatisk dissocieret og inokuleres på ultralav fastgørelse dyrkningsplader i serumfrit medium med EGF, bFGF, og N2 supplement-A. I denne kultur tilstand døde nogle celler fra serum sult, mens andre blev tvunget ind i suspension og dannede aggregater. Tre uger efter udpladning nogle aggregater komprimeres til kugler, som ikke kunne dissocieret ved pipettering. Nogle af de områder også aggregeres til at danne sfære klynger. Flydende sfærer og klynger blev dissocieret ved pipettering, og genudpladet to gange om ugen, med de resulterende celler genererer sekundære sfærer, optræder som særskilte prototypiske sfæroider (fig. 1B, 1E), svarende til dem, der findes i patientens ascites [5], [6] . Under anvendelse af denne fremgangsmåde, vi opnåede bæredygtige sfæroider fra etableret cellelinie OV2774 (fig. 1D og 1E) og den primære EOC celler RP-OV17534 (fig. 1A og 1B) under stamceller-selektive betingelser. Vi har dyrket den OV2774 og RP-OV17534 celler som sfæroider i 6 måneder, demonstrerer selvfornyende evne sfæroide celler.

(A) Tre primære cellelinjer genereret fra EOC patienter viser epitelceller morfologi. (B) En af primær EOC cellelinje genereret 3D-uafhængige, selvfornyende sfæroide celler under selektion stamcelle medier. (C) primær cellelinier udtrykker ovariecarcinom markør CA-125 og epithelial markør CK-7, som vist ved IHC for RP-OV17534. (D) EOC cellelinie OV2774 er i stand til at generere OV2774 sfæroide celler (E). Alle skala bar enhed i denne figur, og følgende tal er i um.

klumpformet Cells Tumorigenicitet og Metastase i Immun-mangel mus

Dernæst undersøgte vi tumorgenicitet af kugle-dannende celler . Vi undersøgte, om eksponentielt mindre antal (sammenlignet med parentale cancerceller) var i stand til tumorigenese, som tidligere vist for andre epithelcancer initierende celler (CIC) [24] – [28]. Sfæroide celler eller tilsvarende parentale bulk-tumorceller blev injiceret s.c. i højre ben af ​​SCID-mus. Med injektioner af kun 2.000 celler per mus, sfæroide celler var tumorigene i 4 af 4 SCID-mus for RP-OV17534 sfæroide-celler og 2 af 2 for OV2774 sfæroide celler, som det fremgår af tydelige tumorer på injektionsstedet (Fig 2A;. Tabel 2 ). Den mediane tumor latenstid i denne kohorte var 31 til 90 dage for RP-OV17534 kugleformet og 50 til 57 for OV2774 klumpformet, svarende til eller mindre end CIC af andre maligniteter [24] – [27]. Tilsvarende injektioner af 5.000 og 10.000 RP-OV17534 sfæroide celler var også tumorigene i tre af tre mus med kortere tumor latenstider (figur 2A;. Tabel 2). Uden ikke-klæbende kugleformet udvælgelse, bulk-tumorceller undladt at danne tumorer selv ved 40.000 celler til RP-OV17534 indpodning (tabel 2). Alle subkutane xenotransplantattumorer afledt af kugleformede celler blev kategoriseret som serøse adenocarcinomer i moderat /dårlig differentiering (grad 2 /grad 3), svarende til de parentale primære patientens tumorer (H . tabel 2), med tumor latenstider på 75 til 84 dage svarende til eller mindre end CIC af andre maligniteter [17]. Tilsvarende i.p. injektioner af 20.000 og 40.000 sfæroide celler var også tumorigene i tre af tre mus med kortere tumor latenstider (tabel 2). Uden ikke-klæbende kugleformet markering, bulk-tumorceller undladt at danne blodige ascites og tumorer selv ved 80.000 celler pr injektion, mens en af ​​én og tre af 3 mus i.p. injiceret med henholdsvis 1,7 × 10

7 og 2 × 10

7 parentale primære EOC celler var tumorigene, omend med forlænget latenstid (92-105 dage; tabel 2). I.P. injektion af sfære-dannende celler resulterede i udvikling af blodige ascites og peritoneal metastase til omentum, lever, colon, mave, og nyre (Fig. 2B) og intraperitoneal tumorhistologi ligner både subkutan xenograft og primære patientens tumorer (fig. 2C ). I overensstemmelse med resultaterne for RP-OV17534, vi også observeret højere tumorgenicitet af OV2774 sfæroide celler sammenlignet med deres forælder celler, i lignende i.p. engraftment dyreforsøg under anvendelse OV2774 afledte celler (tabel 2).

Et andet væsentligt kriterium for CIC er deres evne til serielt propagere tumorer i fortløbende inkorporerede dyr [31]. For at undersøge dette endelige stemness egenskab, seriel indpodninger af xenografter blev udført. 2 × 10

4 af kugleformede celler i.p. injiceret i SCID mus og ascites udviklet sig som forventet i 3 ud af 3 mus i cirka 60 dage. Transplantation af 8 × 10

4, 1 x 10

5 og 5 x 10

5 sådanne ascites celler i SCID mus resulterede i ascites og tumorer, med en latenstid betydeligt kortere end de parentale patientens tumorceller ( 66/63/49 dage henholdsvis passage 2 xenografter versus ingen tumor udvikling for forældre tumorceller på 8 × 10

4 transplantation i 0 ud af 3 SCID-mus). Patologi oment masse var svarende til den i s.c. tumorer (fig. 2C). Disse resultater indikerer, at kugle-dannende celler er mere tumorigene end deres parentale tumorceller, hvilket viser, at en stærkt tumorigene subpopulation af celler til stede inden for rammerne-dannende celler, og kan opholde sig æggestokkene neoplasmer. Da RP-OV17534 sfæroide celler og OV2774 sfæroide celler demonstrerede lignende egenskaber, er følgende resultater vist for RP-OV17534 afledte celler med lignende observationer for OV2774 celler.

æggestokkene Tumor Sphere-dannende celler udtrykker stamcelle Gener

for at undersøge ekspressionen af ​​genet specifikke for embryonale stamceller, blev total RNA fra kugleformede celler og stamceller analyseret af en menneskelige stamceller Marker cDNA Plate Array. Blandt 32 undersøgte gener, sfæroide celler opregulerede Notch1, Nanog, Cdcp1, CD34 og Myc ekspression (fig. 3A). Hvert af disse gener er afgørende for udviklingsmæssige processer (embryogenese, neurogenese, stamcellefaktor ekspansion, og hæmatopoiese [32] – [34]). Disse resultater blev bekræftet ved kvantitativ realtids-PCR data. Ekspressionsniveauerne af Notch1, Nanog, Cdcp1, CD34, og Myc i kugleformede celler var cirka 10 til 2000 gange højere end den for ikke-sfæroide celler påvises ved real-time PCR (fig. 3B, red bar). Når sfæroide celler blev dyrket i CM uden vækstfaktorer, en differentierende tilstand, flydende celler adhæreret og voksede til epitelceller. Næste vi sammenlignet de samme sæt af genekspression niveau af real-time PCR i kugleformede celler, dyrkning i enten stamceller selektiv eller differentierende betingelser i 14 dage. Ekspression af CD34 og Nanog var ca. 1 fold af den for ikke-sfæroide celler, Cdcp1 og Myc faldt til 9 og 500 gange. Notch1 udtryk niveau i kugleformede celler forblev på 12 fold af, at ikke-sfærisk celler efter dyrkning i CM i 14 dage (fig. 3B, grøn bar). Stem cell factor receptor CD117 (c-kit) er blevet rapporteret i tidligere undersøgelser af æggestokkene kræft tumor stamfædre [17], [35]. Derfor undersøgte vi CD117 udtryk ved FACS i disse kugleformede celler. I overensstemmelse med tidligere rapporter, vi også påvist CD117 opregulering i kugleformede celler sammenlignet med stamceller. Da et stort antal kugleformede celler dræbt af kemoterapi narkotika blev differentieret ikke-stamceller, mens stamceller-lignende celler overlevede (se nedenfor), fandt vi, at CD117 ekspression forøges yderligere i kugleformede celler efter cisplatin behandling i 24 timer (fig. 3C) . Disse data indikerer, at kugleformede celler fra kræft i æggestokkene overudtrykke stamceller gener under stamcelle-selektive betingelser og tabe eller sænke disse genekspressioner under differentieringstilstande.

(A) Samlet RNA isoleret fra kugleformede celler og stamceller blev undersøgt for deres genekspression ved et humant stamcellemarkører cDNA array og stamceller gener viste højere ekspressionsniveauer i kugleformede celler til ikke-sfæroide celler. (B) overekspressionen niveauer af Notch1, Nanog, Cdcp1, CD34, og Myc i kugleformede celler sammenlignet med ikke-sfæroide celler blev bekræftet ved kvantitativ realtids-PCR. Disse stamceller-gener ‘udtryk gik tabt eller nedreguleret, når sfæroide celler blev differentieret ved dyrkning i CM uden vækstfaktorer i 14 dage. Ekspressionsniveauer er repræsenteret som fold ændringer i forhold til disse ikke-sfæroide celler. (C) FACS undersøgelse af CD117 ekspressionen på kugleformede celler og stamceller viser høj CD117 ekspressionen i kugleformede celler. Nogle sfæroide celler blev behandlet med cisplatin i 24 timer inden overfladefarvning af CD117 Abs. Fejllinjer: SD, N = 3. *:. P 0,05

Øget ALDH Aktivitet i kugleformede Celler

ALDH spiller en afgørende rolle i cellulær afgiftning. Nylige undersøgelser viser, at øget ALDH aktivitet fører til flere typer af maligniteter, tjener som en kræft stamcellemarkør og korreleret med dårlig prognose [36] – [39]. Vores ALDEFLUOR assay viste mere ALDH

+ -celler i kugleformede celler i fravær af ALDH inhibitor DEAB (fig. 4A). Den øgede ALDH funktion i kugleformede celler blev bekræftet af en ALDH aktivitet kolorimetrisk assay, som viser signifikant forøget aktivitet i kugleformede celler (fig. 4B).

(A) ALDEFLOUR kit etiketter befolkningen med en høj ALDH enzymatisk aktivitet i kugleformede celler. En alikvot af hver prøve af celler blev behandlet med ALDH inhibitor DEAB som negativ kontrol til indstilling FACS gate. (B) The BioVision ALDH kolorimetrisk assay detekteres forøget ALDH aktivitet i klumpformet cellelysat. Fejllinjer: SD, N = 2. *: p. 0,05

klumpformet Celler har høj spredning og Migration Potentiale end deres Forældrekontrol Cells

Forholdet mellem klumpformet dannelse og cellevækst potentiale blev undersøgt i en kinetisk celleproliferationsassay. Forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater. Fig.