PLoS ONE: H2S Donor, S-Propargyl-cystein, Øger CSE i SGC-7901 og kræft-induceret Mus: Beviser for en Novel Anti-cancer effekt af endogene H2S

Abstrakt

Baggrund

S-propargyl-cystein (SPRC), en H

2S donor, er en strukturel analog af S-allycysteine ​​(SAC). Det blev undersøgt for dets potentielle anti-cancer effekt på SGC-7901 gastrisk kræftceller og de mulige mekanismer, der kan være involveret.

Metoder og Resultater

SPRC behandling faldt betydeligt cellelevedygtighed, undertrykt proliferation og migration af SPRC-7901 gastrisk cancerceller, var pro-apoptotiske samt forårsaget cellecyklusstop på G

1 /S-fase. I en

in vivo

undersøgelse, intraperitoneal injektion af 50 mg /kg og 100 mg /kg af SPRC signifikant reduceret tumorvægte og tumorvolumener af mavekræft implantater i nøgne mus, med en tumorvækstinhibering på 40-75%. SPRC inducerede også en pro-apoptotisk effekt i cancer væv og forhøjede de udtryk for p53 og Bax i tumorer og celler. SPRC behandling også øget protein ekspression af cystathion-γ-lyase (CSE) i celler og tumorer, og forhøjede H

2S niveauer i celledyrkningsmedier, plasma og tumorale CSE aktivitet af gastrisk cancer-induceret nøgne mus efter 2, 2,3 og 1.4 gange. De fleste af de anti-cancer funktioner SPRC på celler og tumorer var signifikant undertrykt af PAG, en inhibitor af CSE aktivitet.

Konklusioner

Samlet set resultaterne af vores undersøgelse giver indblik i en roman anti-cancer effekt af H

2S samt SPRC på mavekræft gennem inducere aktiviteten af ​​et nyt mål, CSE

Henvisning:. MA K, Liu Y, Zhu Q, Liu Ch, Duan JL, Tan BK-H, et al. (2011) H

2S Donor, S-Propargyl-cystein, Øger CSE i SGC-7901 og kræft-induceret Mus: Beviser for en Novel Anti-cancer effekt af endogene H

2S? PLoS ONE 6 (6): e20525. doi: 10,1371 /journal.pone.0020525

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: April 15, 2011; Accepteret: Maj 2, 2011; Udgivet: 27 juni 2011

Copyright: © 2011 MA et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Vi anerkender den finansielle bistand fra en bevilling fra National Distinguished Unge Forskere Grant 385 (nr 30.888.002) i Kina, National 973 Project (2007CB512006 og 2010CB912600) og Shanghai-Unilever Research Udviklingsfond (08540750400).

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

S-propargyl-cystein (SPRC) er en strukturel analog af S-allycysteine ​​(SAC ) med samme cystein-holdige struktur. SAC, en af ​​de store forbindelser i alderen hvidløg ekstrakt, stammer fra nedbrydningen af ​​

S

alk (en) yl cystein sulfoxider (ACSS). Denne forbindelse har anti-tumor [1], [2], anti-bakterielle [3], anti-svampe [4], anti-hepatotoksisk [5], hjertebeskyttende egenskaber [6] og apoptose [7]. Paclitaxel liposom, et lipid-baseret formulering af anticancerlægemidlet, paclitaxel, er blevet en first-line lægemiddel til behandling af refraktær ovariecancer, bryst-, mave- og ikke-småcellet lungekræft. Vi undersøgte derfor

in vitro

in vivo

anticancer effekter af SPRC og sammenlignet disse med de SAC og Paclitaxel liposom.

cystathion-γ-lyase (CSE) er medlem af det transeuropæiske sulfuration enzym familie og er ansvarlig for at katalysere pyridoxalphosphat-afhængige β-disulfid elimination reaktion resulterer i ammonium, pyruvat og thiocysteine. Thiocysteine ​​kan derefter reagere med andre thioler til dannelse H

2S. P53 tumorsuppressorprotein spiller en stor rolle i cellulær respons på DNA-skade og andre genomiske aberrationer. Aktivering af p53 kan føre til enten cellecyklusstandsning og DNA-reparation eller apoptose. Bax er en nøglekomponent i cellulær apoptose gennem mitokondrie stress, mens Bcl-2 udøver en overlevelsesfunktionen som svar på en lang række apoptotiske stimuli gennem hæmning af mitokondrisk cytochrom c-frigivelse. Her for første gang, fandt vi, at de anticancer effekter af SPRC involverede en hydrogensulfid (H

2S) medieret vej. SPRC kan undergå β-eliminering af CSE at producere endogen H

2S, som kan opregulere genekspression af p53 og Bax, hvilket resulterer i suppression af celleproliferation og apoptose. Vores undersøgelse viste således en roman anti-cancer effekt af det endogene H

2S donor, SPRC, på gastrisk kræft gennem inducere aktiviteten af ​​et nyt mål, CSE. Vi viste for første gang, at SPRC kunne undertrykke celleproliferation og migration og også tumorvækst i gastrisk cancer-induceret model af nøgne mus, hvilket indikerer, at det kan være et potentielt middel til behandling af gastrisk cancer hos mennesker. Vores resultater viste, at de anti-cancer effekter af SPRC blev tilskrevet undertrykkelse af cellecyklus og induktion af apoptose. Desuden vores resultater viste også, at SPRC kunne regulere gen udtryk for CSE, Bax og p53. Vi fandt, at PAG, en inhibitor af CSE aktivitet, i væsentlig grad kan undertrykke anticancer effekter af SPRC.

Resultater

Dosisafhængig, vækst hæmmende og påvisning af cytostatiske virkninger af SPRC på SGC- 7901 celler

Virkninger af SPRC på SGC-7901 gastrisk cancerceller blev vist i figur 1A, 1 uM og 10 uM SPRC produceret 18-25% hæmning af levedygtighed SGC-7901 celler. 20 mM til 30 mM SPRC forårsagede omkring 50% cellernes levedygtighed hæmning. Vi fandt også, at SPRC ved lave koncentrationer på 1 uM og 10 uM i væsentlig grad kan undertrykke kolonidannende og migration evne SGC-7901; disse virkninger var mere signifikante sammenlignet med SAC (figur 1B, 1C og 1D). PAG, en inhibitor af CSE, blokeret den inhiberende virkning af SPCR på cellevækst (figur 1B og 1C). Disse resultater viste, at CSE pathway var involveret i SPRC-induceret undertrykkelse af cellevækst.

A. Dosis-respons undersøgelse af virkningerne af SPRC om væksthæmning af SGC-7901 celler. B. Virkninger af SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC og paclitaxel liposom om levedygtigheden af ​​SGC-7901 celler. C. Virkninger af SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC og paclitaxel liposom på kolonidannelse i SGC-7901 celler. D. Virkninger af SPRC, SAC og paclitaxel liposom om migration evne SGC-7901 celler. Differential evne cellemigration blev undersøgt af sår-lukning assay. E. Virkninger af SPRC, SAC og paclitaxel liposom på sårlukning hastighed. Værdierne er udtrykt som% af kontrol. * Repræsenterer signifikant forskel mellem kontrol vs. SPRC, SAC og paclitaxel liposom grupper (p 0,01).

# repræsenterer signifikant forskel (p 0,01) mellem SPRC vs SPRC + PAG gruppen (p 0,01).

Morfologiske ændringer, apoptose og cellecyklus analyse

Apoptose [ ,,,0],21] er programmeret celledød, der er kendetegnet ved specifikke strukturelle ændringer, der omfatter celle krympning, cellekernekondensation og DNA-fragmentering. Hoechst farvning blev anvendt til at observere de morfologiske ændringer i celler behandlet med paclitaxel liposom, SPRC og SAC. Som vist i figur 2A, elektronmikroskopi afslørede, at morfologiske ændringer er karakteristiske for apoptose forekom i SGC-7901 celler efter behandling med SPRC ed i 24 timer. Cellerne udviste en tæt farvningsmønster med DNA-fragmentering og fravær af forskellige nukleare membraner. Kontrolceller ikke udviser lignende morfologiske ændringer. Apoptoseinducerende virkninger af SPRC blev vurderet ved flowcytometri (figur 2B); 24 timer behandling af SGC-7901 celler med 10 uM SPRC resulterede i en signifikant stigning på ca. 26% af de apoptotiske legemer i sammenligning med kontrolgruppen. Til sammenligning procentdelen af ​​apoptotiske celler i Paclitaxel liposom og SAC-behandlede grupper var mindre med omkring 8% og 4%, henholdsvis.

A. behandling med SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC og paclitaxel liposom (10 uM) i 24 timer til bestemmelse af apoptotiske ændringer analyseret under et fluorescensmikroskop. B. Analyse af apoptotiske celler ved hjælp af flow cytometrisk analyse. C. cellecyklusfordeling. Markører på billederne indikerer: 1, Control. 2, SPRC 10 uM. 3. SAC 10 uM. 4. PAG 10 uM. 5. SPRC + PAG, hver 10 uM. 6. Paclitaxel liposom 10 uM.

Effekten af ​​SPRC på cellecyklus aktivitet af SGC-7901 celler blev analyseret ved at udføre propidiumiodidfarvning efterfulgt af påvisning med flowcytometri. I overensstemmelse med dens virkning på cellevækst hæmning, SPRC induceret cellecyklusstop i SGC-7901 celler på G

1 /S fase (Figur 2C). 10 uM SPRC resulterede også i en forøget akkumulering af 24% af cellerne i G

1 fase og reduceret 20% af celler i S-fasen af ​​cellecyklussen, sammenlignet med kontrolgruppen. Dette antyder, at der er en blokering i G

1 /S faseovergang, som kan forårsage cellevækst suppression eller apoptose. Den pro-apoptotiske effekt af SPRC samt dens effekt af standsning af cellecyklus ved G

1 /S fase blev også stort set inhiberet af PAG.

Virkninger af SPRC på CSE proteinekspression og aktivitet og H

2S niveauer

De udtryk for CSE protein i SGC-7901 celler (figur 3A, B og C) og tumorer i nøgne mus (figur 3 D, E og F) blev øget signifikant ved SPRC behandling. SPRC i doser på 50 mg /kg og 100 mg /kg signifikant forøget CSE aktivitet med ca. 1,4 gange (figur 3G). CSE-aktivitet i tumorer af SPRC-behandlede nøgne mus var højere end i væv af SAC-behandlede gruppe. H

2S niveauer i celledyrkningsmedier (figur 3H), plasma fra nøgne mus (fig 3I) blev målt. H

2S niveau i celledyrkningsmediet af 10 uM SPRC-behandlede celler og plasmaet H

2S af 50 mg /kg og 100 mg /kg SPRC-behandlede nøgne mus blev også signifikant forøget sammenlignet med kontrolgruppen (P 0,05). Sammenlignet med SAC-behandlede gruppe af mus, den SPRC-behandlede gruppe havde signifikant højere H

2S niveau (P 0,05). De forhøjede niveauer af CSE proteinekspression, CSE aktivitet og H

2S i SPRC-behandlede gruppe var alle stort set reduceret med PAG behandling. Resultaterne af disse eksperimenter således foreslået, at anticancervirkning af SPRC var medieret ved aktivering af CSE /H

2S pathway

I A, bane 1, kontrolgruppen.; Bane 2, paclitaxel liposom 10 uM; Bane 3, SPRC 1 uM; Bane 4, SPRC 10 uM; Bane 5, SAC 10 uM; Bane 6, kontrol-gruppe; Bane 7, SPRC 10 uM; Bane 8, PAG 10 uM; Bane 9, PAG + SPRC 10 uM. For D: Bane 1, kontrol; Bane 2, paclitaxel liposom 10 mg /kg; Bane 3, SPRC 50 mg /kg; Bane 4, SPRC 100 mg /kg; Bane 5, SAC 100 mg /kg; Bane 6, kontrol; Bane 7, SPRC 100 mg /kg; Bane 8, PAG 100 mg /kg; Bane 9, PAG + SPRC 100 mg /kg. Relativ intensitet beregnes ved at sammenligne med intensiteten af ​​GAPDH hjælp densitometri (vist i graferne til højre). * Repræsenterer signifikant forskel mellem kontrol vs. SPRC, SAC og paclitaxel liposom behandlede grupper (p 0,05).

# repræsenterer signifikant forskel mellem SPRC 10 uM vs. SPRC + PAG gruppe. Figur G viser CSE aktivitet (pmol /g) i den gastriske kræft i alle grupper. Figur H viser H

2S niveauer (uM) i celledyrkningsmedier. Figur I viser plasma H

2S niveauer i gastriske tumorer i nøgne mus af forskellige grupper.

Virkninger af SPRC og SAC på gen-udtryk for Bax, p53 og Bcl-2

væksten-undertrykkelse effekt af SPRC på SGC-7901 celler blev vurderet til at analysere virkningerne på cellecyklus aktivitet og udtryk for de apoptose regulator gener – Bax, p53 og Bcl-2. Som vist i figur 4A og 4B, fandt vi, at 24-timers SPRC behandling signifikant forøget mRNA-niveauet (ca. 1,5 gange) og protein niveau af p53 og Bax af SGC-7901 celler.

A. Bane 1, paclitaxel liposom 10 uM; Bane 2, kontrol; Bane 3, SPRC 10 uM; Bane 4, SPRC 1 uM; Bane 5, SAC 10 uM; Bane 6, SAC 1 uM. Relativ intensitet beregnes ved at sammenligne med intensiteten af ​​β-actin under anvendelse af densitometri (vist i graferne til højre). B. Kvantificering af Bax, p53 og Bcl-2-mRNA-ekspression. * Repræsenterer betydelig signifikans mellem kontrol vs SPRC, SAC og paclitaxel liposom ved p 0,05 niveau

Vækst undertrykkelse [22] og induktion af celle apoptose i tumorer ved SPRC

udvikling. af gastrisk cancer evalueret af tumorvolumen var signifikant reduceret med SPRC behandling af 50 mg /kg og 100 mg /kg legemsvægt hver anden dag tre gange om ugen med en IR på 40-75% (figur 5A og 5B). Tumoren vægt blev også signifikant reduceret i SPRC-behandlede grupper (figur 5C), mens PAG behandling nedsatte signifikant vækstsuppression funktion SPRC. De repræsentative tumorer i forskellige grupper udviste indlysende tumorstørrelse ændring (fig 5D og 5E).

A. Ændring i den gennemsnitlige tumorvolumen (mm

3). B. Inhibition rate (IR) på tumorvækst på forskellige dage. C. Ændring i tumorvægt. D. Ændring i tumorstørrelse. E.

In vivo

tumorbilleddannelse hos nøgne mus efter behandling i 24 dage. * Repræsenterer signifikant forskel (p 0,05) mellem kontrol vs. SPRC, SAC og paclitaxel liposom behandlede grupper.

#represents signifikant forskel (p 0,05) mellem SPRC 100 mg /kg vs. SPRC + PAG og PAG behandlede grupper. F. H.E. farvning med forstærkning på 4 × 10 og større forstærkede billeder (100 × 10) ved højre hjørne. G. Tunnel farvning (100 × 10) af apoptotiske organer gastriske tumorer. Antal markører på billederne indikerer: 1, kontrol gruppe; 2, paclitaxel liposom 10 mg /kg-gruppen; 3, SPRC 50 mg /kg-gruppen; 4, SPRC 100 mg /kg-gruppen; 5, SAC 100 mg /kg-gruppen.

Vi undersøgte også, om tumorvækst hæmning af SPRC den blev afspejlet i apoptose af tumorceller. H Bane 2 paclitaxel liposom 10 mg /kg; Bane 3 SPRC 50 mg /kg; Bane 4, SPRC 100 mg /kg; Bane 5, SAC 100 mg /kg. Relativ intensitet blev beregnet ved at sammenligne med intensiteten af ​​β-actin under anvendelse af densitometri. B. mRNA-ekspression. * Repræsenterer statistisk signifikans mellem kontrol vs SPRC, SAC og paclitaxel liposom- behandlede grupper (p 0,05). C. Immunohistokemisk farvning af pro-apoptotisk protein, Bax. D. Immunohistokemisk farvning af pro-apoptotisk protein, p53. E. Immunohistokemisk farvning af pro-apoptotisk protein, Bcl-2. Antal markører på billeder i figur 6 C, D og E angiver: 1, kontrolgruppe; 2, paclitaxel liposom 10 mg /kg; 3, SPRC 50 mg /kg; 4, SPRC 100 mg /kg; 5, SAC 100 mg /kg.

H

2S demonstrerede pro-apoptose og anti spredning effekt på SGC-7901 celler og mavekræft model af nøgne mus

Vi fandt, at SPRC øget CSE aktivitet, og som resulterer i forhøjet H

2S niveauer, som igen modulerer gen udtryk for Bax, p53 og Bcl2. Bax er direkte induceret mitokondrier drevet apoptose gennem øget Mt ekspression og faldt Bcl-2-ekspression. P53 tumorsuppressorprotein spiller en stor rolle i cellulær respons på DNA-skade og andre genomiske aberrationer. Aktivering af p53 fører til enten hæmning af celledeling og DNA-skader eller apoptose gennem Bax protein i figur 7. Disse resultater foreslog en ny mekanisme for anticancer effekter af SPRC via CSE /H

2S-induceret cellevækst hæmning og apoptose gennem p53 /Bax vej.

de øge niveauet af H2S har vendt modulerer Bax, p53 og Bcl2 protein og mRNA-ekspression. Bax har induceret apoptose gennem Mt og Bcl-2-ekspression. p53 fører til enten inhibering af celleproliferation og DNA-skader eller apoptose gennem Bax protein.

Discussion

I denne undersøgelse har vi påvist en hidtil ukendt anticancervirkning af SPRC på gastrisk cancer og også data til at foreslå sin mulig mekanisme. Flere nye punkter er genereret ud fra vores undersøgelse. For det første viste vi, at SPRC var i stand til at reducere cellevækst evne betydeligt og også undertrykke migration af SGC-7901 celler. For det andet, fandt vi, at SPRC var i stand til at øge apoptose-relaterede morfologiske ændringer og induceret en stor stigning i procentdelen af ​​apoptotiske celler samtidig med en indlysende cellecyklusstop på G

1 /S fasen. Tilsammen støtte disse to fund beviser for en hæmmende virkning af SPRC på SGC-7901 celler. For det tredje, vi yderligere demonstreret, at intraperitoneal administration af SPRC i doser på 50 og 100 mg /kg legemsvægt hver anden dag tre gange om ugen var effektiv til at inhibere væksten af ​​gastriske tumorer i nøgne mus. For det fjerde, fandt vi, at SPRC kunne øge CSE aktivitet og også sin proteinekspression resulterer i forhøjet H

2S niveauer i celledyrkningsmedier og plasma fra nøgne mus. For det femte, fandt vi, at PAG, en inhibitor af CSE, stort set kunne undertrykke de ovennævnte funktioner SPRC. For det sjette, fandt vi, at SPRC behandling forårsagede indlysende elevation af mRNA og protein udtryk for Bax og p53.

Det er blevet rapporteret, at H

2S, [25], [26] kan genereres [24] i gastrisk cancer celler ved pyridoxal-5-phosphat-afhængigt enzym CSE, for hvilke L-cystein er substratet. CSE [27] kunne katalysere pyridoxalphosphat-afhængige β-disulfid og elimineringsreaktion, hvilket resulterer i dannelsen af ​​ammonium, pyruvat og thiocysteine. Thiocysteine ​​reagerer derefter med andre thioler til dannelse H

2S. PAG har været anvendt i flere undersøgelser for at teste den biologiske effekt af inhibering endogen H

2S produktion [28] SPRC, en analog af SAC har cystein-holdige struktur, som kan undergå β-eliminering og tjene som et substrat af CSE. Nøglen propargyl gruppe i SPRC kan kombinere med de aktivitetssteder i KF at øge CSE aktivitet. I vores undersøgelse var tydeligt stigning i CSE proteinekspression i gastriske cancerceller og tumorer af nøgne mus observeres i SPRC-behandlede gruppe; Dette kunne forklares som en “kompenserende effekt” til at producere H

2S at klare apoptose af cancerceller. Humane lungefibroblaster behandlet med H

2S donor, NaHS, vises en stigning i DNA-skader, cellecyklusstandsning og stabilisering af p53, kombineret med induktionen af ​​downstream proteiner, såsom p21, Bax og cytochrom c [29]. Det er blevet rapporteret, at behandlingen af ​​acinære celler ved H

2S er blevet vist at inducere apoptose, som er resultatet af aktiveringen af ​​caspase 3, nedsat protein niveau af Bcl-2 og aktivering af Bax-ekspression. H

2S kunne også inducere apoptose til insulinproducerende betaceller ved at øge ER stress via p38 MAPK-aktivering [30]. Det blev rapporteret, at p53 inducerer apoptose ved enten at øge transkriptionel aktivitet af pro-apoptotiske gener, såsom Bax eller undertrykke aktiviteten af ​​anti-apoptotiske gen af ​​Bcl-2-familien [31], [32]. Bax er også kendt for at inducere mitokondrier drevet apoptose. Her fandt vi også, at aktivering af CSE og øget H

2S niveauer ved SPRC behandling blev kombineret med forhøjet p53 og Bax udtryk i gastriske celler og tumorer. Disse resultater foreslog en ny mekanisme for anticancer effekter af SPRC via CSE /H

2S-induceret cellevækst hæmning og apoptose gennem p53 /Bax vej.

Som konklusion, vores

in vitro

og

in vivo

eksperimentelle resultater viste, at hydrogensulfid donor, SPRC, havde åbenlyse hæmmende og pro-apoptotiske virkninger på mavekræft. SPRC kunne øge CSE aktivitet, hvilket resulterer i et øget niveau af H

2S, som igen modulerer gen udtryk for Bax, p53 og Bcl2.

Metoder

Alle dyr forsøgsprotokoller overholdt Animal Management Regler for lokale myndigheder og ‘Pleje og brug af forsøgsdyr «i Experimental Animal center i Fudan University, Shanghai, Kina.

Nærmere oplysninger om undersøgelsen godkendelse etiske komité

Animal Kvalifikation certifikat nr .: SCXK hu (Shanghai) 2009-0019

Undersøgelse godkendelse .: Fudan University Experimental Animal Research Department, godkendelse nr SYXK hu (Shanghai) 2009-0082

Opkaldt review board: formand: Prof. Yi-Zhun ZHU Dean, School of Pharmacy Fudan Universitet. Næstformand: Prof. Weiyue Lu, Prof. Wei Wu, Prof. Xun Sun, Prof. Wenjiang Zhou

Medlemmer: Prof. Zhang Yun yi, Prof. Li Cong, prof. Jiang Chen, professor Yin Geng li, Prof. Hong mei ji, Prof. Li xu yang

Sekretær:. Tao lin lin

Kemi

SPRC blev syntetiseret ved at reagere L-cystein med propargylbromid. Produktet blev oprenset ved omkrystallisation fra ethanol-vand. Slutproduktet blev verificeret ved 1H kernemagnetisk resonans-spektroskopi. SAC blev indkøbt fra Tokyo Kasei (Tokyo, Japan). Paclitaxel liposom var en gave fra Luye Pharma Group Ltd., Singapore. Propargylglycin (PAG) blev købt fra Yinzheng Chemical CO., LTD (Shanghai, Kina). MTT (dimethyl thiazolyl tetrazoliumbromid) blev indkøbt fra Amresco Inc. USA. Hoechst farvning, Cell Cycle og apoptose analyse Kits blev købt fra Beyotime, Kina. RPMI 1640 medium blev købt fra GIBCO ™ Invitrogen, USA. Kanin polyklonale antistoffer til Bax, P53 og Bcl2 blev indkøbt fra Cell Signaling, USA og gede polyklonalt antistof mod CSE fra Santa Cruz, USA. SuperScript II RT kit og SYBR Green PCR Master Mix blev indkøbt fra Takara, Japan. Tunnel farvningssæt blev købt fra Calbiochem, Tyskland.

Cell linje og kultur

Menneskelig gastrisk karcinom (SGC-7901) celler blev opnået fra Cell Bank of Shanghai Institute for Biological Sciences, Kina og dyrket i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i dyrkningskolber ved 37 ° C i befugtet 5% CO

2 incubator. Cellerne blev fodret indtil konfluens og udvidet ved trypsinisering og sub-dyrket ved lavere tal i nye dyrkningskolber.

MTT assay

MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl ) -2, blev 5-diphenyltetrazoliumbromid) assay udført ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Arumugam et al. [8] med små modifikationer. Kort fortalt celler i suspension indeholdende ca. 8.000 til 10.000 celler blev tilsat til hver brønd af en 96-brønds dyrkningsplade og inkuberes i 24 timer ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2. SPRC, SAC og Paclitaxel liposom blev opløst i dyrkningsmedium og tilsat til cellerne i 96-brønds plader. 10 endelige koncentrationer af SPRC (1 uM, 10 uM, 100 uM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM og 30 mM), SAC (1 uM og 10 uM) og Paclitaxel liposom (10 uM) blev tilsat til cellerne for at studere deres virkning på cellelevedygtighed. Effekten af ​​kombineret behandling af 10 uM SPRC og 10 uM PAG blev også undersøgt. Efter 24 timer 100 pi 1 mg /ml MTT-opløsning blev tilsat til hver brønd og re-inkubation blev fulgt i 4 timer. 100 pi DMSO blev derefter tilsat efter fjernelse af MTT-opløsning, og pladerne blev rystet i 10 minutter. Den optiske densitet af 96-brønds dyrkningsplader blev målt under anvendelse af et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) læser. De optiske densiteter fra de behandlede brønde blev konverteret til en procentdel af levende celler ( “celle overlevelse”) mod kontrol ved hjælp af følgende formel:

Colony-dannende assay

Colony danner eksperiment var udført ifølge fremgangsmåden ifølge Wang et al. (1998, 2003) [9], [10]. Den enkelt cellesuspension blev fremstillet og dyrket i 12-brønds plader ved en densitet på 150 celler pr. Efter 24 timers plantning blev 2 koncentrationer af SPRC (10 uM, 1 uM) og SAC (10 øh, en uM) tilsættes. Et eksperiment med kombineret behandling af 10 uM SPRC og 10 uM PAG blev også undersøgt. Cellerne blev inkuberet i 6 dage. Cellerne blev derefter fikseret i 70% ethanol og farvet med 1% Giemsa blå. De kolonier, der bestod af 50 celler blev scoret og sammenlignet med den normale kontrolgruppe. Hvert eksperiment blev gentaget tre gange.

Hoechst-farvning-assay

Apoptose [11], [12] blev bestemt ved anvendelse af et Hoechst Staining Kit (Beyotime). SGC-7901-celler blev behandlet med SPRC (10 uM), SAC (10 Um), Paclitaxel liposom (10 uM) og kombineret SPRC og PAG (hver 10 uM) i 24 timer. Cellerne blev skyllet to gange i PBS og derefter fikseret i 10 minutter ved 4 ° C og derefter farvet ved karyophilic farvestof, Hoechst 33258, i 5 minutter. Efter en sidste skylning i PBS blev cellerne monteret i moiwol, et anti-fade middel og visualiseret under ultraviolet lys med et fluorescensmikroskop. Fordi denne farvestof pletter både apoptotiske og ikke-apoptotiske celler blev apoptotiske celler identificeres som dem udviser chromatinkondensering og nuklear fragmentering.

Flowcytometrisk analyse af cellecyklus fase fordeling og detektion af apoptose

Alle celler blev først udpladet med en tæthed på 2,5 x 10

5 celler /brønd i plader med 6 brønde. Efter inkubering med SPRC, SAC, Paclitaxel liposom og kombineret SPRC og PAG behandling i 24 timer blev cellerne løsrevet og opsamlet i flowcytometri rør og centrifugeret ved 1000 rpm i 5 min for at opnå en cellepellet.

Apoptose assay

cellerne blev farvet ved anvendelse celleapoptosen påvisning Kit (Beyotime) ifølge producentens instruktioner. Cellepelleten blev vasket to gange med PBS. 1 × bindingsbuffer blev tilsat til 1 × 10

6 celler /ml, og PI blev derefter tilsat i mørke. Efter inkubation i 30 minutter i mørke blev cellerne straks analyseret ved anvendelse Cyan flowcytometer (BD FACSCalibur) og ModFit software.

Cellecyklusanalyse

Cellecyklusanalyse blev udført ved fremgangsmåden ifølge Herman-Antosiewicz et al [13]. Kort fortalt blev celler inkuberet i kulturmedier alene og dyrkningsmedier indeholdende SPRC, SAC og Paclitaxel liposom (10 uM) ved 37 ° C i 24 timer. Celler blev vasket ved kold PBS, fikseret i 70% ethanol og opbevaret ved 4 ° C til efterfølgende cellecyklus-analyse. Fikserede celler blev vasket med PBS én gang, derefter resuspenderet i 1 ml PI-farvning reagens (50 mg /ml propidiumiodid og 1 mg /ml RNAse i 1 ml natriumcitratpuffer, pH 7,4). Prøver blev inkuberet i mørke i 30 minutter før cellecyklusanalyse. Fordelingen af ​​celler i cellecyklussen blev målt ved Cyan flowcytometer (BD FACSCalibur) analysesystem og kvantificering af cellecyklusfordeling blev udført under anvendelse Multi-cyklus Software (ModFit software). Procentdelen af ​​celler i G1, S og G2 faserne blev beregnet.

sårheling assay

Celler blev podet i 6-brønds kulturplader og fik lov at vokse til 90% konfluens. Lignende størrelse sår blev indført til monolag celler ved anvendelse sterile pipettespidser. Sårede monolag celler blev vasket 3 gange med PBS for at fjerne cellerester; SPRC og SAC blev derefter tilsat ved to koncentrationer (1 øh, 10 uM) og paclitaxel liposom (10 uM). Hastigheden af ​​sårlukning blev monitoreret og fotograferet efter 12 og 24 timer. Den sammenlignende hastighed sårlukning af behandlede celler mod kontrollen blev beregnet ved anvendelse af følgende formel: (såret bredde af behandlede celler ved 0 hour – såret bredde ved 24 timer) /(såret bredde Kontrolceller ved 0 Hour – den sår bredde ved 24 timer) × 100.

Kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA blev revers transkriberet under anvendelse af en SuperScript II RT kit (Takara, Japan) primet med oligo (dT). Udtryk af Bcl2, Bax og P53 mRNA blev undersøgt ved real-time PCR med Step One PCR-system (Applied Biosystems). 2 ul af revers transkriberet cDNA-produktet blev tilsat i en reaktionsblanding 20 ul indeholdende 10 ul SYBR Premix EX Taq (2 x), 0,4 ul ROX referencenummer Dye (50 ×), 0,4 uM fremadrettet primer og 0,4 uM belønning primer. Cykliseringsbetingelserne var som følger: præinkubation ved 95 ° C i 30 s, efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 5 s, annealing og forlængelse ved 60 ° C i 31 s. Ved afslutningen af ​​cykling, udførtes smeltekurveanalyse at fastslå specificiteten af ​​PCR-produktet. Den relative kvantitative værdi blev udtrykt af metode ΔΔC

T. Kontrol blev anvendt som kontrolprøve og p-actin blev anvendt som den endogene kontrol. Hvert forsøg blev udført dobbelt og gentages tre gange. Primersekvenserne og forventede produkt størrelse var som følger: Humant β-actin: forward, 5′-CGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘og revers, 5′-TGGAAGGTGGACAGCGA-3′ (201 bp); human Bax: forward, 5’-ATGCGTCCACCAAGAAGC-3 ‘og revers, 5′-GTCCACGGCGGCAATCA-3′ (95 bp); human BCL2: forward, 5’-AACTGGGGGAGGATTGTG-3 ‘og revers, 5′-AGGTGCCGGTTCAGGTAC-3′ (128 bp); human p53:. fremad, 5’-ACCACCATCCACTACAACTA-3 ‘og revers, 5′-AAACACGCACCTCAAAGC-3’ (136 bp)

Western blot-analyse

Celler blev udpladet til skåle og behandlet med SPRC (1 uM, 10 uM), SAC (1 uM, 10 uM) og Paclitaxel liposom (10 uM) i 24 timer. Efter 24 timers behandling blev cellerne vasket to gange med kold PBS. Cellerne fra hver prøve blev solubiliseret i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,1% SDS, 10 mM natriumdeoxycholat, 1 mM phenylmethyl-sulfonylfluorid) og holdt på is i 30 minutter. Celler lysater blev centrifugeret ved 10.000 g ved 4 ° C i 10 minutter og supernatanterne blev opbevaret ved -70 ° C indtil assay. Proteinkoncentration blev målt ved Bradford-metoden. 25

pi

protein for hver gruppe blandet med 5

pi

loading buffer blev adskilt ved 10% SDS-polyacrylamine gel og overført til polyvinylidenfluorid membraner [14]. Membranerne blev blokeret i 2 timer i 5% skummetmælk pulver i Tris-puffer saltvand indeholdende 0,05% Tween 20 (TBST) ved stuetemperatur. De resulterende blots blev derefter probet med polyklonale CHT (cystathionin γ-lyase) /CSE Ab (1:500, Santa Cruz, USA), polyklonale Bcl-2 Ab (1: 1000, cellesignalering, USA), polyklonale Bax AB (1