PLoS ONE: Estradiol og Tamoxifen Fremkald Cell Migration gennem GPR30 og Aktivering af Focal Vedhæftning kinase (FAK) i livmoderkræft med lav eller uden Nuclear østrogen-receptor α (ERa)

Abstrakt

Østrogener og tamoxifen (et antiøstrogen) udøver deres virkninger ved aktivering af østrogenreceptoren (eR) gennem genomiske og ikke-genomiske mekanismer og er impliceret i udviklingen af ​​endometriecancer. Tidligere rapporter har vist, at østradiol og tamoxifen inducere proliferation af humane endometriecancer celler gennem GPR30 (ikke-genomisk ER) signalvejen. Heri, viser vi, at phosphorylering af fokal adhæsionkinase (FAK) er involveret i cellemigrering induceret af estradiol, tamoxifen og G1 (a GPR30 agonist) gennem transmembrane ER (GPR30) i endometriecancer cellelinier med eller uden ERa (Ishikawa og RL95 -2). Yderligere blev GPR30-medieret migration celle yderligere afskaffet ved indgivelse af enten specifik RNA-interferens målretning GPR30 eller en FAK-inhibitor. Desuden har vi valideret, at signaleringen mellem GPR30 og phosphoryleret FAK faktisk medieres af EGFR /PI3K /ERK-vejen. Klinisk, en signifikant sammenhæng mellem niveauet af GPR30 og phophorylated FAK (pFAK) observeret i humane endometriecancer væv med lav eller uden ERa endvidere foreslået, at østrogen-induceret fosforylering af FAK og cellemigration sandsynligvis blev udløst af GPR30 aktivering. Disse resultater tilvejebragt nye indsigter for forståelsen af ​​patofysiologiske funktioner af GPR30 i humane endometriale cancere

Henvisning:. Tsai C-L, Wu H-M, Lin C-Y, Lin Y-J, Chao A, Wang T-H, et al. (2013) Estradiol og Tamoxifen Fremkald Cell Migration gennem GPR30 og Aktivering af Focal Vedhæftning kinase (FAK) i livmoderkræft med lav eller uden Nuclear østrogen-receptor α (ERa). PLoS ONE 8 (9): e72999. doi: 10,1371 /journal.pone.0072999

Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: Marts 22, 2013; Accepteret: 16. juli 2013; Udgivet: 9. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Tsai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Grants NSC-96-2314-B-182-016 og NSC-97-2314-B-182-014-My3 (til HSW) og NSC-99-2321-B-182A-003-My3 (CLT ) fra National Science Rådet, Taiwan; og CMRPG381671 (til HMW) fra Chang Gung Memorial Hospital. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

østrogener binder og aktiverer østrogen-receptorer (ER) til at regulere transskription af målgener [1] via genomiske og ikke-genomiske mekanismer. De genomiske (eller klassisk) østrogen-fremkaldte reaktioner er gennem nukleare receptorer ERa og ERp [2]. ERa er receptoren er ansvarlig for 17β-østradiol (E2) -induceret signalering, hvorimod funktion af ERp er imod den for ERa [3]. De genomiske ER signalering fungerer som ligand-afhængige transkriptionsfaktorer, der direkte binder til østrogen responselementer (Eres) i promotorregionen af ​​målgener og normalt tager timer til dage at fremkalde fysiologiske virkninger i celler [4]. I modsætning hertil ikke-genomisk ER signalering er gennem en transmembran receptor for østrogen [2], [5].

G-protein-koblet receptor 30 (GPR30) er en funktionel membran-receptor involveret i ikke-genomisk østrogen signalering [6] – [8]. Den GPR30-medieret østrogen signalering stimulerer cAMP produktion og intracellulær Ca

2+ mobilisering, og efterfølgende aktiverer forskellige kinaser, der bidrager til cellevækst og migration [2], [9], [10]. I brystcancerceller mangler væsentlige krav, GPR30 medierer opregulering af c-fos-proteinet i nærvær af østrogener, hvilket fører til fremme af celleproliferation [11]. Derudover både estradiol og tamoxifen inducere ekspressionen af ​​

c-fos

celledeling gennem GPR30 (ikke-genomisk ER) signalvejen i forskellige kræftformer [12], [13]. Desuden er det også klart, at overekspression af GPR30 indikerer dårlig prognose for endometrisk, ovarie- og brystcancer [14] – [16]

Cellemigration er påkrævet for invasion af tumorer.. Fokal adhæsion kinase (FAK), en ikke-receptor-tyrosinkinase styrer cellulære signalveje af cellemigrering [17], er involveret i dannelsen og omsætningen af ​​fokale adhæsionssteder [18], [19]. Desuden har overekspression af FAK blevet påvist at angive invasive potentiale og dårlig prognose i forskellige humane cancere [20].

Langvarig udsættelse for endogene eller exogene østrogener og tamoxifen (et østrogen antagonist) er en af ​​risikofaktorerne for celleproliferation og migration i endometriecancer [21] – [23]. Imidlertid blev virkningerne af østrogen på cellemigrering af endometriale cancere med lav eller uden ERa ikke tidligere udforsket, men tidligere undersøgelser har vist, at østrogen inducerer en hurtig phosphorylering af FAK i endometriske stroma og cancerceller [23]. Noteworthily, er det stadig uklart, om østrogener og tamoxifen simpelthen stimulere udbredelsen af ​​endometrie celler

in situ

eller hvis de også gøre disse celler til at invadere på et lokalt sted.

I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at behandling af østradiol (E2), G1 (a GPR30 agonist) og tamoxifen (4-hydroxytamoxifen, OHT) inducerede phosphorylering af FAK på Y397 og cellevandring i endometriske cancercellelinier. Den mekanistiske link og kliniske relevans mellem GPR30 og FAK signalering blev også demonstreret.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

Fyrre-ni patienter, som gennemgik kirurgi ved Chang Gung Memorial Hospital (CGMH) og havde patologisk bekræftelse af endometriecancer blev inkluderet. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital (CGMH-IRB # 98-2576B).

Cell kultur og reagenser

RL95-2 cellelinje, der stammer fra et veldifferentieret adenocarcinom af endometriet [24], blev opnået fra American Type Culture Collection. The Ishikawa cellelinie, en veldifferentieret endometrial adenokarcinom, er en gave fra Dr. Nishida (Kasumigaura National Hospital, Japan) [25]. Ishikawa-celler holdtes i minimalt essentielt medium (α-MEM) indeholdende 15% (volumen /volumen) føtalt bovint serum (FBS) samt 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin. RL95-2 celler blev dyrket i Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM /F12) med 10% føtalt bovint serum (FBS; Biologiske industrier, Israel), 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin. Begge celler blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2. Cellerne blev dyrket til 80% konfluens og overføres til serum-frit medium i 24 timer før behandling med 17β-estradiol (E2), G1 og 4-hydroxytamoxifen (OHT) og medroxyprogesteronacetat (MPA). E2, OHT, G1, MPA (Sigma), lapatinib (en EGFR-inhibitor, GlaxoSmithKline plc, London, UK), FAK inhibitor 14 (Tocris Bioscience, UK) og SRC-inhibitor 1 (Sigma) blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO).

phosphorylering-kinase vifte

En fosforylering-kinase array (Proteome Profiler ™ Array kit, R 45) (p 0,0001) (tabel 1). Klinisk tilfælde med lav udtryk for nuklear ERa studerede afsløre tegn på øget tilbøjelighed til invasion (iscenesættelse fra IB til IVA). Endvidere niveau af phosphoryleret FAK var signifikant korreleret med ekspression af GPR30 i humane endometriale cancere med lav ERa (p 0,05) (. Figur 5C), men blev ikke påvist nogen sådan korrelation mellem ERa og pFAK

(figur 5D.).

(A) i kliniske prøver af humane endometriske cancere med lav ekspression af ERa (histoscore = 10), relativt høj ekspression af GPR30 (histoscore = 270) og pFAK (histoscore = 225) blev observeret (40 × forstørrelse af objektet linse). (B) De histoscores både GPR30 og pFAK var lavere i humane endometriale cancere med høj ER (histoscore 45, venstre panel) sammenlignet med dem med lav ER (histoscore ≤45, højre panel). (C) Der var en positiv korrelation af histoscores mellem pFAK og GPR30 i humane livmoderkræft med lav ERa. (D) Ingen sammenhæng blev fundet i histoscores mellem pFAK og ERa i humane livmoderkræft. NS:. Ikke signifikant

Diskussion

GPR30 er blevet foreslået at virke som et steroid receptor lokaliseret enten til cellen plasmamembranen eller til det endoplasmatiske reticulum og mægle hurtig indsats af østrogen [21], [22]. Det er også indlysende, at GPR30 udløser cellulær proliferation ved aktivering af phosphokinases, f.eks phosphatidyinositol 3-kinase (PI3K) og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), som reaktion på østrogen og tamoxifen [7], [8], [11]. Alligevel er der nogle rapporter, som dokumenterer, at østrogen handler uafhængigt af GPR30 i nogle bestemte celletyper [39] – [42]. Især har en undersøgelse vist, at GPR30 er ude af stand til at mediere østrogen handling, eksempelvis svigt i aktivering cAMP, ERK eller PI3K efter østrogenbehandling, i endotelceller uden ERa og ERp [41]. I den foreliggende undersøgelse knockdown af GPR30 i RL95-2 og Ishikawa endometriecancer-celler ophævet E2 og tamoxifen inducerede phosphorylering af FAK og afskaffet efterfølgende cellevandring (fig. 2E, 2F, 3E og 3F), hvilket indikerer, at GPR30 er stand til at mediere østrogen handling i endometriecancer celler med eller uden nukleare ERa.

Tamoxifen er en selektiv østrogen receptor modulator (SERM), som en ERa antagonist i brystet, men en svag østrogen i endometrium. Anti-cancer behandling med tamoxifen i brystcancer angår en øget forekomst af endometriecancer [43] – [46]. Mekanistisk, tamoxifen aktiverer MAPK-vejen gennem GPR30 at fremme proliferation af endometriecancer-celler [47]. Som med fremme af celleproliferation, tamoxifen aktiveret FAK pathway i både RL95-2 og Ishikawa endometriecancer-celler (fig. 3A, 3B, 3C og 3D). Desuden resultater involverer GPR30 depletion indikerede, at GPR30 var væsentligt at fremme tamoxifen-induceret cellemigration i livmoderkræft (fig. 3e og 3f). Kollektivt, tamoxifen er i stand til at fremprovokere cellemigration via GPR30 i endometriecancer celler med eller uden nukleare ERa.

Der er dokumentation for, at østrogen udløser epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) vej gennem GPR30 i brystkræftceller [36 ]. Lapatinib er en tyrosin kinase inhibitor af EGFR og blokerer EGFR nedstrøms signalering i cancercelle [48]. I denne undersøgelse lapatinib undertrykt phosphoryleringen af ​​FAK induceret af både E2 og tamoxifen i endometriecancer-celler (fig. 4E). Desuden knockdown af EGFR af siRNA inhiberede også E2- og tamoxifen-induceret phosphorylering af FAK i endometriske cancerceller (fig. 4D). Disse resultater viste, at EGFR er afgørende i GPR30-medieret vej og længere støtter idéen om, at lapatinib i kombination med tamoxifen, kan anvendes til patienter med brystcancere for at forhindre udviklingen af ​​endometriecancer [49].

Cell migration er en afgørende egenskab af kræftceller, der påvirker tumor invasive potentiale i tilstødende væv. En bedre forståelse af mekanismen for cellemigrering induceret af østrogener er afgørende for udviklingen af ​​effektive terapier for endometriecancer. I denne henseende har FAK blevet anerkendt at lokalisere til plasmamembranen på steder med fokal adhæsionskomplekser dannelse og fungerer som en central regulator i cellemigrering og celleinvasion involverer proteolytisk nedbrydning af den ekstracellulære matrix [47]. Resultater fra denne undersøgelse også anført, at FAK pathway spillede en vigtig rolle i formidlingen celle migration induceret af E2 og tamoxifen i RL95-2 og Ishikawa endometriecancer-celler (fig. 3A, 3B, 3C og 3D). Desuden undersøgelser under anvendelse inhibitorer og siRNA viste også, at cellemigrering FAK-afhængig medieres gennem EGFR, PI3K og ERK (fig. 4A, 4B, 4C, 4D og 4E). Kollektivt, foreslog vores data, at østrogen-induceret cellemigration medieres gennem aktivering af PI3K /ERK /FAK-vejen i endometriecancer-celler med lav eller uden nuklear ERa.

Noteworthily, er det også muligt, at østrogen-induceret cellemigrering medieres gennem bindevæv vækstfaktor (CTGF). En tidligere rapport har vist, at CTGF er et GPR30 målgen og GPR30 signalering fremmer cellemigration gennem CTGF induktion i ER-negative humane brystkræftceller [37]. Denne vej skal evaluere til yderligere at belyse den mekanisme af østrogen-induceret celle migration i endometrie kræftceller.

Patologisk, er type 1 humane livmoderkræft østrogen-følsomme og har god prognose, mens type 2 humane livmoderkræft er ikke forbundet med øget eksponering for østrogen og bære dårligere prognose [50]. I den foreliggende undersøgelse humane endometriale cancere (n = 24) med lav ERa blev fundet at udtrykke højere niveauer af GPR30 og pFAK sammenlignet med dem (n = 25) med høj ERa (fig. 5B og tabel 1). Derudover GPR30 og pFAK var positivt korreleret i humane livmoderkræft med lav ERa, men ingen sådan sammenhæng blev fundet mellem ERa og pFAK (fig. 5C og 5D). Disse resultater fra

in vivo

undersøgelser indikerede, at livmoderkræft med lav ERa kan være ekstremt følsomme over for østrogen. Derfor kan disse endometriecancere med lav ERa udtrykke højere niveauer af GPR30 og pFAK selv med lave cirkulerende serumniveauer af østrogen og uden tilsætning af eksogent østrogen, hvilket indebærer, at de har et potentiale for at invadere tilstødende væv.