Abstrakt
For nylig godkendte kemoterapeutiske stoffer til behandling af kolorektal cancer ( CRC) har gjort nogle konsekvenser; men der er et presserende behov for nyere målrettede agenter og strategier til at omgå CRC vækst og metastase. CRC ofte udviser naturlig resistens mod kemoterapi og dem, der reagerer i første omgang senere erhverve resistens. En mekanisme til potentielt sensibiliserer CRC-celler, er ved at blokere DNA-polymerase β (Pol-β) aktivitet. Temozolomid (TMZ), et alkyleringsmiddel, og andre DNA-vekselvirkende midler udøver DNA-skader primært repareres ved en Pol-β-dirigeret basen excision reparation (BER) pathway. I tidligere undersøgelser, brugte vi struktur-baserede molekylære docking af Pol-β og identificeret en potent lille molekyle inhibitor (NSC666715). I den foreliggende undersøgelse har vi bestemt den mekanisme, hvormed NSC666715 og dets analoger blok Fen1-induceret streng-fortrængning aktivitet af Pol-β-instrueret LP-BER, forårsager apurin- /apyrimidinisk (AP) stedet ophobning og inducere S-fasen cellecyklus arrestere. Induktion af S-fasen cellecyklusstandsnings fører til fremadskridende alderdom og apoptose af CRC-celler gennem p53 /p21-vejen. Vores første resultater viser også en 10-fold reduktion af IC
50 af TMZ, når det kombineres med NSC666715. Disse resultater giver en vejledning til udvikling af en target-defineret strategi for CRC kemoterapi, der vil være baseret på virkningsmekanismer af NSC666715 og TMZ. Denne kombination strategi kan bruges som en ramme for yderligere at reducere de TMZ doseringer og modstand i CRC patienter
Henvisning:. Jaiswal AS, Panda H, Law BK, Sharma J, Jani J, Hromas R, et al. (2015) NSC666715 og dets analoger Inhibit Strand-Displacement aktivitet af DNA-polymerase β og forstærke Temozolomid-induceret DNA skader Ældning og apoptose i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 10 (5): e0123808. doi: 10,1371 /journal.pone.0123808
Academic Redaktør: Robert W. Sobol, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, UNITED STATES
Modtaget: Juli 22, 2014 Accepteret: 7 marts 2015; Udgivet: 1. maj 2015
Copyright: © 2015 Jaiswal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret
Finansiering:. den finansielle støtte til disse undersøgelser blev leveret af National Institutes of Health (NIH) tilskud R01-CA097031. Celprogen Inc. ydet støtte i form af lønninger til forfattere Jay Sharma og Jitesh Jani, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Jay Sharma og Jitesh Jani er ansat af Celprogen Inc. og har økonomiske interesser i selskabet. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.
Introduktion
Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt amerikanske mænd og kvinder (cancer Tal 2014, American cancer Society, Atlanta, GA). Den nuværende metode til at opdage anti-tumor midler afhængig af semi-empiriske screening procedurer. Imidlertid har identifikationen af midler gennem denne metode vist sig at være ineffektiv ved behandling af CRC grund af et utilstrækkeligt forståelse af deres farmakologi og deres sum-total effekt på skæbnen for celler i en
in vivo
miljø, i forbindelse med afvigende veje, og i tumor mikromiljø [1-4].
det er velkendt, at en kompenserende DNA-reparation kapacitet i tumorceller alvorligt begrænser effekten af DNA-alkylerende anti-cancer midler og, vigtigere, fører til gentagelse af resistente tumorer [5-7]. Anvendelsen af DNA-alkylerende midler som kemoterapeutiske lægemidler er baseret på deres evne til at udløse en celledød respons [8] og deres terapeutiske virkning bestemmes af balancen mellem DNA-skader og reparation. De DNA-alkylerings- skade-inducerede læsioner er repareret af DNA-polymerase β (Pol-p) -dirigerede basis excision reparation (BER), O
6-methylguanin DNA-methyltransferase (MGMT) og mismatch reparation (MFR) veje. Især de inhibitorer, der er udviklet som anticancer narkotika hovedsageligt rettet mod disse tre veje [9, 10]. Det aktive nedbrydningsprodukt af DNA-alkylering prodrug-TMZ (NSC362856; 3,4-dihydro-3-methyl-4-oxoimidazo [5,1
d
] -1,2,3,5-tetrazin -8-carboxamid) er 5- (3-methyltriazen-1-yl) -imidazol-4-carboxamid (MTIC) [11, 12], som methylerer DNA ved N
7-methylguanin (N
7meG), N
3-methyladenin (N
3meA), N
3-methylguanin (N
3meG) og O
6-methylguanin (O
6meg) i faldende orden reaktivitet. BER er ansvarlig for reparation af 70%, 5% og 9% af N
7-meg, N
3-MEG og N
3-MEA læsioner induceret af TMZ henholdsvis [13- 16]; dog har den potentielle nytte af Pol-β som et mål af BER vej blokaden ikke er blevet udforsket.
I tidligere undersøgelser, vi har vist, at den lille molekyle NSC666715 [4-chlor-N- [5- (4-chloranilino) -1 H-1,2,4-triazol-3-yl] -5-methyl-2-sulfanylbenzenesulfonamide] efterligner interaktionen af adenomatøs polyposis coli (APC) med Pol-β og flap endonuclease 1 (Fen1) , blokerer Pol-β-rettet BER pathway, og øger cytotoksicitet af TMZ til CRC’er [17]. TMZ producerer streng pauser i BER-medieret reparation af N
7-MEG og N
3-mea addukter. Afbrydelsen af BER pathway kan bidrage til cytotoksiciteten af TMZ på grund af ophobning af AP-steder efter dannelse af DNA-strengbrud [18]. TMZ-induceret celledød er blevet rapporteret at være medieret af flere veje afhængigt af typen af kræftceller og koncentrationen af lægemidlet.
Hvis AP-steder ikke repareres, de ophobes og føre til enkeltstrenget DNA pauser (SSB’er), der stall DNA-replikation gaffel og danner dobbelt-streng (og enkeltstrengede) DNA pauser i S-fasen. Disse afviklede gafler udløse apoptose, når de kollapser at danne ensidige dobbelt-strenget DNA pauser (DSBs) [19]. Kemoterapi-induceret DSBs er forbundet med senescens og apoptose [20, 21]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, hvordan blokaden af BER pathway ved NSC666715 (og dets analoger) kan være involveret i TMZ-induceret AP-sted akkumulering, og senescens og apoptose i HCT116 CRC-celler. Vores centrale hypotese er, at blokaden af BER vil inducere signifikant akkumulering af TMZ-medierede AP-steder, der fører til senescens efterfulgt af aktiveringen af caspase 3 /PARP1 spaltning. Dette forventes at resultere i CRC vækstinhibering via apoptose forårsaget af reducerede niveauer af det anti-apoptotiske protein, Bcl2, og forhøjede niveauer af det pro-apoptotiske protein, Bax [22, 23].
Materialer og Metoder
Vedligeholdelse af celler og behandling
HCT116 human tyktarmskræft cellelinjer med vildtype
p53
gen (p53
+ /+) eller med
p53
gen-knockout (p53
– /-) eller
p21
gen-knockout (p21
– /-) blev dyrket i McCoys 5a medium suppleret med 10% føtalt bovint serum ( FBS, HyClone), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Den HCT116 cellelinien blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). Denne cellelinje blev udnyttet, fordi den er resistent over alkylerende midler på grund af MMR-mangel. HCT116 (p21
– /-) og HCT116 (p53
– /-). Cellelinjer blev tilvejebragt af Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University) [24, 25]
Oligonukleotider og Kemikalier
oligonukleotider til lang patch (LP) -BER assay blev indkøbt fra Sigma-Genosys (Woodlands, TX). T4-polynukleotidkinase (PNK) blev indkøbt fra New England Biolabs (Ipswich, MA) og radionuklid [γ-
32P] ATP blev indkøbt fra Perkin Elmer, Inc. (Boston, MA). Småmolekylære inhibitorer (SMI) NSC666715 og dets analoger NSC661073 [N- (5-anilino-1H-1,2,4-triazol-3-yl) -4-chlor-5-methyl-2-sulfanylbenzenesulfonamide], NSC666713 [2 – [2 – [(5-anilino-1H-1,2,4-triazol-3-yl) sulfamoyl] -5-chlor-4-methylphenyl] sulfanylacetic syre], NSC666717 [4-chlor-N- [5- (3-methoxyanilino) -1 H-1,2,4-triazol-3-yl] -5-methyl-2-sulfanylbenzenesulfonamide], og NSC666719 [4-chlor-5-methyl-N- [5- (naphthalen-2 ylamino) -1 H-1,2,4-triazol-3-yl] -2-sulfanylbenzenesulfonamide], og TMZ blev opnået fra Developmental Therapeutics Program af National Cancer Institute of the National Institutes of Health (DTP, NCI-NIH ). Den kemiske struktur af disse SMI er vist i fig 1.
De kemiske strukturer af NSC666715 og dets analoger NSC661073, NSC666713, NSC666717 og NSC666719 er udarbejdet ved hjælp af ChemDraw softwaren.
Syntese og mærkning af DNA Underlag
for at undersøge effekten af SMI på Pol-β-rettet streng-forskydning og LP-BER aktiviteter, blev en 63-mer oligonukleotid syntetiseret som tidligere beskrevet [26]. Nukleotidsekvensen af dette oligonukleotid indeholder et AP-sted analog kendt som F (3-hydroxy-2-hydroxymethyltetrahydrofuran), som er anbragt ved 24-nt og benævnt F-DNA (5′-CTAGATGCCTGCAGCTGATGCGCFGTACGGATCCACGTGTACGGTACCGAGGGCGGGTCGACA-3 ‘). F-DNA blev geloprenset og mærket med [γ-
32P] ATP ved 5′-enden under anvendelse af T-4 polynucleotidkinase og annealet til en komplementær oligonukleotidstreng.
In vitro
streng-fortrængning syntese og LP-BER assay
assay reaktionsblandingen Pol-β-dirigeret streng-fortrængning blev samlet i et 30 pi volumen med 30 mM Hepes, pH 7,5, 30 mM KCI, 8,0 mM MgCl
2, 1,0 mM DTT, 100 ug /ml BSA, 0,01% (vol /vol) Nonidet P-40, 2,5 nM
32P-mærket 63-mer F-DNA-substrat, 2 nM AP-endonuclease 1 (APE1), 5 nM Pol-β og 0-125 uM SMI. LP-BER reaktionen blev rekonstitueret under anvendelse af oprensede proteiner i et endeligt reaktionsvolumen på 30 pi indeholdende 30 mM Hepes, pH 7,5, 30 mM KCI, 8 mm MgCl
2, 1 mm dithiothreitol, 100 ug /ml bovint serumalbumin, 0,01% Nonidet P-40, 0,5 mM ATP, og 10 um af hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP. Reaktionsblandingen blev samlet på is ved tilsætning af 0,5 nm APE1, 2,5 nm Pol-β, 10 nm flap endonuclease 1 (Fen1), og 100 nm DNA-ligase I og derefter inkuberet i 5 min. Reaktionerne blev initieret ved tilsætning af 2,5 ng
32P-mærket 63-mer F-DNA efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i 45 minutter. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af stopbuffer (0,4% (vægt /volumen) SDS, 5 mM EDTA, 1 ug proteinase K) og inkuberet ved 37 ° C i yderligere 30 min [17, 26-29]. Efter inkubation ved 37 ° C blev DNA’et udvundet ved phenol /chloroformekstraktion og ethanolpræcipitation. Det udvundne DNA blev vasket med kold 70% ethanol og suspenderet i prøven loading dye. Reaktionsprodukterne blev separeret på en 15% acrylamid og 7 M urinstof-gel. De radioaktive signaler blev visualiseret ved autoradiografi.
Western blot-analyse
Til Western blot-analyse blev encellede suspensioner af HCT116 celler udpladet (0,5 x 10
6 celler pr 60 mm skål ) i tre eksemplarer. Efter 24 timer, når cellerne blev fastgjort til pladerne, blev de behandlet med lille molekyle inhibitor (er) alene eller i kombination med TMZ i 48 timer. Ændringer i proteinniveauer efterfølgende til behandling af SMI blev bestemt ved Western blot analyse under anvendelse af hel-celle ekstrakter. De anvendte antistoffer til påvisning af niveauerne af p53, p21, Bcl2, Bax, Poly [ADP-ribose] polymerase 1 (PARP-1), spaltet PARP1, spaltet caspase 3, caspase 3, apoptoseinducerende faktor (AIF) og GAPDH blev opnået fra cellesignalering Technologies (Danvers, MA).
vurdering af AP steder i genomisk DNA
til beregning af antallet af AP sites, en enkelt-celle suspension af HCT116 celler blev belagt ( 0,5 x 10
6 celler pr brønd) i tre eksemplarer i seks-brønds plader. Når cellerne blev fastgjort til pladerne, blev de forbehandlet i 2 h med 25 pM NSC666715, NSC666717 og NSC666719 efterfulgt af 500 uM TMZ behandling i yderligere 48 timer. Celler blev høstet, og AP-steder blev bestemt under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i tidligere undersøgelser [30, 31]. Genomisk DNA fra de behandlede og ubehandlede grupper blev isoleret under anvendelse af GenElute Mammalian Genomisk DNA isolation kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Fem til 10 ug af det genomiske DNA i 150 pi 1x PBS blev inkuberet med 1 mM aldehyd reaktiv probe (ARP) (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) ved 37 ° C i 10 minutter, derefter ethanolpræcipiteret og endelig opløst i 1x TE-buffer (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7,2) og kvantificeret.
ARP reagerer med AP-stedet-holdige genomisk DNA og danner et kompleks, som kan kvantitativt detekteres under anvendelse kemiluminescerende detektion. Kort beskrevet en pg af ARP-behandlede varmedenatureret DNA blev slot-blottet på en positivt ladet nylonmembran (Amersham Corp., Piscataway, NJ). Nylonmembranen blev gennemblødt med 5x SSC (0,75 M NAC1, 0,075 M trinatriumcitrat) ved 37 ° C i 15 minutter, kortvarigt lufttørret og bagt i en vakuumovn ved 80 ° C i 1-2 timer. Membranen blev præinkuberet med 10 ml Tris-NAC1 puffer indeholdende BSA (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NAC1, 1 mM EDTA, 0,5% casein, 0,25% BSA og 0,1% Tween 20) ved stuetemperatur i 1 time. Membranen blev derefter inkuberet i den samme opløsning indeholdende streptavidin-konjugeret peberrodsperoxidase (Biogenex, San Ramon, CA) ved stuetemperatur i 30-45 min. Membranen blev skyllet tre gange i 10 minutter hver med vaskebuffer (0,26 M NAC1, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HC1, og 0,1% Tween 20, pH 7,5) blev, og peberrodsperoxidase enzymatiske aktivitet på membranen visualiseret under anvendelse ECL-reagens (Amersham Corp., Piscataway, NJ). Membranen blev derefter eksponeret for røntgenfilm (Kodak XAR 5x; Kodak) i 5-10 sek. Den fremkaldte film blev analyseret for kvantificering af AP sites ved hjælp af ImageJ program (Rasband, WS, ImageJ, amerikanske National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014 ). Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.
Ældning associeret β-galactosidaseaktivitet assay (SA-Øgal Assay)
Ældning forbundet-β-gal-aktivitet blev målt som beskrevet tidligere [32, 33] med mindre ændringer [34]. HCT116-celler blev forbehandlet i 2 timer med SMI efterfulgt af TMZ behandling i yderligere 48 timer. Celler i sub-sammenflydende kulturer blev vasket med iskold phosphatbufret saltvand (PBS), fikseret i 4% (volumen /volumen) paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur og vaskes igen tre gange med PBS. Celler blev inkuberet med frisk gjort farvningsopløsning indeholdende 1 mg /ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl β-D-galactosid (X-gal), 40 mM citronsyre-natriumphosphat (pH 6,0), 5 mM kalium ferricyanid, 5 mM kaliumferrocyanid, 150 mM NaCl og 2 mM MgCl
2 i 24 timer ved 37 ° C. De blå-farvede celler blev observeret under mikroskop (Leica DMI 4000B). Antallet af senescens-associerede β-gal-positive celler blev observeret og analyseret under et mikroskop (Leica DMI 4000B), og antallet af SA-β-gal-positive celler (blå farvede celler) blev talt i en samlet billedudsnittet af billede. Vi sætter vilkårligt den visuelle grænse for at udelukke de falske positive celler som baggrund for de SA-β-gal-positive celler i et defineret område på billedet. Resultater er udtrykt som procent af SA-β-gal-positive celler til totale celler [35].
fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)
Til bestemmelse af cellecyklusprogression profil, vi belagte HCT116 celler i 60 mm vævskulturskåle og voksede dem, indtil de nåede 60% konfluens. HCT116-celler blev forbehandlet i 2 timer med NSC666715 (50 uM) og PFTα (10-30 uM) efterfulgt af TMZ (500 uM) i yderligere 48 timer som angivet i tabel 1 legende. Celler blev høstet, vasket en gang med iskold PBS, og bearbejdet til FACS-analyse som tidligere [36] beskrevne. Det cellulære DNA-indhold blev analyseret under anvendelse af et Becton-Dickinson FACScan flowcytometer (San Jose, CA). Mindst 10.000 celler pr prøve blev betragtet i låge regioner, der anvendes til beregninger. Intervallerne for G
0 /G
1 blev S, G
2 /M og sub-G
1 fase (apoptotiske) celler etableret baseret på deres tilsvarende DNA indholdet af histogrammer. Resultaterne blev analyseret og udtrykt i procent af de samlede gated celler ved hjælp af ModfitLT 3.1-programmet (Verity Software House, Topsham, NE).
Statistisk analyse
Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange og resultater blev udtrykt som gennemsnit ± SE. Envejs variansanalyse (ANOVA) blev beregnet med SigmaPlot 9 (Systat Software, San Jose, CA). En en-halet t-test blev anvendt til sammenligning ingen signifikant forskel mellem kontrol- og behandlede grupper. Kriteriet for statistisk signifikans var p 0,05. For vestlige blotting resultater, blev bandet intensiteter målt ved hjælp af ImageJ og normaliseret med GAPDH.
Resultater
Pol-β-hæmmer NSC666715 og dets analoger hæmmer LP-BER i en
i vitro
rekonstitueret system,
i den foreliggende undersøgelse testede vi adskillige analoger af NSC666715, såsom NSC661073, NSC666713, NSC666717, og NSC666719 for deres evne til at blokere LP-BER. De repræsentative LP-BER resultater er vist i figur 2. Udseendet af 23-mer indsnit produkt i bane 2 viser den funktionelle aktivitet af APE1 proteinet. Pol-β-medieret 1-nt indarbejdet 24-mer produkt i Bane 3 og streng-fortrængning produkter i Lane 4. stimulering af streng-fortrængning syntese af Pol-β ved Fen1 er en etableret funktion i Fen1-medierede LP-BER [28, 29, 37, 38]. I disse forsøg viste vi, at SMI reducerede Fen1-medieret streng-fortrængning aktivitet af Pol-β (figur 2, sammenlign bane 5 med 6-9, 10-13, 14-17, 18-21, og 22-25, henholdsvis), en konsekvens af blokeret LP-BER (figur 2, sammenlign den 63-mer repareret produkt af bane 4 med 6-9, 10-13, 14-17, 18-21, og 22-25, henholdsvis). Den SMI viste desuden blokaden af LP-BER på 50 uM; Men den maksimale sammenlignelige blokade ses ved lavere koncentrationer var NSC666715 og dens to analoger NSC666717 og NSC666719 (Fig 2, sammenligne bane 5 med 14-17, 18-21 og 22-25, henholdsvis).
LP-BER blev bestemt under anvendelse af en
in vitro
rekonstitueret assaysystem.
Panel A
viser forsøgsprotokollen. The assay detaljer er givet i Materialer og Metoder.
Panel B
viser et autoradiogram af LP-BER, som er repræsentativt for tre forskellige forsøg. Bane 1 viser
32P-mærket 63-mer F-DNA og bane 2 viser den 23-mer produktet efter APE1 indsnit. Bane 3 viser Pol-β-medieret streng-fortrængning syntese. Bane 4 viser Pol-β-medieret streng-fortrængning syntese stimuleres af Fen1 (bane 4). Bane 5 viser den fuldstændige reparation af 63-mer F-DNA gennem LP-BER pathway i nærvær af APE1, Pol-β, Fen1 og DNA-ligase I. Lanes 6-9, 10-13, 14-17, 18 -21 og 22-25 viser virkningen af forskellige koncentrationer af Pol-p-hæmmere NSC 661.073, 666.713, 666.715, 666.717 og 666.719 om LP-BER-aktivitet.
Pol-Ø streng-fortrængning hæmmere øge byrden af AP-steder i CRC celler efter TMZ behandling som følge af cellulær toksicitet
i disse eksperimenter bestemte vi omfanget af DNA-beskadigelse eller dannelsen af AP-steder efter TMZ behandling i nærvær eller fravær af SMI i HCT116 cellelinie. Det testede SMI’er (NSC666715, NSC666717 og NSC666719) viste en stigning i AP steder (figur 3, sammenlign bane 1 med 2), og byrden af AP sites blev yderligere forøget med kombinationsbehandling med TMZ (figur 3, sammenligne bane 1, med 3 og 4, henholdsvis). Da SMI blokere Pol-β-vejen og ikke forstyrrer MMR-vejen, som forventet var der ingen signifikant forskel på niveauet af AP-steder i begge MMR-deficiente og MMR-dygtige HCT116 cellelinier efter TMZ behandling alene eller i kombination med SMI’er (data ikke vist). Disse resultater antyder, at SMI’er NSC666715, NSC666717, og NSC666719 er specifikke for Pol-β-rettet blokade af BER pathway, og er derfor involveret i TMZ-induceret akkumulering af AP-steder.
Celler blev forbehandlet i 2 h med 25 pM af de småmolekylære inhibitorer NSC666715, NSC666717 og NSC666719, efterfulgt af behandling med 500 uM af TMZ i yderligere 48 timer. Genomisk DNA blev isoleret og behandlet til AP-sted bestemmelse som beskrevet i Materialer og Metoder.
Panel A
viser slot blot analyse af AP steder i HCT116 celler behandlet med 25 uM NSC666715, NSC666717 og NSC666719 og 500 uM TMZ.
Panel B
viser kvantitativ analyse af AP sites. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SE af tre forskellige bestemmelser. * = Signifikant anderledes end den ubehandlede kontrolgruppe (P 0,05).
TMZ inducerer p21 niveauer via p53 pathway
For at afgøre, om TMZ aktiverer p53 /p21 vej, og om NSC666715 viser nogen effekt på denne vej, vi behandlede HCT116 celler med TMZ alene eller i kombination med NSC666715. Resultaterne viste en betydelig stigning i både p53 og p21 niveauer efter TMZ behandling alene (fig 4A og 4B, sammenlign bane 1 med 2). Behandling med NSC666715 alene havde ingen virkning på p53-niveauer, men p21-niveauer steg (fig 4A og 4B, sammenlign bane 1 med 3). Dette antyder, at NSC666715 kan kræve meget lidt p53 aktivitet for p21-aktivering eller inducere p21 gennem en p53-uafhængig mekanisme. Kombinationen af TMZ og NSC666715 øget p53 og p21 niveauer, men i et lignende omfang som deres individuelle behandlinger (Fig 4A og 4B, sammenligne banerne 1-4).
De HCT116 celler blev forbehandlet med forskellige koncentrationer af PFTα og 50 uM NSC666715 i 2 timer og derefter med 500 pM TMZ alene eller i kombination i yderligere 48 timer. Celler blev høstet, og cellelysater blev fremstillet og forarbejdet til Western blot-analyse. Panel A viser immunblots af p53, p21, GAPDH og p-actin proteiner. Panel B er den kvantitative repræsentation af p53 og p21 proteinniveauer efter normalisering med GAPDH. Bane 1 viser p53 og p21 protein niveauer fra den ubehandlede kontrolgruppe og i bane 2 og 3 efter behandling med 50 og 500 uM NSC666715 og TMZ hhv. Resultater i Lane 4 er fra kombinationsbehandling med 50 pM NSC666715 og 500 uM TMZ. Resultater i Lane 5 er fra kombinationsbehandling med 50 pM NSC666715 og 30 uM PTFα. Resultater i Lanes 6-8 show p53 og p21 niveauer efter behandling med 10, 20 og 30 uM PFTα hhv. Resultater i Lanes 9-11 og 12-14 er fra kombinationsbehandlinger med enten 500 uM TMZ og 10, 20 og 30 uM PFT, eller henholdsvis med 50 pM NSC666715, 500 uM TMZ og 10, 20 og 30 uM PFT,. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± SE af tre forskellige eksperimenter. * Og
# = Markant anderledes end den ubehandlede kontrol (P 0,05).
For yderligere at forstå, om stigningen i p21 niveauet efter TMZ og NSC666715 behandling var p53-afhængig, vi bestemt p53 og p21-niveauer i HCT116-celler (indeholdende vildtype p53 og p21) og HCT116 (p53
– /-) celler (p53-knockout og vildtype p21) med TMZ alene eller i kombination med NSC666715. Resultaterne viste en betydelig stigning i både p53 og p21 niveauer efter TMZ behandling alene (fig 4A og 4B, sammenlign bane 1 med 2) i HCT116-celler. For at undersøge, om TMZ-medierede stigning i p21 niveauet var forårsaget af p53, vi behandlede HCT116 (p53
– /-) celler med TMZ, og bestemt p21 niveauer. Resultaterne viste ingen stigning i p21 i HCT116 (p53
– /-) celler efter TMZ behandling, hvilket antyder, at funktionel p53 er påkrævet for p21 induktion (fig 4A). For yderligere at verificere dette, vi pre-behandlet HCT116 celler med pifithrin-α (PFTα), en p53-inhibitor, der nedregulerer
p21
genekspression [39], efterfulgt af behandling med TMZ. Resultaterne viste, at behandling med PFTα alene i HCT116 celler stabiliseret p53 og nedsat p21 niveauer, mens p21 i HCT116 (p53
– /-) celler forblev upåvirket (fig 4A, sammenligning af bane 6-8) indikerer, at p53 er involveret i p21 regulering (fig 4A og 4B, sammenligne banerne 6-8). PFTα faldt også p21-niveauer på en dosis-afhængig måde efter behandling med TMZ alene eller i kombination med NSC666715 (Fig 4A og 4B, sammenlign bane 9-11 og 12-14, henholdsvis). PFTα og NSC666715 behandlede celler viste nogle ophobning af p53 og p21 proteiner (Fig 4A og 4B, bane 5), hvilket tyder på, at NSC666715 også kan kræve p53 /p21 vej for dets aktivitet.
TMZ-behandlede HCT116 celler, bliver anholdt i S-fasen af cellens cyklus frigives af PFTα behandling
Vi rettet rolle p53 i cellecyklusstop efter NSC666715 og TMZ behandling. Vi pre-behandlet HCT116-celler med forskellige koncentrationer af PFT-α efterfulgt af TMZ behandling for FACS-analyse. FACS Analyseresultaterne viste en signifikant S-fasen af celler efter TMZ behandling, som blev reduceret i nærværelse af PFTα i en koncentrationsafhængig måde (tabel 1). Mens der var ingen virkning af NSC666715 behandling alene, PFTα behandling forårsagede en signifikant S-fasen ved lavere koncentrationer. Men ved højere PFTα koncentrationer blev cellerne frigjort fra S-fase og akkumuleret i G
1-fase. PFTα behandling reducerede S-fasen anholdelse af HCT116 celler efter behandling med TMZ eller i kombination med NSC666715. PFTα og NSC666715 behandling sammen havde ikke nogen effekt på S-fasen anholdelse. Akkumuleringen af celler i G
2 /M-fase forud for apoptose begyndte 48 timer efter behandling med enten TMZ alene eller i nærværelse af NSC666715, men effekten var ikke signifikant. Disse resultater antyder, at TMZ inducerer en S-fase-cellecyklusstandsnings involverer p53-signalvejen, som kan ophæves ved PFTα. vi erkender dog, at PFTα effekter kan skyldes både p53-afhængige og-uafhængige mekanismer.
NSC666715 forbedrer TMZ-induceret aldring i HCT116 celler
Først vi bestemt, om TMZ kan fremkalde ældning i HCT116 celler. Resultaterne viste en stigning i SA-Øgal farvning; en indikator for senescens, i TMZ-behandlede HCT116-celler (Fig 5A og 5B). NSC666715 alene ikke signifikant inducerer ældning i tyktarmen kræftceller. Imidlertid NSC666715 i kombination med TMZ udløst og hyppigere senescens associeret β-gal-positive celler på en dosis-afhængig måde og fortsatte med at vise statistisk signifikant stigning i senescens. Tilsætning af TMZ til cellerne resulterede i en 36%, 48%, 60%, 64% og 60% induktion af senescens (figur 6A og 6B). Disse resultater korrelerer med en NSC666715-medieret forøgelse i akkumulering af AP-steder og øget p53 /p21-aktivitet med forøget senescens i TMZ-behandlede HCT116 celler.
HCT116-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af TMZ i 48 timer og derefter bearbejdet for SA-Øgal farvning. Panel A viser SA-Øgal farvning. Panel B repræsenterer den kvantitative analyse af SA-Øgal farvning. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE for fire forskellige skøn. * = Signifikant forskellig fra den ubehandlede kontrol (p 0,05).
HCT116-celler blev forbehandlet med forskellige koncentrationer af NSC666715 for 2 timer efterfulgt af behandling med 250 uM af TMZ i yderligere 48 timer. Efter behandling blev cellerne behandlet til SA-Øgal farvning. Panel A viser SA-Øgal farvning. Panel B repræsenterer den kvantitative analyse af SA-β gal-farvning. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE for fire forskellige skøn. * Og
# = signifikant forskellig fra den ubehandlede kontrol eller de 10, 25, 50 og 100 uM NSC666715 behandlede grupper, henholdsvis (p 0,05).
TMZ-induceret senescens er p53 /p21 afhængig
Efter behandling af
p53
p21
gen knockout HCT116 (p53
– /-) og HCT116 (p21
– /-) cellelinjer [25, 40] med 500 pM af TMZ i 48 timer, observerede vi en robust stigning i SA-Øgal farvning i HCT116-celler og markant lavere farvning i både HCT116 (p53
– /-) og HCT116 ( p21
– /-) cellelinjer (fig 7A og 7B). Disse resultater antyder, at p53-afhængig p21-aktivering er påkrævet for TMZ-induceret senescens i HCT116-celler.
HCT116-celler med eller uden p53 og p21-ekspression blev behandlet med 500 pM TMZ i 48 timer, og derefter bearbejdet for SA -βgal farvning. Panel A viser involveringen af p53 og p21 i TMZ-induceret senescens. Panel B repræsenterer kvantitativ analyse af de data, som er præsenteret som gennemsnit ± SE for fire forskellige skøn. * = Signifikant anderledes end den ubehandlede kontrol (p 0,05).
PFTα blokke TMZ-induceret aldring i HCT116 celler med eller uden NSC666715 behandling
For yderligere at fastslå, at den forbedrede ældning i HCT116 efter behandling med TMZ alene eller i kombination med NSC666715 kræver p53 /p21-vejen, vi undersøgte SA-Øgal farvning i HCT116-celler behandlet med PFTα, NSC666715 og TMZ alene eller i kombinationer (fig 8A og 8B). Behandlingsgrupperne var de samme som i de ovennævnte forsøg. Behandling med NSC666715 og PFTα alene viste ingen stigning i SA-Øgal farvning (Fig 8A [AIII] og 8A [b]) sammenlignet med kontrol (fig 8A [ai]). PFTα behandling reducerede TMZ-induceret SA-Øgal farvning af HCT116 celler på en dosis-afhængig måde (sammenlign med fig 8A [aii] med 8A [c]). Desuden forbedring af SA-pgal farvning efter TMZ og NSC666715 kombinationsbehandlingen blev også nedsat, når HCT116 celler blev forbehandlet med forskellige koncentrationer af PFTα (sammenlign Fig 8A [AIV] med 8A [d]). Disse resultater yderligere fastslået rolle p53 /p21 pathway i TMZ-induceret senescens i HCT116-celler, og dette indikerer, at NSC666715-medieret BER signalering er afhængig af p53 /p21-vejen.
HCT116-celler blev forbehandlet med forskellige koncentrationer PFTα (10-30 um) og /eller 50 uM NSC666715 i 2 timer efterfulgt af behandling med 500 uM TMZ i yderligere 48 timer. Panel A viser SA-Øgal farvning af cellerne. Panel B repræsenterer den kvantitative analyse af antallet af SA-pgal positive celler. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE for fire forskellige skøn.
¶ = Markant anderledes end den ubehandlede kontrol (p 0,05).
# = Markant anderledes end 50 uM NSC666715 alene behandlede gruppe (p 0,05).
§ og
§§ = Markant anderledes end de 10 og 20 uM PFTα alene behandlede grupper, henholdsvis (p 0,05). *, ** Og *** = Betydeligt anderledes end 500 uM TMZ i kombination med 10, 20 og 30 uM PFTα behandlede grupper, henholdsvis (p 0,05).
TMZ-induceret aldring
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.