PLoS ONE: Kandidat microRNA Biomarkører i Human Gastric Cancer: en systematisk gennemgang og validering Study

Abstrakt

mavekræft (GC) er fortsat en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan, og der er derfor et klart behov for at søge for mere følsomme tidlige diagnostiske biomarkører. Vi udførte en systematisk gennemgang af otte publicerede miRNA profilering undersøgelser, der sammenlignede GC væv med tilstødende noncancerous væv. En miRNA ranking system blev anvendt, der tog hyppigheden af ​​sammenligninger, retning af differentieret udtryk og samlede stikprøve størrelse i betragtning. Vi identificeret fem miRNA, der var mest konsekvent rapporteret at være opreguleret (miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a og miR-20a) og to miRNA, der blev nedreguleret (miR-378 og miR-638). Seks af disse blev yderligere valideret i 32 parrede sæt af GC og tilstødende noncancerous vævsprøver ved hjælp af real-time PCR. MIR-21, MIR-106b, MIR-17, MIR-18a og MIR-20a blev bekræftet at være upregulatedin GC væv, mens ekspressionen af ​​MIR-378 blev formindsket. Endvidere fandt vi en signifikant sammenhæng mellem ekspressionsniveauer af MIR-21, MIR-106b, MIR-17, MIR-18a og MIR-20a og klinisk-patologiske træk ved GC. Disse miRNA kan anvendes til diagnostiske og /eller prognostiske biomarkører for GC, og derfor garanterer yderligere undersøgelse

Henvisning:. Wang J-L, Hu Y, Kong X, Wang Z-H, Chen H-Y, Xu J, et al. (2013) Det overvejes at microRNA Biomarkører i Human Gastric Cancer: en systematisk gennemgang og validering Study. PLoS ONE 8 (9): e73683. doi: 10,1371 /journal.pone.0073683

Redaktør: William CS. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: Maj 16, 2013; Accepteret: 19 Jul 2013; Udgivet: 9. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of Key Program (nr 30.830.055), Ministeriet for Folkesundhed, Kina (nr 200.802.094), Undervisningsministeriet (nr 20090073110077) til Fang JY, og Doctor Innovation Foundation af Shanghai Jiao-Tong University School of Medicine (nr BXJ201219) til Wang JL. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af en nylig fald i forekomsten af ​​mavekræft (GC) [1], er det stadig en årsag til større sygelighed og dødelighed på verdensplan, især i det østlige Asien. I alt en million nye tilfælde af GC fandt sted i 2008, med 738.000 dødsfald [2]. Dette tegner sig for 8% af de samlede kræfttilfælde og 10% af de samlede dødsfald. Selvom endoskopi kan registrere de tidlige stadier af GC, er de fleste tilfælde stadig diagnosticeret på et fremskredent stadium, hvilket resulterer i en dårlig prognose [3]. Den 5-årige overlevelsesrate for GC tilfælde med stadie II varierer fra 30% til 50%, men falder til mellem 10% og 25% for patienter med stadium III sygdom [4]. Selvom endoskopiske teknikker udvikler sig hurtigt, deres værdi for tidlig påvisning af GC er begrænset på grund af mangel på følsomhed, høje omkostninger og besvær. Nye diagnostiske og prognostiske biomarkører for GC er derfor et akut behov.

MikroRNA’er (miRNA) er korte kodende RNA molekyler af 19-25 nt. De regulerer genekspression på post-translationel niveau ved at styre RNA-inducerede silencing komplekset til miRNA målsteder i den 3′-utranslaterede region af mRNA, der fører til mRNA nedbrydning eller inhiberingen af ​​translation [5]. Tidligere undersøgelser har vist, at mange miRNA afvigende udtrykkes i mange former for kræft, og miRNA udtryk profilering har vist visse miRNA at være forbundet med tumor udvikling, progression og respons på behandling. De er derfor gode kandidater til at bruge som diagnostiske, prognostiske og prædiktive biomarkører [6].

Der er udført flere undersøgelser for at søge efter biomarkører ved at identificere den differentielle ekspression af miRNA mellem GC vævsprøver og tilsvarende ikke-tumor gastrisk væv fra den samme patient [7] – [14]. Disse undersøgelser har ført til identifikation af hundredvis af differentielt udtrykte miRNA. Men mange af disse kan forventes at være falske positive, og kun en lille brøkdel kan anvendes som diagnostiske eller prognostiske biomarkører. En logisk tilgang til at skelne vigtige miRNA fra et stort antal af kandidat miRNA lister er at søge efter skæringspunktet mellem miRNA identificeret i flere uafhængige undersøgelser [15]. Selv om denne metode er blevet stigende populær [15], [16], [17], ikke publiceret undersøgelse har identificeret de krydsene med GC-relaterede miRNA baseret på et stort antal miRNA udtryk profilering undersøgelser.

Vi har udført dette systematiske review for at identificere de vigtigste differentielt udtrykte miRNA, der er blevet konsekvent rapporteret i en række uafhængige miRNA udtryk profilering undersøgelser i GC patienter. Desuden har vi yderligere valideret nogle af de miRNA, der var mest op- eller nedreguleret ved hjælp af real-time PCR i 32 par af GC og matches tilstødende ikke-tumor vævsprøver.

Materialer og metoder

etik Statement

undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Shanghai Jiaotong University School of Medicine, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter ved undersøgelsens start.

Søg strategi

Potentielle undersøgelser offentliggjort i engelsk blev indsamlet fra Medline ved hjælp af følgende nøgleord: “miRNA” OR ‘microRNA’ OR ‘miR’, ‘mavens’ OR ‘mave’, ‘profilering’ OR ‘microarray «. Lister over referencer oversigtsartikler og originalartikler blev ransaget manuelt for yderligere publikationer.

Inklusionskriterier for Litteratur

For en undersøgelse, der skal indgå i dette systematiske review, flere kriterier skulle opfyldes : 1) undersøgelser skulle være miRNA profilering studier i GC patienter; 2) undersøgelser måtte bruge GC væv og deres tilsvarende tilstødende ikke-tumorvæv til sammenligning; 3) metoder skulle omfatte miRNA microarray-teknikker. Desuden blev der kun fuldtekst publikationer på engelsk medfølger. Profileringen undersøgelser, der brugte GC cellelinjer eller serumprøver fra GC patienter, dem, der sammenlignet GC biopsier fra tumorer med forskellige stadier af sygdommen, og dem, der brugte forskellige miRNA teknologier blev ikke medtaget. Oversigtsartikler blev heller ikke medtaget i denne systemiske gennemgang.

Data Extraction og Lister over miRNA

differentielt udtrykte miRNA blev identificeret fra hver inkluderet profilering undersøgelse. Relevante oplysninger blev bestemt (dvs. kromosomal placering, pre-miRNA længde, modne miRNA sekvens og potentielle mål for miRNA), og manglende oplysninger blev identificeret fra miRBase databasen (www. Mirbase.org/) og Pubmed.

Ranking

Hver inkluderet profilering undersøgelse [7] – [14] fremlagde en liste over differentielt udtrykte miRNA (tabel S1). Griffith og Chan udtænkt en metode til at rangere potentielle molekylære biomarkører for sammenligningsgrupper [16], [17], som er blevet brugt til miRNA profilering undersøgelser. For eksempel, Ma et al. [15] identificeret krydsene med kolorektale kræftrelaterede miRNA baseret på et stort antal miRNA profilering undersøgelser. Således blev kriterierne for litteraturen medtaget i denne aktuelle systematiske review baseret på dem i deres rapporter [15]. MiRNA blev rangeret til kriterierne i følgende rækkefølge: (i) miRNA konsekvent rapporteret som udtrykkes forskelligt i en konsekvent retning af forandring; (Ii) hyppigheden af ​​miRNA blev rapporteret i microarray undersøgelser (Iii) den samlede stikprøvestørrelse for hver konsekvent rapporteret miRNA.

Validering af miRNA Brug Real Time PCR

For at validere de profilering resultater, 32 friske GC væv og deres parrede ikke-tumor gastrisk væv blev opnået fra Renji Hospital, tilknyttet Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Totalt RNA blev ekstraheret fra 32 par af matchede humane GC prøver (herunder cancer og tilstødende noncancerous væv) under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen). RNA koncentration og renhed blev målt under anvendelse NanoDrop ND-2000 og UV-absorbans målemetode blev anvendt til påvisning af renheden af ​​RNA, kun dem A260 /A280 placeret mellem 1,80-2,00, og A260 /A230 1,7, blev anvendt til den endelige eksperiment, ellers RNA’et skal re- ekstraheret. Revers transkription fra 3 ug RNA blev udført usingAll-i-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit (Genecopoeia, Guangzhou, Kina) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev den fremstillede RNA revers transkriptionsreaktion opløsning inkuberet ved 37 ° C i 60 minutter og termineret ved 85 ° C i 5 minutter, og derefter opbevaret ved -20 ° C til yderligere analyse. Kvantitativ PCR (qPCR) blev udført under anvendelse af en ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA) med SYBR Premix Ex Taq II (Takara). De primere (miR-21-5p, miR-106b-5p, miR-17-5p, miR-18a-5p, miR-20a-5p og miR-378-5p), herunder U6 blev opnået fra Genecopoeia (Guangzhou, Kina) . Kvantificering blev beregnet ved hjælp af to -ΔΔCT metode og præsenteres som normaliseret mønster.

Statistisk analyse

Resultaterne blev analyseret ved hjælp af SAS 9.2 software (SAS Institute Inc. USA). Data er præsenteret som middelværdi ± SD. T-test blev anvendt til at sammenligne værdier mellem to uafhængige grupper.

Resultater

Litteratur Valg og Undersøgelse Kendetegn

I alt 104 undersøgelser blev søgt i Pubmed bruge vores søgning strategi, 73, som er udelukket efter screening titler og abstracts. 23 studier blev udelukket efter at have læst hele teksten. Kun otte studier blev endeligt inkluderet i dette systematiske review. Den detaljerede valg Undersøgelsen blev vist i figur 1. De nærmere karakteristika for hver undersøgelse er angivet i tabel 1.

differentielt udtrykte miRNA

I alt 223 differentielt udtrykte miRNA blev rapporteret i de otte microarray undersøgelser (differentielt udtrykte miRNA i hver undersøgelse blev beskrevet i tabel S1); 124 blev opreguleret i GC, og 99 blev nedreguleret. Blandt de 223 differentielt udtrykte miRNA, 48 blev rapporteret hos mindst to undersøgelser; 39 (81,3%) havde en konsekvent retning og ni (18,7%) havde en inkonsekvent retning af ændret udtryk. Blandt førstnævnte 39, 20 blev opreguleret i GC, og 19 blev nedreguleret. Tre af disse miRNA blev rapporteret i fem microarray studier (MIR-21, miR-106B og miR-378), fire blev rapporteret i fire undersøgelser (MIR-17, miR-18a, miR-20a og miR-638), og syv blev rapporteret i tre studier (miR-19a, miR-20b, miR-25, miR-30d, miR-923, mir-375, og miR-148a). Deres kromosomale steder, pre-miRNA længder, modne sekvenser og de potentielle mål er anført i tabel 2-4. Vejviser

Validering af udvalgte miRNA i GC Patienter

for at validere udtryk for de seks mest konsekvent rapporterede miRNA (MIR-21, miR-106b, MIR-17, miR-18a, miR-20a og MIR-378), udtryk for disse miRNA i GC biopsier og tilstødende noncancerous væv blev sammenlignet i 32 tilfælde af GC under anvendelse af real-time PCR. De rå Ct-værdier for de seks miRNA blev vist i tabel S2.The Resultaterne viste, at MIR-378 blev nedreguleret i GC væv, mens de øvrige fem miRNA (MIR-21, MIR-106b, mir-17, MIR-18a og MIR -20a) blev opreguleret i GC (Figur 2). Vores resultater var i overensstemmelse med de af de oprindelige profilering undersøgelser. Endvidere har vi undersøgt forholdet mellem ekspressionen af ​​disse miRNA med de kliniske og patologiske træk ved GC. Vi fandt, at ekspressionen af ​​MIR-21 var signifikant højere i tilfælde af GC tilfælde med større tumorstørrelser (≥8 cm), dårlig differentiering og metastase med lymfekirtelinvolvering og senere stadium sygdom. MIR-106b, MIR-17 og MIR-18a niveauer signifikant højere i dårligt differentieret GC, tilfælde med lymfekirtelinvolvering eller sene stadium sygdom, mens MIR-20a niveauer signifikant højere i tilfælde af GC med lymfekirtelinvolvering. Der blev imidlertid ingen sammenhæng fundet mellem ekspressionen af ​​MIR-378 og de klinisk-patologiske træk ved GC. Disse resultater er beskrevet i tabel 5.

Brug U6 som en normalisering kontrol, ekspressionen af ​​MIR-21, MIR-106b, MIR-17, MIR-18a og MIR-20a var signifikant højere i GC væv, mens ekspressionen af ​​miR-378 var betydeligt lavere.

diskussion

miRNA microarray undersøgelser giver mængder af information, men en fælles ulempe er manglen på sammenhæng mellem forskellige undersøgelser . Ifølge rapporterne fra Griffith et al. og Chan et al. [16], [17], en logisk løsning på dette problem ville være at bestemme sammenhængen mellem forskellige studier brugt forskellige microarray platforme. Flere systematiske [15] – [17] har brugt denne metode til at bestemme differentielt udtrykte gener eller miRNA i forskellige sygdomstilstande. Anvendelse af en lignende metode, vi observeret, at i alt 48 differentielt udtrykte miRNA blev rapporteret i mindst to uafhængige undersøgelser blandt otte GC miRNA profilering undersøgelser [7] – [14]. Blandt disse blev der rapporteret 39 miRNA, der skal ændres i en ensartet retning, mens resultaterne for ni var inkonsekvent. Blandt de 39 miRNA, der havde vedvarende ændringer blev 20 miRNA konsekvent opreguleret i GC sammenlignet med noncancerous gastrisk væv, og 19 blev konsekvent nedreguleret i GC. Vi identificerede de fem miRNA, der blev mest konsekvent opreguleres (MIR-21, MIR-106a, mir-17, MIR-18a og MIR-20a) og to mest konsekvent nedreguleret (MIR-378 og MIR-638) i mindst fire profilering undersøgelser. Så vi valideret disse resultater ved hjælp af real-time PCR, hvilket yderligere understøttet af resultaterne af dette systematiske review. Vi bestemt også, at ekspressionen af ​​disse miRNA korreleret med de klinisk-patologiske træk af GC, som foreslået, at disse miRNA kan være nyttige som biomarkører for GC.

En af de mest konsekvent rapporterede opreguleret miRNA i vores systematiske gennemgang var miR -21, som har ændret udtryk og onkogen aktivitet i forskellige menneskelige kræftformer. Cui et al. [18] viste, at ekspressionen af ​​MIR-21 var signifikant højere i GC væv sammenlignet med tilstødende normalt væv. Ekspressionen af ​​MIR-21 har også vist sig at være højere hos patienter med GC med lymfeknudemetastaser end dem uden, og er også signifikant korreleret med den histologiske tumortype og pTNM fase [19], som blev godkendt af vores undersøgelse. Endvidere højere ekspressionsniveauer af MIR-21 forudsagde ringe overlevelse hos patienter med GC [19]. Andre undersøgelser har vist, at miR-21 kan fremme tumor spredning og invasion i GC ved at undertrykke ekspressionen af ​​PTEN eller PDCD4 [20], [21]. Derudover har tidligere undersøgelser også afsløret onkogen aktivitet af miR-21 i kolorektal cancer [22], brystkræft [23] og kræft i spiserøret [24].

MIR-106b blev også konsekvent rapporteret som en opreguleres miRNA i GC væv af denne og tidligere undersøgelser [14], [25]. Den høje ekspression af MIR-106b har tidligere været forbundet med lymfeknudemetastaser [25], [26], og dette blev valideret i vores undersøgelse. Kim et al. [27] fandt, at miR-106b kan udøve sin onkogene aktivitet ved at undertrykke p21-ekspression i GC. MIR-106b kunne inducere epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) og en tumorfremkaldende cellefænotype i brystcancer ved at målrette Smad7 og Six1 og aktivering TGF-β signalering [28]. Det kan også fremme celleproliferation i humane hepatocellulært carcinom ved nedregulering af ekspressionen af ​​APC [29].

MIR-17 har kendt onkogen aktivitet i mennesker, og blev fundet at være opreguleret i 77,2% af vævsprøver af GC sammenlignet med tilstødende normal gastrisk væv. Det fremmer cellecyklusprogression og inhiberer apoptose i GC ved at målrette p21 og p53INP1 (tumor protein p53-induceret kerneprotein 1) [30]. Cirkulerende niveauer af MIR-17 er forhøjet i GC patienter, og koncentrationen af ​​MIR-17 er signifikant associeret med TNM stadie og grad af GC [31]. vores undersøgelse viste imidlertid, at ekspressionen af ​​miR-17a var højere i tilfælde af GC uden lymfeknude metastaser end dem med lymfeknude involvering, der kan have været en følge af den lille prøvestørrelse i vores undersøgelse. Den høje ekspression af MIR-17 er signifikant korreleret med dårlige overlevelse resultater [31]. Tidligere undersøgelser har også fundet, at MIR-17 har onkogen aktivitet i colorektal cancer [32], brystcancer [33] og pancreascancer [34].

MIR-18a blev fundet at være opreguleret i fire undersøgelser på dette systematisk gennemgang, og er kendt for at have onkogen aktivitet i mennesker. Wu et al. [35] viste, at ekspressionen af ​​MIR-18a blev signifikant opreguleret i GC væv sammenlignet med normalt gastrisk væv, og kunne direkte målrette PIAS3 (protein inhibitor af aktiveret signal transducer og aktivator af transkription 3) og blev positivt korreleret med niveauerne af Survivin, Bd-XL og c-myc. Desuden har opregulering af MIR-18a blevet rapporteret i nasopharyngeal carcinom [36], pancreascancer [37], hepatocellulært carcinom [38] og brystkræft [39].

Mir-20a er en anden miRNA med oncogen aktivitet, og viste sig at være opreguleret i fire undersøgelser af denne litteratur. Det er blevet påvist, at det cirkulerende niveau af MIR-20a signifikant forhøjet i GC patienter sammenlignet med raske kontroller, og dette er signifikant associeret med scenen og karakteren af ​​tumor [31], [40]. Vores undersøgelse viste også, at miR-20a var signifikant forhøjet i GC væv og var signifikant associeret med lymfeknude metastaser. Desuden har opregulering af MIR-20a tidligere blevet fundet i livmoderhalskræft, prostatacancer og ovariecancer, og dette miRNA kunne fremme celleproliferation eller invasion af disse cancere [41] – [43].

mest konsekvent nedreguleret miRNA i dette systematiske review var miR-378, som viste sig at være nedreguleret i fem undersøgelser. MIR-378 er blevet påvist at have anti-onkogen aktivitet i mennesker [44]. Den exogene ekspression af MIR-378 markant undertrykker proliferation af GC-celler ved at undertrykke CDK6 og VEGF signalering [44]. I vores undersøgelse, selvom vi fundet, at ekspressionen af ​​MIR-378 blev nedreguleret i GC væv, blev ingen sammenhæng fundet mellem ekspressionen af ​​MIR-378 og de klinisk-patologiske træk ved GC. Dette kan have været på grund af den lille stikprøvestørrelse på denne undersøgelse. Det er også rapporteret, at MIR-378 er betydeligt nedreguleret i colorektal cancer, og kan spille en vigtig tumor suppressor rolle i denne cancer [45]. Men andre undersøgelser har fundet, at MIR-378 kan have onkogen aktivitet i andre typer cancer [46] – [49]. Derfor brug den nøjagtige rolle miR-378 i carcinogenese, at blive yderligere belyst.

Desuden fandt vi, også, at nogle af kandidatlandene miRNA identificeret i vores undersøgelse slso blev identificeret som serum biomarkører i forskellige kræftformer. For eksempel blev serum MIR-21 signifikant forhøjet i perioperativ serum fra adenomer og kolorektal cancer (CRC), og var en uafhængig prognostisk markør for CRC [50], [51]; Plasma MIR-106b, sammen med MIR-20a og MIR-221 har potentiale som nye biomarkører for tidlig påvisning af gastrisk cancer [40]; Cirkulerende MIR-17 kan anvendes som et hidtil ukendt noninvasive biomarkør for nasopharyngeal carcinoma [52], gastrisk cancer [53] og CRC [54]; Serum MIR-18a kan anvendes som en ny biomarkør i brystcancer [55], colorectal cancer [56], hepatocellulært carcinom [57], og pancreascancer [58]; Cirkulerende MIR-378 kan anvendes som en biomarkør i renalcellecarcinom [59] og gastrisk cancer [60]. Disse undersøgelser bekræftede endvidere betydningen af ​​de identificerede miRNA, og kan udvide anvendelsen omfanget af disse miRNA.

Som konklusion, vores systemiske gennemgang identificeret fem opreguleret miRNA (MIR-21, miR-106b, MIR-17, mIR-18a og mIR-20a) og en nedreguleret miRNA (mIR-378), der er potentielle hidtil ukendte biomarkører for GC. Disse miRNA har vist sig at have diagnostisk og /eller prognostisk potentiale for denne kræftform og garanterer yderligere undersøgelse. Yderligere undersøgelser, der fokuserer på disse miRNA vil hjælpe med til at bestemme et panel af diagnostiske og prognostiske GC biomarkører med passende niveauer af følsomhed og specificitet.

Støtte oplysninger

tabel S1.

differentielt udtrykte miRNA identificeret i hver omfattede undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0073683.s001

(XLS)

tabel S2.

Raw Ct værdien af ​​de udvalgte miRNA

doi:. 10,1371 /journal.pone.0073683.s002

(XLS)

tabel S3.

PRISMA Tjekliste

doi:. 10,1371 /journal.pone.0073683.s003

(DOC)

Tak

Vi takker Miss Wei-Feng Qu for hendes fremragende redaktionelle arbejde.