PLoS ONE: Høj DNA Methylering Mønster intratumoral Mangfoldighed Indebærer Svag Selection i mange menneskelige Colorectal Cancers

Abstrakt

Baggrund

Det er muligt at udlede fortiden af ​​befolkninger ved at sammenligne genomer mellem individer. Generelt ældre populationer har mere genomisk mangfoldighed end yngre populationer. Den kraft af udvælgelsen kan også udledes befolkning mangfoldighed. Hvis udvælgelsen er stærk og ofte eliminerer mindre fit varianter, vil mangfoldigheden være begrænset, fordi nye, oprindeligt homogene populationer konstant dukke op.

Metode og Resultater

Her er vi oversætte en populationsgenetik tilgang til menneskelig somatiske kræft cellepopulationer ved at måle genomisk mangfoldighed inden for og mellem små colorectal cancer (CRC) kirtler. Kontrol vævskultur og xenograft eksperimenter viser, at populationsdiversitet af visse passager DNA mønstre for methylering er reduceret efter kloning men efterfølgende stiger med tiden. Målt i CRC kirtel populationer, passager methylering mangfoldighed fra forskellige dele af ni CRCs var relativt højt og ensartet, konsistent med ældre, stabile afstamninger snarere end blandinger af yngre homogene populationer skyldes hyppige cyklusser af udvælgelse. Mangfoldigheden af ​​seks metastaser var også høj, hvilket tyder på formidling tidligt efter transformation. Mangfoldighed var lavere i DNA mismatch reparation mangelfuld CRC kirtler, muligvis tyder flere valg og afskaffelse af mindre fit varianter når mutationsrater er forhøjet.

Konklusion /Betydning

varianter observeret De mange blaffe passager i primære og metastatiske CRC cellepopulationer er i overensstemmelse med relativt gamle befolkninger, hvilket tyder på, at klonal evolution fører til selektive fejer kan være sjældne efter transformation. Selektion i humane cancere synes at være en svagere end antaget kraft efter transformation i overensstemmelse med den observerede sjældenhed af førerens mutationer i cancer genomer. Fænotypisk plasticitet snarere end den trinvise overtagelse af nye driver mutationer kan bedre hensyn til de mange forskellige fænotyper indenfor humane tumorer

Henvisning:. Siegmund KD, Merian P, Tavare S, Shibata D (2011) High DNA methyleringsmønster intratumoral mangfoldighed Indebærer Svag Selection i mange menneskelige tarmkræft. PLoS ONE 6 (6): e21657. doi: 10,1371 /journal.pone.0021657

Redaktør: Chris T. L. Chan, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: December 14, 2010; Accepteret: 6 Juni 2011; Udgivet: 28 juni 2011

Copyright: © 2011 Siegmund et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R33 CA111940 og R21 CA149990). ST understøttes delvist af en bevilling fra CRUK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

en barriere for en bedre forståelse af human cancer er den manglende evne til direkte iagttage, hvordan kræft udvikler sig. Progression er klinisk vigtig, med lokaliserede kræftformer lettere behandlet end dybt invasive eller metastaserende kræft. En logisk formodning er, at progression sker trinvis efter transformation (figur 1) med den sekventielle udvælgelse af nye driver mutationer og mere maligne fænotyper ved klonal evolution [1] som tumorceller støder og derefter kolonisere nye mikromiljøer. Men en nylig kræft genomsekvensering undersøgelse [2] illustreret, at metastaser har relativt få yderligere mutationer i forhold til deres primære tarmkræft (CRCs). Omkring 97% af de mutationer i metastaser blev også påvist i deres primære tumorer, og de få yderligere mutationer ikke har åbenlyse metastatiske roller.

Trinvis udvælgelse og klonal evolution skaber populationer af forskellige forskelle og fænotyper, fordi de er skabt på forskellige tidspunkter fra forskellige stamfædre efter transformation. Derimod mangfoldigheden af ​​en enkelt klonal ekspansion er relativt ensartet.

Alternativt, evnen til at invadere eller metastaserer kan allerede være til stede på tidspunktet for omdannelsen [3], der giver mulighed for progression uden yderligere klonal evolution (figur 1). Fænotypiske forskelle mellem tumorceller ville opstå sekundært til fænotypisk plasticitet [4], [5] i stedet for køb af nye driver mutationer. En afgørende forskel mellem disse modeller er effektiviteten af ​​udvælgelse kan arbejde med varierende celler, der uundgåeligt akkumuleres med tiden. Udvælgelse afhænger variation, men udvalg kan ikke let at skelne mellem kræftceller, fordi de fleste mutationer synes at være neutrale passager mutationer [6], [7]. Selvom positiv eller negativ selektion er vanskelige at kvantificere, er der en lang tradition for at bruge variationen ved neutral eller blaffe passager loci inden for en population til at måle den kraft af udvælgelsen, som modsætter glider ved at fjerne mindre fit varianter [8]. Fordi neutrale ændringer passager er mere almindelige end driver ændringer [6], [7], mange passager ændringer kan ophobes i tumorer i mellem selektive sweeps.

Tumor heterogenitet målinger er kompliceret, fordi mange mekanismer kan bidrage til mangfoldighed [4 ]. Måling af mangfoldighed i en stor tumor population er problematisk, fordi hvis udvælgelse er stærk, kan vælges mange forskellige varianter, hver optimale for overlevelse inden for de mange forskellige mikromiljøer af en tumor. For at minimere miljømæssige heterogenitet og fordi den mest umiddelbare kamp for overlevelse sker mellem nærliggende celler, en følsom test til selektion er den mængde variation blandt små grupper af tilstødende celler i en enkelt mikromiljø, især da fiksering er hurtigere i mindre populationer [9]. Selvom afkom af en enkelt valgte celle ikke kan feje bredt, på et udvalg minimum bør være i stand til at homogenisere sin nabolag og mikromiljø øjeblikkelig. Omfattende heterogenitet mellem tilstødende kræftceller vil foreslå valg ikke ofte optimere fitness selv inden små bestande.

tyktarms adenokarcinomer har neoplastiske kirtler, partition tumorceller i forskellige små kvarterer. Omfanget af blaffe mangfoldighed inden for og mellem kirtler afhænger af tidspunktet for den sidste klonal ekspansion eller selektiv sweep (figur 2). En udvalgt variant celle og dens afkom i første omgang dominere sin kirtel og kunne efterfølgende danner yderligere tilstødende kirtler, hvilket skaber et knudepunkt befolkning med relativt ensartet mangfoldighed. På sit yderste, kan en hel tumor skabes ved en enkelt klonal ekspansion. Her måler vi kræft genom passager DNA methylering mønster variation inden for små (2.000 til 10.000 celle) kirtel fragmenter fra forskellige dele af de samme menneskelige CRC’er og udlede klonale evolutionære flaskehalse opstår sjældent efter transformation.

En mandlig kræft celle indeholder en enkelt mønster methylering på et CpG rig region af X-kromosomet. methylering mønster Passageren vil glide og blaffe med skæbne sin celle. Efter klonal ekspansion, vil kræftcellen befolkning være oprindeligt homogene men variant celler (forskellige farver) og passager methylering mønstre vil opstå fra afdrift (replikation fejl). En forskelligartet befolkning har tre skæbner. Hvis der opstår ingen markering, vil en befolkning fortsat drive og blive mere forskelligartet. Stærk positiv selektion af en variant (blå) celle resulterer i en sweep eller klonal evolution, med homogenisering af befolkningen og blaffe passager methylering. Svag negativ eller baggrund selektion fører til tab af en variant celle (blå) og en reduktion i den mangfoldighed af hitchhiking mønstre for methylering. Derfor kan styrken af ​​udvælgelsen udledes ved at måle de passwords for hitchhiking passager methylering mønstre inden for en population.

Resultater

Afsløring Valg og Klonal Evolution i en eksperimentel System

Fordi somatiske mutationer relativt sjældne i humane CRCs ( 1 pr 100.000 baser [6], [10]), vi har anvendt 5 ’til 3′ rækkefølge passager DNA-methylering med korte CpG rige regioner som epigenetisk somatisk celle molekylære ure [11]. 5 ’til 3′ rækkefølge methylering anvendes (som 5 ’til 3′ rækkefølge basesekvenser) til måling genomisk variation, som bør tommelfingeren med skæbner deres celler (Fig 2). Passager mønstre for methylering bør i begyndelsen være homogene og efterfølgende blevet stadig polymorfe efter en klonal evolution flaskehals. I de første eksperimenter, vi kontrollere, at disse passager methylering mønstre eller tags kan optage en enkel klonal evolution cyklus: polyklonale befolkning → monoklonalt befolkning → polyklonale befolkning. Denne flaskehals (figur 2) kan simuleres ved kloning og derefter udvide enkelte celler i vævskultur og efterfølgende som subkutane xenotransplantater i nøgne mus (fig 3A). X-kromosom tags (BGN og LOC, tag sekvenser og prøve data leveres i Fig S1) og en mandlig diploid CRC cellelinje (Lovo) blev undersøgt (en enkelt epiallele per celle). Den LOC tag synes at have en højere replikering fejlrate end BGN tag [12], og derfor bør blive polymorfe hurtigere. Epialleles blev udskilt af bisulfit sekventering klonede PCR-produkter af DNA ekstraheret fra kulturerne eller små xenograft fragmenter (5 til 6 fragmenter pr xenograft, ~2,000 til 10.000 celler pr fragment). Mangfoldighed måles ved en parvis afstand (PWD).

A. Skematisk af Lovo enkelt celle kloning, først i kultur og derefter som xenotransplantater, simulerer en klonal evolution flaskehals. B. Blaffer mangfoldighed falder, og derefter stiger i kultur og xenotransplantaterne efter enkelt celle kloning. (X’er repræsenterer uafhængige enkelt celle kloner i kultur, og O repræsenterer PWD gennemsnit blandt tags isoleret fra 5 til 6 små xenograft fragmenter) Den LOC tag har en højere fejlprocent i forhold til BGN tag [12], og hurtigere genskaber mangfoldighed set i polyklonale populationer. C. Sammenligninger mellem fragmenter demonstrere intergland passwords er mindre mellem klonbeslægtede tumorer og større mellem uafhængige tumorer, hvilket indikerer evne LOC eller BGN tags til at identificere og skelne mellem nye og ældre klonede udvidelser (cirkler er gennemsnit af fragmentet sammenligninger mellem forskellige xenografter, og barer er samlede gennemsnit) D. xenograft intragland passwords er typisk næsten lige så stor som deres intergland passwords, hvilket indikerer, at de små tumor fragmenter er næsten lige så forskellige som deres tumorer.

polyklonale kultur og små fragmenter af sine xenotransplantater var forskellige befolkningsgrupper, med mange forskellige tag mønstre og relativt høje passwords (Fig 3). Efter enkelt celle kloning, tag mangfoldighed faldt, men steg derefter. Denne reduktion og efterfølgende stigning i tag mangfoldighed efter enkelt celle kloning var ikke strengt ur-lignende, fordi nogle yngre kloner var mere forskelligartet end nogle ældre kloner (Fig 3B). Men ændringer tag mønster generelt registreret den eksperimentelle klonal evolution scenario med en enkelt celle flaskehals efterfulgt af klonal ekspansion og en stigning i passwords.

Afsløring Trinvis Progression i et eksperimentelt System

Ovenstående undersøgelser målte mangfoldighed i enkelte tumor kirtel fragmenter. En anden metode til at måle mangfoldighed er at sammenligne epialleles fra forskellige dele af den samme tumor. Her passwords mellem celler sammenlignes med fysiske afstande mellem celler at spørge, om tilstødende celler er mere relateret end fjernere celler. Med en enkelt hurtig klonal ekspansion (en stjerne fylogeni), er fjerne celler næsten relateret som tilstødende celler, fordi dens forskellige dele er i det væsentlige oprettet på samme tid. Derfor vil passwords være uafhængige af fysisk afstand eller placering. Hvis derimod tumorer er skabt af trinvis udvælgelse og klonal evolution, passwords afhænger den fysiske placering af cellerne. Ældre regioner bør være mere forskelligartet end yngre regioner, og passwords skal stige, når der foretages sammenligninger mellem yngre og ældre tumor regioner (figur 1).

implanteret simulere disse forskellige progression scenarier. En enkelt nyere klonal ekspansion er repræsenteret ved xenografter iværksat fra den samme enkelt celle stamfader. Trinvis klonal evolution er repræsenteret ved sammenligninger mellem polyklonale og klonede implanteret. Intergland passwords var lavere i de klonale xenotransplantater, større i de polyklonale xenotransplantater, og større mellem de klonede xenotransplantater og deres forældre polyklonale xenotransplantater eller andre uafhængige klonal xenograft (Fig 3C). Disse eksperimenter viser, at passager methylering tags kan skelne en enkelt klonal ekspansion fra tumorer består af forskellige alderen populationer.

Mangel på flaskehalse Under xenograft Formation

De kloning eksperimenter er potentielt kompliceret af usete flaskehalse forårsaget af naturlig udvælgelse (figur 2). Den “polyklonale” karakter af Lovo cellelinien i vævskultur før enkelt celle kloning er ikke uventet, fordi dette er en lang etableret cellelinie [13], og formentlig afkom er ligeledes egnet. Der kan dog opstå flaskehalse under xenograft dannelse fordi kun nogle celler inden en vævskultur tilpasset cellelinie kan trives i en nøgen mus mikromiljø. Faktisk kan xenotransplantat vækst ikke være synlig, når mindst en million celler inokuleres, et fænomen ofte anvendes til at måle frekvenser af “cancer initierende celler”, som kan repræsentere cancer stamceller (CSCS) [14]. Flaskehalse kan også opstå, hvis forskellige mikromiljøer stødt under væksten effektivt vælge kun de stærkeste varianter, at give lokaliserede klonal evolution.

Hvis der opstår betydelige flaskehalse under tumorigenese, xenograft forskelligheder vil være tilsvarende begrænset, om den indledende inokulér var klonale eller polyklonale . BGN tag mangfoldighed var betydelig mindre, når xenografter blev indledt med de enkelte celle kloner sammenlignet med et polyklonalt inokulér (gennemsnit intragland passwords på 1,2 versus 2,1, p = 0,007), hvilket indikerer, at selektive flaskehalse ikke opstår med Lovo cellelinje under xenograft tumorigenesis ( fig 3B). LOC tag mangfoldighed var ens mellem klonale og polyklonale xenograft fragmenter (gennemsnit intragland passwords på 2,5 versus 2,4, p = 0,86), men LOC tag synes at have en højere replikering fejlprocent end BGN [12]. Derfor lighederne i LOC tag mangfoldighed synes at skyldes en hurtigere LOC tag diversificering med de enkelte celle kloner frem tumorigenese flaskehalse.

En anden måde at opdage lokaliseret valg er at sammenligne mangfoldigheden inden kirtler med mangfoldigheden mellem kirtler. I mangel af udvælgelsen, bør ældre mere forskelligartede tumorer har ældre mere forskelligartede kirtler. Hvis udvælgelsen sker inden kirtler, er forskellighed reduceres variant celler elimineres (figur 2), og intragland passwords bør være meget mindre end intergland passwords. I overensstemmelse med en mangel på udvælgelse, intragland passwords var næsten lige så stor som intergland passwords for de klonale og polyklonale xenografter (Fig 3D).

Deeper Sampling bekræfter High Passenger Tag Diversity

I de ovennævnte undersøgelser , blev udtaget kun otte tags per prøve. For at bekræfte mangfoldigheden i de små fragmenter blev 24 tags samplet (Fig 4A). Yderligere nye tag mønstre blev påvist med yderligere prøveudtagning, selv om passwords var relativt stabil efter prøveudtagning kun otte tags. Gennemsnitlig mangfoldighed var højere i polyklonale versus klonale xenografter, med gennemsnit på 10,8 BGN og 17.2 LOC unikke mønstre pr 24 tags stikprøven i de polyklonale xenotransplantater. Væsentlig tag variation er til stede i små 2.000 til 10.000 celle tumorfragmenter, hvilket yderligere antyder, at udvælgelse fører til klonal evolution sjældent forekommer under xenograft dannelse med Lovo cellelinien i en nøgen mus miljø.

A. Mere unikke epiallele mønstre er observeret inden polyklonale kulturer og de små xenograft fragmenter, når prøvetagning øges til 24 tags. PWD værdier er relativt stabile efter 8 tags stikprøven (for reference, de stiplede røde linjer er de polyklonale cellelinie værdier). B. Dybere sampling af kirtler fra fem menneskelige CRCs. De tre cancere til venstre er relativt yngre cancere med diversitet svarende til klonale xenotransplantater. De to kræftformer til højre er relativt ældre cancere med diversitet svarende til det polyklonale cellelinje eller xenotransplantater. I overensstemmelse med en enkelt klonal ekspansion, mangfoldighed er ens mellem højre og venstre dele af samme CRC.

Høj Mangfoldighed i Single Menneskelig Kolorektal Cancer Kirtler

En forudgående undersøgelse udledes, at små menneske CRC kirtler er forskellige befolkningsgrupper [12], men samplet kun otte tags pr kirtel. For at bekræfte, at menneskelig CRC kirtel mangfoldighed kan være høj og tillade sammenligninger med xenotransplantaterne blev 24 tags udtaget fra 2.000 til 10.000 celle kirtel fragmenter fra fem CRCs. De kirtler blev udtaget fra modsatte sider ( “venstre” og “højre”) i samme tumor, for at tillade sammenligninger af celler beliggende inden kirtler og mellem kirtler fra modsatte tumor sider.

Menneskelig CRC kirtel forskelligheder var høje ( mellem 3 til 23 unikke mønstre pr 24 epialleles stikprøven) at naboceller er ikke nært beslægtede (fig 4B). For tre mindre forskelligartede ( “yngre”) kræft (Kræft A, B, C), kirtel passwords og antal unikke tags pr 24 tags stikprøven svarede til værdierne i de klonede xenotransplantater. For to mere forskelligartede ( “ældre”) kræft (kræft D, E), kirtel passwords og antallet af unikke tags svarede til værdierne i polyklonale xenograft. I overensstemmelse med en enkelt klonal ekspansion, forskelligheder var ens mellem venstre og højre tumor sider, hvilket indikerer, at begge tumor sider er tilbøjelige til at have lignende mitotiske aldre eller antallet af divisioner siden transformation [12].

Lower Gland Mangfoldighed Med Højere mutation priser

lav kræft kirtel mangfoldighed ikke direkte afspejler valg, fordi selv uden selektion en ny klonal ekspansion ville i første omgang være homogen. For at korrigere for tumor alder, som en grov tilnærmelse, alder af en tumor er den tid eller numrene på splittelse mellem celler fra modsatte tumor sider, fordi disse celler sidste delte en fælles forfader omkring tidspunktet for transformation [12], [15] . Derfor kan man sammenligne kirtel alder med tumor alder ved at sammenligne intragland passwords med passwords mellem kirtler fra modsatte kræft sider (figur 5A). Generelt ældre tumorer havde ældre kirtler, med intragland passwords korreleret med intergland passwords.

A. Intra- og intergland passwords generelt korrelerer. Tendensen linje er baseret på tre menneskelige CRC’er, med de to MFR mangelfulde kræftformer med meget lavere intragland passwords. (Cirkler er humane CRCs, trekanter er de klonale og polyklonale xenotransplantater). B. Forhold på intra- at intergland passwords var større end 0,5 bortset fra MMR mangelfuld CRC’er, hvilket indikerer meget større udslettelse inden kirtler af MMR mangelfulde CRC’er.

Hvis udvælgelsen afhænger af mutationer, en simpel forudsigelse er, at udvælgelsen skal ske oftere, når mutationsrater er forhøjet. To af de fem CRCs (Cancers B, C) var mangelfuld i DNA mismatch repair (MMR), som er forbundet med 100- til 1000 gange højere mutationsrater [16]. Kirtel passwords i MMR-deficiente CRCs var lavere (intragland at intergland passwords mindre end 50%) i forhold til MMR dygtige CRCs (Fig 5B). Den lavere intragland at intergland PWD nøgletal i MMR mangelfuld CRC’er foreslår udvalg kan mere effektivt eliminere mindre fit varianter når mutation er højere. Den intragland at intergland PWD nøgletal for de tre MFR dygtige CRC’er og LoVo xenotransplantater var ens (større end 50%), hvilket tyder på udvælgelse sker sjældnere i disse tumorer.

Cancer Stamceller synes at være Hyppig i Human CRCs

En kvantitativ måde at beskrive valg er at estimere antallet af langlivede slægter pr kræft kirtel, som er effektivt CSCS [12]. Hvis udvælgelsen eller udslettelse ofte opstår, vil derefter langlivede CSC slægter være få. Antallet af CSCS pr kræft kirtel kan estimeres ud fra sin mangfoldighed — genomer inden for en kirtel vil være mere ens med mindre antal CSCS fordi somatiske ændringer ikke kan samle sig i kortere levede ikke-CSCS der hurtigt uddø.

En tidligere analyse af data med otte tags pr kirtel anslået relativt høje CSC frekvenser [12]. Med 24 mærker pr kirtel, bedre estimater af CSC frekvenser er mulige (tabel 1). Kræft kirtel mangfoldighed var for høj for en enkelt CSC pr kirtel og for lav for et scenarie, hvor ingen udslettelse sker. I stedet cancer kirtel variation var mere konsistent med begrænset cancercelle udryddelse, der kan modelleres som en stamcelle hierarki med flere CSCS pr kirtel producerer et begrænset antal ikke-CSC afkom. Probabilistic CSC overlevelse i stedet for deterministisk asymmetrisk CSC division var mere i overensstemmelse med dataene. Anslået antal probabilistiske CSCS pr 8000 celle kirtel var mellem 128 og 2048. De laveste estimerede CSC frekvenser pr kirtel (128 og 256 pr kirtel) var med de to MFR mangelfulde Kræft B og C, en tendens, tidligere bemærket, når man sammenligner mellem MFR dygtige og mangelfulde CRC’er [12]. Sammenfattende synes kræftcelle udslettelse at have fundet sted i alle CRC’er, men mere udførligt i MMR mangelfulde CRC kirtler.

Klonal Evolution I Humane tumorer i

EDTA kirtel isolation metode kan skævhed prøvetagning til overfladiske tumor regioner, som kan være den ældste del af en tumor, der udvikler via klonal evolution (figur 1). Laser capture mikroskopi (LCM) kan prøve flere overfladiske, invasive og metastatiske portioner af samme CRC (Fig 6A). Kun BGN tag blev anvendt til analyse, fordi dens lavere tilsyneladende fejlprocent letter påvisning af nyere klonal evolution. Den nedbrudte DNA i de faste prøver og små antal genomer stikprøven af ​​LCM hindrer karakterisering af intragland PWD, men det er muligt at sammenligne intergland passwords for at søge efter fokale områder af homogenitet skabt af seneste klonal evolution. I overensstemmelse med evnen til at måle tumor mangfoldighed med LCM, intergland passwords var ens for kræft A-E hvorvidt beregnet ud fra LCM eller EDTA kirtel data (Fig S2).

A. Diagram over LCM prøveudtagning af kræft A og D. Dots er placeringer af overfladiske (blue), invasive (sort) og metastatiske (rød) regioner. (Bar er 1 cm bred). B. Sammenligning af intergland passwords i den overfladiske (blå), invasive (sort) og metastatisk (rød) regioner af de ni CRCs. Passwords mellem individuelle LCM prøver ( “X”) er spredt, med gennemsnit repræsenteret ved søjler. Scatter af passwords mellem de enkelte kirtler forventes på grund af den stokastiske natur af replikation fejl og regioner inden for samme tumor, der var signifikant forskellige (pile) fra deres overfladiske områder blev identificeret fra simuleringer (se metoder). For reference, er intergland passwords fra klonede (punkteret grøn linje) og polyklonale xenografter (solid grøn linje) illustreret. C. Sammenligninger af intergland passwords med fysiske afstande viser, at fjerne og tilstødende kirtler tilsvarende er relateret i den overfladiske (blå), invasive (sort) og metastatisk (rød) regioner. En betydelig stigning i passwords med fysiske afstand (p 0,05) blev observeret kun for de overfladiske områder af kræft B og D.

Med sekventiel trinvis progression, der bør være en mangfoldighed gradient (overfladisk invasiv metastaser), mens alle regioner bør være tilsvarende forskelligartet, hvis en tumor er hovedsageligt et enkelt klonal ekspansion. Ni CRC’er blev undersøgt (Fig 6B). Mangfoldighed var generelt høj, og ingen syntes at være nyligt klonal ekspansion, fordi de alle havde gennemsnitlige intergland passwords større end de klonede xenotransplantater.

Intergland passwords var ens mellem overfladiske og invasive portioner af tre fase II kræftformer (B, C , E). For to af de seks metastatiske kræftformer (D og F), overfladiske, invasive og metastatiske regioner blev ligeledes forskellige, herunder tre forskellige lymfeknudemetastaser af kræft F. betydelige forskelle mangfoldighed var til stede mellem fire primære kræft og deres metastaser. Både invasive og metastatiske regioner af kræft H og I var signifikant mindre forskelligartet end deres overfladiske regioner cancer. For Cancer G, kun den metastatiske læsion var signifikant mindre forskelligartet. Den metastaser af kræft A var betydeligt mere forskelligartet end sit primære.

For at søge efter regional klonal evolution, intergland passwords blev sammenlignet med fysiske afstande (Fig 6C). De overfladiske, invasive og metastatiske regioner i syv kræftformer syntes at være enkelt klon-udvidelser, fordi der ikke var nogen væsentlige ændringer i passwords med fysiske afstande. De overfladiske områder af cancere B og D viste en betydelig stigning i passwords med fysiske afstande, hvilket tyder tilstødende tumor områder var mere beslægtet end fjerntliggende områder. Sammenfattende kan mangfoldigheden af ​​forskellige dele af samme kræft ikke forudsiges, hvor eksempler på metastatiske regioner med intergland passwords, der var den samme, større eller mindre end deres overfladiske regioner. Men beviser for nylig trinvis progression manglede fordi alle regioner var relativt forskelligartede (gennemsnit passwords større end de klonede xenotransplantater) og fokal regional homogenitet var normalt ikke påvises.

Diskussion

Tumorceller støder og kolonisere mange forskellige mikromiljøer under tumorigenese, og konceptuelt udvalg effektivt maksimerer egnethed til at køre denne progression. Klonal evolution afhænger nye driver mutationer, hvilket let genereres af det genomiske “ustabilitet” menes at være til stede i mange cancere [17]. Men de seneste CRC genom data viser relativt lave mutation frekvenser ( 1 per 100.000 baser), i overensstemmelse med normal mutation og division satser [10]. Neutrale passager mutationer fremherskende [6], [7], og derfor bona fide driver mutationer kan kun sjældent dukker op i de relativt korte intervaller mellem transformation og tumor fjernelse. Hvis føreren ændringer er sjældne, ville klonal evolution være sjældne.

Uden et mål for udvælgelse er det vanskeligt at bedømme roller de mange mutationer og epigenetiske ændringer findes i kræft genomer. Valg effektivt optimerer fitness, når og hvor muligheder opstår, men et praktisk spørgsmål er, hvor meget celler adskiller før valg griber ind. Selvom valget er vanskeligt at måle, en selektiv sweep producerer en flaskehals og tab af cellulære mangfoldighed. Derfor mangfoldigheden af ​​blaffe ændringer passagerer inden for en population (figur 2) er et mål for udvælgelse [8]. En følsom test for udvælgelse er mængden af ​​blafning variation inden for små cancer kirtler, fordi fiksering er hurtigere i mindre populationer [9]. Den høje passager methylering mønster mangfoldighed målt i denne undersøgelse inden for og mellem små CRC kirtel fragmenter tyder udvælgelse er en svag kraft, der typisk mangler minimum evne til at feje selv nærliggende celler. Denne udledte mangel på selektive sweeps efter transformation er konsistent med den manglende evne til let identificere yderligere metastatiske driver mutationer trods dyb sekventering [2], [18]. En nylig analyse af kræft genomdata hjælp af en meget anderledes tilgang udledes, at selv driver mutationer kan give relativt små selektive fordele [19], hvilket også ville være i overensstemmelse med den methylering mangfoldighed høje passager observeret i kræft cellepopulationer.

Hvis udvælgelsen er svag og en trinvis erhvervelse af nye kapaciteter sker sjældent, kan den første transformerede celle allerede producerer veltilpasset og alsidig afkom med evner til at invadere eller metastaserer [3]. Fænotypisk progression efter transformation ville afhænge af fænotypisk plasticitet [4], [5], med invasion og metastase fra afvigende differentiering i stedet for udvælgelsen af ​​nye driver mutationer. En enkelt ekspansion er i overensstemmelse med de tilsvarende forskelligheder mellem kirtler uanset fysiske afstand i overfladiske, invasive, og metastatiske læsioner. De relativt høje forskel på CRC metastaser indebærer relativt gamle befolkninger, i overensstemmelse med den tidlige udbredelse af tumorceller observeret i eksperimentelle systemer [20]. Signifikante forskelle mangfoldighed blev undertiden observeret mellem overfladiske, invasive, og metastatisk regioner i samme tumor. Sådanne forskelle kunne repræsentere trinvis udvælgelse, men kan også opstå uden klonal evolution fra forskellige ankomsttider, med dybt invasive og metastatiske regioner koloniserede senere i progression. Regionale forskelle i mitotiske satser kunne også producere forskelle, herunder situationer, hvor metastaser er mere forskelligartet end deres primære tumorer. Den høje passager methylering forskelligheder i de fleste CRC’er og deres metastaser indikerer relativt gamle og stabile bestande, med mange skel mellem transformation og kirurgi.

Uden klonal evolution, ville nutidens tumorceller danne en enkelt population med ukompliceret stjerne-formet ophav og hyppige langlivede slægter. De relative forskelle inden kirtler versus mellem kirtler (intragland at intergland PWD nøgletal) angive, hvor meget ombygninger eller udslettelse sker inden kirtler. Simuleringer af kræft kirtel mangfoldighed foreslog begrænset kræftcelle udryddelse, og var i overensstemmelse med stamcelle hierarkier med flere langlivede CSC slægter pr kirtel snarere end ekstremt sjældne CSCS. CRC’er er ofte resistente over for kemoterapi [21], og et større antal langlivede slægter ville mere effektivt akkumulere allerede eksisterende terapi resistente varianter.

Tumor evolution er almindeligt menes at øge fitness, men hvis den første transformerede celle er allerede optimalt “fit”, kan dens afkom lider progressive fald i fitness, en ukønnet formering fænomen kaldet Mullers Ratchet [22]. Den begrænsede men relativt allestedsnærværende ekstinktion udledes i CRCs kan mere repræsentere tab af mindre fit variante celler (eller udvælgelse baggrund [8]) snarere end dominans ved mere fit varianter (fig 2). Interessant, methylering mønster passager mangfoldighed og anslåede antal CSCS var mindre i MMR defekte CRC’er, hvor mulighederne for valg ville teoretisk være større, fordi mutationsrater er omkring 100 til 1000 gange højere [16]. Potentielt denne lavere mangfoldighed kunne afspejle lavere spredning satser, selv om intergland tag sammenligninger bør bidrage til at normalisere mitotiske aldre mellem MFR mangelfulde og dygtige CRCs.