Abstrakt
Cisplatin, et almindeligt anvendt kemoterapeutiske, er forbundet med ototoksicitet, renal toksicitet og neurotoksicitet, dermed identificere midler til at øge det terapeutiske indeks af cisplatin kan muliggøre bedre resultater. En SNP (rs4343077) inden
EPS8
, opdaget ved et genom bred forening undersøgelse af cisplatin-induceret cytotoksicitet og apoptose i lymfoblastoide cellelinier (LCLS), forudsat impuls til yderligere at studere dette gen. Formålet med dette arbejde var at vurdere betydningen af
EPS8
i cellulær følsomhed over for cisplatin i cancerøse og ikke-cancerceller. Vi brugte
EPS8
RNA-interferens at bestemme virkningen af nedsat
EPS8
udtryk på LCL og A549 lungekræft celle følsomhed over for cisplatin.
EPS8
knockdown i LCLS resulterede i en stigning på 7,9% i cisplatin-induceret overlevelse (
P
= 1,98 × 10
-7) og en 8,7% fald i apoptose (
P
= 0,004) sammenlignet med kontrol. I modsætning hertil reduceres
EPS8
udtryk i lungekræft celler resulterede i et fald 20,6% i cisplatin-induceret overlevelse (
P
= 5,08 × 10
-5). Vi undersøgte derefter en
EPS8
inhibitor, mithramycin A, som et potentielt middel til at øge det terapeutiske indeks af cisplatin. Mithramycin A faldt
EPS8
udtryk i LCLS resulterer i nedsat cellulær følsomhed over for cisplatin som det fremgår af lavere caspase 3/7 aktivering efter cisplatin behandling (42,7% ± 6,8% i forhold til at styre
P
= 0,0002 ). I 5 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinjer, mithramycin A resulterede også i faldet
EPS8
udtryk. Tilføjelse mithramycin til 4 NSCLC cellelinier og en blærecancer-cellelinie, resulterede i øget følsomhed over for cisplatin, der var væsentligt mere udtalt i tumorcellelinier end i LCL strækninger (P 0,0001). En EGFR-mutant NSCLC cellelinje (H1975) viste ingen signifikant ændring i følsomheden over for cisplatin med tilsætning af mithramycin behandling. Derfor kunne en inhibitor af
EPS8
, såsom mithramycin A, forbedre cisplatin behandling ved at øge følsomheden af tumor i forhold til normale celler
Henvisning:. Gorsic LK, Stark AL, Wheeler HE, Wong SS, Im HK, Dolan ME (2013)
EPS8
Hæmning Øger Cisplatin Følsomhed i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 8 (12): e82220. doi: 10,1371 /journal.pone.0082220
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA
Modtaget: Juni 13, 2013; Accepteret: 24 Oktober 2013; Udgivet: December 19, 2013 |
Copyright: © 2013 Gorsic et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Forfatterne er taknemmelige for National Institute of Health, National Institute of General Medical Sciences UO1GM61393 (mED), National Institute of Health Klinisk og Translational Science Award TL1 RR25001 (ALS), National Institute of Health Cancer Biology Training Grant T32CA009594 (HEW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Cisplatin er en platin middel anvendt til behandling af hoved og hals, ovarie-, cervical, testikel-, og lungekræft; dog alvorlige toksiciteter og iboende /erhvervet resistens forstyrrer dens effektivitet [1]. Forståelse genetiske og molekylære mekanismer, hvormed denne kemoterapeutiske middel forårsager toksiske bivirkninger ville være til stor gavn for patienterne. Især identifikation af gener, hvis udtryk bidrager til toksicitet ville give mulighed for at udvikle kemoterapi at omgå toksiske effekter.
Vores laboratorium har udviklet en præklinisk farmakogenomisk model udnytter lymfoblastoide cellelinier (LCLS) at identificere genetiske varianter, der er forbundet med modtagelighed for kemoterapeutika at supplere og øge kliniske farmakogenomiske undersøgelser [2] – [5]. Vigtigere, varianter identificeret i cellen tilgang har vist sig at være forbundet med respons i ovariecancer [6], lungecancer [7], hoved- og halscancer [8], og paclitaxel perifere neuropati hos brystkræftpatienter [ ,,,0],9], der giver tillid til cellebaserede model til identifikation klinisk relevante varianter.
for de fleste LCL undersøgelser blev lægemiddelinduceret cellevækstinhiberingen den farmakologiske fænotype målt, men dette er en bred fænotype, som omfatter cellulære processer fører til nekrose, celledød gennem apoptotiske og ikke-apoptotiske veje, cellecyklusstandsning og beskadigede celler undergår DNA-reparation [10]. Apoptose, en mere specifik fænotype, kan belyse relevante single nucleotide (SNP’er) i forbindelse med cisplatin respons hos patienter, idet cisplatin er kendt for at forårsage celledød gennem en apoptosecyklus [11]. Derfor, i en tidligere undersøgelse behandlede vi HapMap LCLS med cisplatin og målt caspase 3/7 aktivering samt cellevækstinhiberingen [12]. En GWAS afslørede 2449 SNPs og 1629 SNPs suggestively forbundet med cisplatin-induceret apoptose og cytotoksicitet (
P
0,001) henholdsvis med 19 overlappende SNPs [12]. En af de fælles SNPs, rs4343077, hvor den mindre allel havde lavere cisplatin-induceret apoptose (
P
= 0,0007) og højere survivial (
P
= 0,0007) er også et udtryk kvantitativ egenskab locus (eQTL) i forbindelse med de baseline genekspression niveauer af 28 gener på
P
≤10
-4 [12]. Dette SNP er i en intron af epidermal vækstfaktor receptor pathway substrat 8 (
EPS8
).
Det er interessant,
EPS8
er specielt knyttet til cisplatin og paclitaxel-induceret drug svar, hvor livmoderhalskræft celler blev mere følsomme over for narkotika behandling efter
EPS8
knockdown [13]. For nylig,
EPS8
viste sig også at være overudtrykt i humane maligne gliomer og fremmet deres cellulære vækst [14]. Undersøgelser har rapporteret forøget ekspression af
EPS8
i andre forskellige humane tumorer, herunder æggestokkene, kolorektal, lunge-, hypofyse og oral cancer [15]. Som et resultat,
EPS8
dæmpning har vist sig at påvirke cellevandring og celleproliferation i cancerceller [15].
grund af vigtigheden af
EPS8
som reaktion på cisplatin i tumorceller [13] og vores identifikation af en SNP inden
EPS8
(rs4343077) i forbindelse med både cisplatin cytotoksicitet og apoptose [12], vi yderligere vurderet relevansen af
EPS8
i følsomhed til cisplatin. Til dette formål brugte vi siRNA mod
EPS8
og en kendt
EPS8
inhibitor, mithramycin. Nedregulering ved hjælp siRNA og /eller inhibering af
EPS8
af mithramycin resulterede i nedsat større cellevækstinhiberingen i ikke-EGFR mutante lungecancerceller og en blære cellelinje efter cisplatin-behandling. Vores undersøgelse identificerer betydningen af
EPS8
i cisplatin-induceret cytotoksicitet.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Ni LCLS (GM6991, GM7348, GM10838 , GM11994, GM12239, GM10859, GM11830, GM11840, GM12156) afledt af individer af Nord- og Vesteuropæiske herkomst (HapMap CEU) blev opretholdt i RPMI 1640-medier indeholdende 15% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, Utah, USA) og 20 mM L-glutamin. Cellelinier blev fortyndet 3 gange om ugen til en koncentration på 350.000 celler /ml. A549 blev NCI-H1437, NCI-H1563 og NCI-H1975 (human ikke-småcellet lungekræft cellelinier) opretholdt i RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum. NCI-H2126 (human ikke-småcellet lungekræft cellelinien) blev opretholdt i DMEM: F12 indeholdende 0,005 mg /ml insulin, 0,01 mg /ml transferrin, 30 nM natriumselenit, 10 nM hydrocortison, 10 nM beta-østradiol, ekstra 2 mM L-glutamin og 5% føtalt bovint serum (medium foreslået af ATCC). HTB9 (urinblære grad II carcinom cellelinje) blev opretholdt i RPMI 1640 og 10% føtalt bovint serum. Alle cellelinjer blev opbevaret i en 37 ° C inkubator med 5% CO
2. Kræftceller, medium og komponenter blev købt fra ATCC (Manassas, Virginia, USA), Cellgro (Herndon, Virginia, USA) eller Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Missouri, USA).
Narkotika
cisplatin og mithramycin a blev indkøbt fra Sigma-Aldrich Co. dimethylsulfoxid blev anvendt til at fortynde cisplatin til en 20 mM stamopløsning, hvorimod mithramycin blev fortyndet til en stamkoncentration på 0,06 uM ved hjælp phosphatbufret saltvand.
Sammenhæng mellem
EPS8
og fænotyper
genom-dækkende genekspression data blev genereret i vores laboratorium med Affymetrix GeneChip Menneskelig exon Array 1.0 ST Array [16], og alle rå exon array-data har været deponeret i Gene Expression Omnibus (tiltrædelsen nr. GSE7761).
EPS8
genekspression niveauer blev korreleret til 5 uM cisplatin-induceret cytotoksicitet og apoptose [12] i CEU LCLS (n = 77). Lineær regressionsanalyse mellem
EPS8
niveauer og hver fænotype blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 4.
RNA-interferens
Der blev udført Knockdown eksperimenter for at demonstrere effekten af lavere
EPS8 Salg niveauer på cisplatin-induceret cytotoksicitet og apoptose. Brug af Lonza cellelinje med 96 brønde Nucleofector Kit SF (Lonza Inc, Basel, Schweiz), LCLS og A549 blev nucleofected 24 timer efter at være blevet podet med 5,5 × 10
5 celler /ml og 4,0 × 10
5 celler /ml. Celler blev centrifugeret ved 90 x g i 10 minutter ved stuetemperatur og resuspenderet ved en koncentration på 1 x 10
6 celler /20 pi i SF /supplement opløsning og 2 pM slutkoncentration af AllStars negative kontrol siRNA mærket med AlexaFluor488 (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) eller en pulje af Hs_EPS8 (SI00380737, SI03109302, SI00380751, SI00380744) flexirør siRNA (Qiagen). Program DN-100 blev anvendt til LCL nucleofection og CM-130 for A549. Celler fik 10 minutters hvile før tilsætningen af RPMI-medium, derpå udpladet for cytotoksicitet eller apoptose og inkuberet natten over.
Cytotoksicitet efter siRNA eller behandling med mithramycin
An alamarBlue cellulær væksthæmning assay blev anvendes til at måle cytotoksiske virkninger af cisplatin og mithramycin [17]. For
EPS8
siRNA eksperimenter blev LCLS (GM6991, GM7348, GM10838, GM11994 og GM12239) behandlet med 5 pM cisplatin 5 timer skrive nucleofection, mens A549 blev behandlet med 5 pM cisplatin 24 timer efter nucleofection. Følgende drug behandling celler blev inkuberet i 24 timer. AlamarBlue blev derefter tilsat, og pladerne blev inkuberet i yderligere 24 timer, inden de blev aflæst ved bølgelængder på 570 og 600 nm ved Synergy HT (Biotek, Winooski, VT) og procent overlevelse blev beregnet [12]. At observere cytotoksisk reaktion med
EPS8
knockdown gennem mithramycin, celler (GM10859, GM11830, GM11840, GM12156, A549, H1437, H1563, H1975, H2126 og HTB9) blev belagt og behandlet med enten mithramycin alene (0 og 0,01 uM), cisplatin alene (0, 1, 2,5, 5, 10 20, 25 og 50 uM) eller cisplatin i forskellige koncentrationer kombineret med 0,01 uM mithramycin. Mithramycin behandling skete umiddelbart efter plating. Celler blev derefter behandlet med cisplatin 6 timer efter mithramycin tilsætning og 10% af den samlede brønd volumen alamarBlue sattes 24 timer efter cisplatin-behandling. Efter yderligere 24 timer inkubationsperioden blev pladerne aflæst som anført ovenfor. Alle eksperimenter for procent overlevelse målinger blev udpladet i tre eksemplarer med mindst to separate forsøg.
Apoptose assay
cisplatin og mithramycin apoptose blev målt ved anvendelse af Caspase-Glo 3/7 reagens fra Promega Corporation (Madison, WI) som beskrevet tidligere [12]. For
EPS8
siRNA eksperimenter blev forgyldt celler behandlet med 5 pM cisplatin 5 timer bogføre nucleofection og caspase 3/7 blev målt 24 timer efter cisplatin behandling. Til bedømmelse
EPS8
genekspression efter mithramycin eksponering blev celler udpladet og straks behandlet med mithramycin (0 eller 0,01 uM), derefter behandlet med 5 pM cisplatin 20 timer efter mithramycin tilsætning. Caspase 3/7 aktivitet blev målt 24 timer efter cisplatin og beregnet som i forhold til kontrol (intet lægemiddel tilsætning). Resultater for apoptose målinger repræsenterer eksperimenter forgyldt i tre eksemplarer med et minimum af to uafhængige gentagelser.
Kvantificering knockdown af
EPS8
Cellerne blev pelleteret ved 5, 29 og 53 timer efter nucleofection med
EPS8
siRNA og scrambled kontrol, samt 6 og 20 timer efter mithramycin behandling. RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy Plus Mini kit og QIAcube (Qiagen) ved at følge fabrikantens protokol. mRNA blev derefter revers transkriberet til cDNA til opnåelse slutkoncentrationer på 25 eller 50 ng /pl ved hjælp af høj kapacitet revers transkription kit (Applied Biosystems, Life Technologies, Grand Island, NY). CDNA’et blev anvendt til at udføre QRT-PCR for at bekræfte knockdown af
EPS8
[18]. Applied Biosystem TaqMan primer blev anvendt til at kvantificere mRNA ekspressionen af
EPS8
(Hs00610286_m1).
Blandet effekter model
Effekten af
EPS8
knockdown på cisplatin induceret apoptose og væksthæmning blev modelleret ved hjælp af følgende blandede effekter model:
eksperiment og cellelinjer var tilfældige effekter muliggør eksperiment specifikke og cellelinie specifikke aflytninger og knockdown status blev betragtet som en fast effekt. Y betegner apoptose eller vækstinhibering. P-værdier for knockdown effekt blev beregnet ved hjælp af likelihood ratio test med modeller passer med REML sæt til falsk. Goodness of fit af modellerne blev vurderet undersøge residualerne ‘distributioner. R Statistisk software (R Development Core Team https://www.R-project.org/) og
lme4
pakke (R pakkeversion ,999375-42 https://CRAN.R-project.org/pakke = lme4) blev anvendt til analyse.
interaktion af mithramycin ± cisplatin
for at teste samspillet effekten af celletype (tumor vs LCL) og mithramycin behandling på cisplatin dosisreaktionskurve vi passer en blandet virkninger. Den endelige model var: hvor den naturlige logaritme af procent overlevelse var resultatet og tumor (status vs LCL status) og mithramycin behandling (TRT) blev fastsat effekter med interaktion sigt; exp angivet en af de to biologiske gentagelser og var udstyret som tilfældig effekt; cisplatin-dosis og den kvadratiske blev anvendt til at modellere dosisresponskurven gør det muligt at være forskellige for tumor og LCL linjer; cellelinie id blev tilsat som en tilfældig effekt til regnskab for inden cellelinie korrelation. Ved montering af modellen resultaterne ved nul koncentration af begge lægemidler (rækker, hvor overlevelse udfald = 1 på grund af den måde procent overlevelse blev beregnet) blev udelukket. Log transformation blev anvendt til at forbedre model fit. Koefficienten af interaktionen tumor:trt kan fortolkes som den gennemsnitlige forskydning af dosis respons kurven, når mithrmycin blev tilføjet til tumor linjer i forhold til LCL linjer.
Resultater
Vellykket knockdown af
EPS8
gennem RNA-interferens
Fem CEU LCLS og A549 lungekræft cellelinje blev anvendt til undersøgelser med
EPS8
knockdown. Cellerne blev nucleofected med enten en forvrænget kontrol eller siRNA af
EPS8
. Sammenligning til scrambled kontrol,
EPS8
knockdown viste sig at være en succes på tværs af alle 6 cellelinjer (fig. 1A). De gennemsnitlige procentdele af
EPS8
tværs af alle LCLS på 5, 29, og 53 h tidspunkter var 17,2 (± 7,5), 19,0 (± 4,3) og 40,6% (± 7,3) henholdsvis. A549 opnås
EPS8
knockdown til 7,4% og 10,5% i forhold til krypterede kontrol ved 29 og 53 timer.
Værdier omfatter 2 uafhængige forsøg med QRT-PCR kørt in duplo. Cell line ændringer i procent overlevelse (
P
= 1,98 × 10
-7) og caspase 3/7 aktivitet (
P
= 0,004) for alle LCLS og A549 (
P
= 5,08 × 10
-5) på 5 uM cisplatin grund
EPS8
knockdown vises med standard fejl af den gennemsnitlige bruger 6 replikater fra 2 uafhængige eksperimenter (B).
fænotypiske ændringer med
EPS8
siRNA
efter bekræftelse knockdown af
EPS8
, vi vurderet ændringer i følsomhed over for cisplatin som målt ved procent overlevelse og caspase 3/7 aktivering. Sammenhængen mellem
EPS8
udtryk og cisplatin-induceret cytotoksicitet angivet lavere niveauer af
EPS8
udtryk signifikant korreleret til større procent overlevelse ved 5 uM cisplatin (
P
= 0,047); dog cisplatin induceret apoptose ikke nåede signifikans (
P
= 0,499) (fig. S1). Ved hjælp af en blandet effekt model kombinerer alle cellelinjer,
EPS8
RNA-interferens viste en øget overlevelse af cisplatin-behandlede LCLS med gennemsnitligt 7,9% (
P
= 1,98 × 10
– 7) og nedsat apoptose med gennemsnitligt 8,7% (
P
= 0,004) (fig. 1B). Disse resultater viser, at lavere niveauer af
EPS8
i LCLS falde cellulære følsomhed over for cisplatin som det fremgår af øget celle overlevelse og nedsat apoptotisk aktivitet, når de behandles med cisplatin. Således faldt
EPS8
i LCLS giver resistens over for cisplatin toksicitet. I modsætning hertil
EPS8
nedregulering i A549 forårsaget større følsomhed over for cisplatin med et fald 20,6% i procent overlevelse (
P
= 5,08 × 10
-5) (fig. 1B).
mithramycin reducerer ekspressionen af
EPS8
i kræft linjer og LCLS
Niveauer af
EPS8
udtryk blev målt 6 og 20 timer efter behandling med mithramycin (0,01 uM). Niveauer af
EPS8
ekspression faldt i alle 4 LCLS testet, med et gennemsnit på 74,4% (± 3,4) ved 6 timer og 29,8% (± 3,7) ved 20 timer i forhold til kontrol efter mithramycin eksponering (fig. 2A ). Mithramycin faldt også
eps8
ekspressionsniveauerne i fem NSCLC cellelinjer og blærekræft cellelinje til et gennemsnit på 95,7% (± 3,4) ved 6 timer og 59,9% (± 14,7) ved 20 timers eksponering, i forhold til ingen lægemiddelbehandling kontrol (fig. 2B). Disse målinger bekræfter, at behandlingen af mithramycin (0,01 uM) resulterer i lavere udtryk for
EPS8
i kræft lunge og blære celler samt i noncancerous LCLS.
Procent-værdier vist omfatter to uafhængige forsøg med QRT-PCR kørt i to eksemplarer for hvert forsøg med standard på middelværdien.
mithramycin nedsætter følsomheden af LCLS til cisplatin
Vi derefter bestemmes effekten af mithramycin på følsomhed LCLS for cisplatin-induceret caspase 3/7 aktivering. De gennemsnitlige apoptose niveauer på tværs af 4 LCLS efter cisplatin alene var 5,94 (± 0,9) i forhold til kontrol, i sammenligning med cisplatin plus mithramycin der faldt den gennemsnitlige caspase 3/7 niveauer til 3,38 (± 0,5) (fig. 3). Caspase 3/7 aktivitet efter mithramycin alene (0,01 uM) resulterede i et gennemsnit på 3,41 (± 0,4) på tværs af de 4 LCLS. Selvom mithramycin og cisplatin separat inducere apoptose, var der et gennemsnitligt fald på 42,7% (± 6,8
P
= 0,0002) i caspase 3/7 aktivering ved at kombinere mithramycin med cisplatin sammenlignet med cisplatin alene, hvilket tyder på en beskyttende virkning af mithramycin i form af apoptose. Lunge- og blære cancerceller blev også testet for apoptose med cisplatin (5 uM) i nærvær og fravær af mithramycin; dog caspase 3/7 aktivering niveauer for disse celler var ikke over baseline.
Hver LCL oplevede lavere cisplatin-induceret apoptotisk aktivitet med den ekstra mithramycin i forhold til en ikke lægemiddelbehandling kontrol. Mithramycin behandlet 10859, 11830, 11840, og 12156 resulterede i en 47,1, 40,8, 48,9, og 34,0% fald fra cisplatin alene hhv. Dataene repræsenterer to separate eksperimenter, hver udført i tre eksemplarer med standard på middelværdien.
Mithramycin øger følsomheden af tumorceller til cisplatin
Ud over at teste apoptose niveauer med cisplatin og mithramycin i LCLS og cancerceller, vi også målt cellevækstinhiberingen. Fem NSCLC cellelinjer med forskellige mutation status blev udvalgt til undersøgelsen; effekten af mithramycin alene varierer for disse cancercellelinier i området fra 59,7 til 92.9% cellevækstinhibering (tabel 1). Følsomhed over for cisplatin fandtes at stige med mithramycin behandling i 4 molekylært distinkte NSCLC celler (Fig. 4). H1975 med en EGFR-mutation, oplevede ingen væsentlige ændringer. Da cisplatin også anvendes til behandling af blærecancer, valgte vi også at måle cisplatin og mithramycin virkninger i en blære tumor linje for at se, om effekten ville efterligne NSCLC resultater; vi observerede 59,6% overlevelse med mithramycin behandling alene (fig. 4).
kvadratisk form repræsenterer cisplatin koncentrationer alene, mens trekant repræsenterer cisplatin med tilsætning af mithramycin (0,01 uM). Kurver repræsenterer to uafhængige forsøg udført tre gange med standard på middelværdien.
Men når undersøger effekten af mithramycin på følsomhed LCLS til cisplatin, vi ikke observere den samme grad af forbedret cellevækstinhibering. Mithramycin alene på 4 LCLS forårsagede en gennemsnitlig cellevækstinhiberingen af 63,1% (± 12.8) 0.01 uM (fig. S2). Dosisresponskurven for LCLS blev flyttet nedad i gennemsnit omkring 17%, når mithramycin blev tilsat. For tumorlinier dosisresponskurven forskudt nedad omtrent 26% i gennemsnit. Den p-værdi på interaktionen var
P
0,0001. Dette, sammen med apoptose resultater, støtter den opfattelse, at reduceret ekspression af
EPS8
via mithramycin er ikke lige skadeligt for LCL overlevelse som det er for kræft cellelinier. Mithramycin forårsager større følsomhed i NSCLC celler uden EGFR-mutation og muligvis andre typer kræft væv som set af vores resultater i blæren tumorcellelinie, HTB9.
Diskussion
I denne undersøgelse har vi evalueret
eps8
som et potentielt mål for kombinationsbehandling med cisplatin.
EPS8
blev valgt baseret på tidligere prækliniske GWAS resultater ved hjælp af flere cellulære fænotyper: cisplatin-induceret cytotoksicitet og cisplatin-induceret apoptose som målt ved caspase 3/7 aktivering. SNP’en (intron til
EPS8
), rs4343077, var forbundet med cisplatin-induceret cytotoksicitet og apoptose samt baseline ekspression af 28 målgener. Ved knockdown af
EPS8
ekspression i 5 LCLS observerede vi en signifikant nedgang i cellulær følsomhed for cisplatin som målt ved cellevækst hæmning og caspase 3/7 aktivering (
P
= 1,98 × 10
-7 og
P
= 0,004, henholdsvis) på tværs LCLS. Litteratur beviser foreslog
EPS8
knockdown i tumorcellelinier øget cellulær følsomhed over for cisplatin [13], [15]. Vores resultater enige i disse resultater, der viser, at
EPS8
nedregulering sensibiliserer A549 lungekræft celler til cisplatin behandling. Vi udvidede vores studier til andre molekylært definerede lunge cellelinjer og en blære cellelinie samt LCLS.
EPS8
knockdown i LCLS følgende mithramycin behandling resulterede i et fald i apoptotisk aktivitet, når mithramycin blev kombineret med cisplatin sammenlignet med cisplatin alene. Selvom cellecytotoksicitet målinger viste en lille stigning i følsomhed over LCLS til cisplatin efter mithramycin eksponering, følsomhed af cancerøse cellelinjer var signifikant større med mithramycin tilsætning sammenlignet med LCLS. Undtagelsen var NSCLC cellelinje H1975 med en EGFR-mutation. Dette indebærer knockdown af
EPS8
gennem enten siRNA eller brug af en inhibitor som mithramycin kan være en strategi for at øge tumor følsomhed over for cisplatin.
EPS8 er en oncoprotein bidrage til malign transformation i tumorceller [12], [19]. Det er et substrat af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og deltager i EGFR signalering gennem Rac, og handel gennem Rab5 [20]. Dens tri-komplekse forhold med
SOS1
ABI1
har vist sig at være et væsentligt element for lysophosphatidsyre-stimuleret celle migration og Rac aktivering, som har vist sig at spille en vigtig rolle i ovariecancer metastase [21]. Niveauer af
EPS8
er også blevet implementeret som en prognostisk redskab for patienter i de tidlige stadier af livmoderhalskræft [13]. Patienter med højere ekspression af
EPS8
tendens til at opleve parametrial invasion, lymfeknudemetastase og et fald i overlevelsesgrad.
Oprindeligt Yang et al. (2010), undersøgte mithramycin, et antibiotikum fra
Streptomyces
arter, som en potentiel hæmmer af
EPS8
. De bestemte, at mithramycin reducerer mRNA og protein niveauer af
EPS8
i en human colorektal adenocarcinom epitelcellelinie og en human lungecarcinom epitelcellelinie. Endvidere
EPS8
nedregulering gennem mithramycin behandling, bevirker et signifikant fald i cancercellevækst og migration evne [22].
Mithramycin har været en godkendt klinisk anticancerlægemiddel siden 1970 [23] og anvendes i USA til klinisk behandling af Pagets sygdom, testikelkræft karcinom, og hypercalcæmi hos patienter, der oplever malignitet-associeret knoglelæsioner [24] – [28]. Imidlertid har dens anvendelse i terapi behandling formindsket gennem årene på grund af dets bivirkninger og smalt terapeutisk indeks [29]. Patienter, der behandles med mithramycin, for disse sygdomme, er set at opleve gastrointestinale, lever-, nyre- og knoglemarv toksiciteter, hvilket resulterer i kvalme, opkastning og blødning [30]. Trods dens alvorlige bivirkninger, har der været en fornyet interesse for mithramycin nu, at forståelse af dets interaktioner på molekylært niveau udvikler sig [29].
Mithramycin har vist sig at interagere med GC-rige DNA-regioner lokaliseret ved minor groove i DNA [29], [31] – [33], som i øjeblikket menes at forhindre transcription faktor specificitet protein 1 (SP1) i at binde til en række forskellige promotorer af proto-onkogener. Men Sp1 bindende websteder, der er relateret til en delmængde af proto-onkogener synes at forblive upåvirket, såsom promotor p21
CIP1 /WAF1 [29]. Derfor kan mithramycin ikke være specifikke for Sp1 inhibering og kan potentielt målrette et onkogen opstrøms for Sp1 interaktion. Det er tidligere blevet opdaget, at mithramycin formindsker også ekspression af
c-myc
,
c-myb
,
c-src
,
c-met
og FOXM1 [22], [34]; dog mithramycin øger niveauerne af FOXO3A [34], en transkriptionsfaktor som regulerer DNA beskadigelse respons. Der kan være en mulighed for, at disse gener er forbundet med hinanden i en pathway nedstrøms for mithramycin mål.
For eksempel
EPS8
har også vist sig at opregulere FOXM1 [35], en vigtig faktor i udviklingen og progressionen af visse kræftformer [36], som vides at binde direkte med SP1 [37], [38]. Sp1 og FOXM1 har vist sig at transaktivere promotorer af
c-myc
synergistisk [38]. Desuden
EPS8
dæmpning er fundet, for at mindske niveauet af
Src
,
Shc
og
FAK
(også kendt som
pTk2-
), et intracellulært tyrosinkinase deltager i celleadhæsion og motilitet [39]. FOXO3A kan også reguleres ved tilstedeværelsen eller fraværet af
EPS8
gennem forskellige veje, enten gennem PI3K /AKT /mTOR signalering [40] eller via Ras-Raf-MEK-ERK pathway [41]. Shiota et al. (2010) undersøgte cisplatin resistens og konstateret, at cisplatin-resistente celler blev sensibiliseret til behandling gennem induktionen af FOXO3A ved mithramycin [34]. Et fald i AKT signalering aktiverer FOXO3A og inducerer apoptose [36]; Derfor er det muligt, at en reduktion i
EPS8
niveauer falder AKT, udløser fosforylering af FOXO3A og cancerceller til at undergå apoptose i stedet for fortsat spredning.
Under en kollektiv kig på litteraturen og vores resultater synes det interessant, at lungekræft cellelinie, som ikke oplever øget celledød med mithramycin (H1975) har en EGFR mutation. Lungetumor cellelinie H1975 har en punktmutation i aktiveringssløjfen forårsager en ændring fra leucin til arginin (L858R) i exon 21 samt en sekundær punktmutation, T790M, ændring normal EGFR aktivitet [42]. EGFR tyrosin inhibitorer anvendes typisk til at sensibilisere EGFR muterede tumortyper på platinum midler er imidlertid EGFR vildtype-tumorer sjældent reaktion på disse inhibitorer [43]. Potentielt kan tilsætning af en mithramycin regimen være gavnlig for patienter med vildtype-EGFR at blive sensibiliseret over for platin behandling gennem hæmning af
EPS8 Salg og nedstrøms mål, som spiller en stor rolle i tumorcelleproliferation, vedhæftning og motilitet . En mithramycin dosis stort nok til at inhibere visse onkogener og alligevel lav nok til ikke at forårsage yderligere bivirkninger, ville tillade det kemoterapeutiske middel til mere effektivt at forårsage celledød af tumorceller.
Som konklusion vores resultater validerer
EPS8
involvering i celle respons på cisplatin-behandling. Selvom vi testede mithramycin, kan der være mere specifikke inhibitorer af
EPS8 Hoteller, som resulterer i en større forskel mellem kræftceller og normale celler. Mithramycin evne til at sænke niveauet af
EPS8
forårsagede mindre apoptotisk aktivitet i LCLS end med cisplatin behandling alene. Reduceret udtryk for
EPS8
gennem behandling med mithramycin er mindre skadelig for normale celler (som målt i LCLS) sammenlignet med kræftceller. Kollektivt, vores data giver en yderligere bekræftelse af den rolle og betydning af
EPS8
i cisplatin-induceret toksicitet og som et lovende mål for forbedring cisplatinbehandling.
Støtte oplysninger
figur S1.
Sammenhæng mellem
eps8
ekspressionsniveauerne og CEU LCL log transformeret procent overlevelse (
P
= 0,047, r
2 = 0,05, øverst) og caspase 3/7 aktivitet (
P
= 0,499, r
2 = 0,006, nederst)
doi: 10,1371 /journal.pone.0082220.s001
(TIFF)
Figur S2. Salg LCLS er vist ved forskellige koncentrationer af cisplatin med nærvær og fravær af mithramycin. Firkantede form repræsenterer cisplatin koncentrationer alene, mens trekant repræsenterer cisplatin med tilsætning af mithramycin (0,01 uM). Kurver repræsenterer to uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer med standardafvigelse af middelværdien
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0082220.s002
(TIFF)
anerkendelser
Forfatterne er taknemmelige for Farmakogenomforskning af anticancermidler cellelinje Core på University of Chicago for at få hjælp i bestilling og fik disse cellelinjer.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.