PLoS ONE: Den MyD88 + Fænotype Er en Adverse Prognostisk faktor i Epithelial kræft i æggestokkene

abstrakt

Prognosen for epitelial ovariecancer er fattige delvis på grund af den høje frekvens af kemoresistens. De seneste beviser peger på Toll-lignende receptor-4 (TLR4), og især dets adapter protein MyD88, som en potentiel mediator af denne modstand. Denne undersøgelse har til formål at give yderligere beviser for, at MyD88 positive kræftceller er klinisk signifikant, stængel-lignende og reproducerbart påviselige med henblik på prognostisk lagdeling. Ekspression af TLR4 og MyD88 blev vurderet immunhistokemisk i 198 paraffinindlejrede æggestokkene væv og i en embryonal carcinoma model af kræft stemness. Parallelt blev ekspression af TLR4 og MyD88 mRNA og regulatoriske microRNAer (MIR-21 og MIR-146a) vurderede, samt i en række chemosensitive og resistente kræftceller linjer. Funktionel analyse af reaktionsvejen blev vurderet i kemoresistent SKOV-3 ovariecancerceller. TLR4 og MyD88 ekspression kan reproducerbart vurderet via immunohistokemi under anvendelse af en semikvantitativ pointsystem. TLR4 udtryk var til stede i alle æggestokkene epitel (normalt og neoplastisk), mens MyD88 var begrænset til neoplastiske celler, uafhængigt af tumor kvalitet og forbundet med nedsat progressionsfri og samlet overlevelse, i en immunhistologiske specifik delmængde af serøse carcinomer, p 0,05. MIR-21 og miR-146a udtryk blev øget betydeligt i MyD88 negative kræftformer (p 0,05), hvilket indikerer deres deltagelse i regulering. Væsentlige ændringer i MyD88 mRNA-ekspression blev observeret mellem chemosensitive og kemoterapi celler og væv. Knockdown af TLR4 i SKOV-3 ovarieceller udvundet kemosensitivitet. Knockdown af MyD88 alene ikke. MyD88 ekspression blev nedreguleret i differentierede embryonal carcinom (NTera2) celler, støtter MyD88 + kræft stamceller hypotese. Vores resultater viser, at ekspressionen af ​​MyD88 er forbundet med betydeligt reduceret overlevelse patient og ændret microRNA niveauer og foreslå en intakt /fungerende TLR4 /MyD88 vej er nødvendig for erhvervelsen af ​​den kemoterapi fænotype. E

x vivo

manipulation af kræft i æggestokkene stamceller (CSC) differentiation kan reducere MyD88 udtryk, der giver en potentielt værdifuld CSC model for kræft i æggestokkene

Henvisning:. D’Adhemar CJ, Spillane CD, Gallagher MF, Bates M, Costello KM, Barry-O’Crowley J, et al. (2014) Den MyD88 + Fænotype Er en Adverse Prognostisk faktor i Epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (6): e100816. doi: 10,1371 /journal.pone.0100816

Redaktør: Chiara Romualdi, Padova Universitet, Italien

Modtaget: Januar 27, 2014 Accepteret: 30. maj 2014 Udgivet: 30 juni 2014

Copyright: © 2014 d’Adhemar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cancer Research Irland (tilskud referencenummer ICS CRP09OLE), den Meath fundament, The Royal City of Dublin Hospital Trust, BDI-2 (10 /CE /B1821), den Emer Casey fundament, den irske Cancer Society, og en Marie Curie EU yde. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er en af ​​de mest almindelige og dødelige kræftformer hos kvinder [1], [2], med forekomster og dødelighed forventes at stige i de vestlige lande [3]. Epiteliale ovariecancere (EOCs) omfatter størstedelen af ​​voksne æggestokkene maligniteter, som er mest almindeligt serøse carcinomer [4], [5]. Da kræft i æggestokkene er ofte asymptomatisk i sin vorden eller præsenterer med vage symptomer efterligner ekstra ovariesyndrom; de fleste patienter (70-75%) til stede med udbredt sygdom på diagnosetidspunktet med en resulterende høj dødelighed [6]. Aktuelle behandlingsmuligheder omfatter kirurgi og platin og /eller taxan kemoterapi [7]. Selvom EOC typisk reagerer meget godt til standard kemoterapi, med de første 70-80% responsrater, er dette ofte efterfulgt af tilbagefald, der ofte kemoterapi [8], [9]. Forudsigelse og overvinde denne kemoresistens fortsat en central udfordring i behandling, men der er i øjeblikket ingen ledige biomarkører (serum eller væv), der virkelig forudsigelig adfærd eller chemoresponsiveness.

Toll-lignende receptorer (TLRs) fungerer som væsentlige komponenter af det medfødte immunsystem. De er membranbundne receptorer, som genkender bestanddele af eksogene patogener, såsom bakterielt lipopolysaccharid (LPS) og virale RNA’er, hvilket fører til et inflammatorisk respons. TLRs kan også aktiveres af endogene ligander, herunder cellerester afledt af kræft progression [10] – [13]. De fleste TLRs signal via myeloid differentiering primære respons gen 88 (MyD88) og udtrykkes i både lymfoide og ikke-lymfoide væv (overvejende i det tidligere), med stigende dokumentation for, at de spiller en vigtig rolle i kræft patogenese [14], [15] . Nettoeffekten af ​​TLR signalering (+/- MyD88) er transskriptionsfaktoraktivering, herunder nuklear faktor-KB (NF-KB). NF-KB er et universelt udtrykte transkriptionsfaktor, er særlig vigtig, både som del af den normale inflammatoriske respons og i tumorigenese, der regulerer ekspressionen af ​​forskellige inflammatoriske, apoptotiske og onkogene gener [16]. I sidste ende NF-KB-aktivering fører til forøget produktion af cytokiner, kemokiner og vækstfaktorer. Aktiviteten af ​​denne vej er normalt holdes i skak, under den normale immunrespons, dels gennem microRNA regulering af TLR4 signalering, og eksempler herpå omfatter microRNA 21 (miR-21) og miR-146a [17], [18], [ ,,,0],19].

TLR4 /MyD88 vej har i de seneste år blevet foreslået som en risikofaktor for carcinogenese og kemoresistens i ovariecancer [20], [21]. Mens det er blevet observeret, at TLR4 ekspression er allestedsnærværende i EOC celler, har en undergruppe differentielt udtrykker MyD88 vist øget cytokin /chemokin produktion og cellulær proliferation ved aktivering af TLR4 [20]. Chen et al. [21] har brugt denne differentieret udtryk at opdele EOC ind MyD88 positiv og MyD88 negativ. MyD88 positive EOCs et fungerende TLR4 /MyD88 pathway og kan repræsentere en ovariecancer stamcelle (CSC), som er meget modstandsdygtig over for pro-apoptotisk signal- og som kan rekruttere leukocytter til aktivt at fremme en pro-inflammatorisk, pro-proliferativ mikromiljø [22] . MyD88 negative EOCs i kontrast mangler MyD88 og kan repræsentere mere differentierede tumorer, der er mindre biologisk aggressive [20], [23]. Alvero et al. [12] viste, at CSCS afledt af ovariale tumorprøver har en unik CD44 + /MyD88 + fænotype, der lettes resistens over for både tumornekrosefaktor (TNF) induceret apoptose og cytotoksisk behandling. For nylig MyD88 proteinekspression viste sig at være en signifikant dårlig prognostisk faktor i EOC [24].

Den differentierede klassificering af MyD88 positive og negative EOC har konsekvenser for de nuværende terapeutiske strategier. Selvom cisplatin-resistens forekommer i et mindretal af kvinder i løbet af deres indledende behandling (30%), den efterfølgende udvikler i alle kvinder, der får behandling for tilbagevendende sygdom [9], og er mest sandsynligt på grund af modstand mod apoptotisk signalering i MyD88 positive celler [12 ], [25], [26]. Desuden paclitaxel (et taxan-baserede agent) er en TLR4 ligand og kan aktivere TLR4 /MyD88 vej hos MyD88 positive celler, der faktisk inducere deres proliferation [20], [27]. Sådanne MyD88 kompetente cancerceller er teoretisk i stand til at udnytte de nuværende kemoterapeutiske strategier, ved ikke blot modsætter deres cytotoksiske virkninger, men også ved hjælp paclitaxellignende ligering for at lette deres vækst, og at den omgivende stroma via forbedret NF-KB produktion. nuværende tyder derfor, at paclitaxel kan faktisk være en ulempe i patienter, hvis tumorer indeholder MyD88 positive EOC-celler, på trods af at fastholde sine cytotoksiske virkninger i MyD88 negative celler [20], [27]. Det er også muligt, at tilbagevendende sygdom kan repræsentere en pulje af mere aggressive kræftceller (CSCS), der rent faktisk er blevet “udvalgt ud ‘ved paclitaxel behandling.

Vi hypotese, at MyD88 + cancerceller repræsenterer en subpopulation af celler i EOC der giver mere aggressiv biologisk adfærd og kemoresistens. Til dato relativt lille antal kræft i æggestokkene prøver, eller isolerede cancer cellelinjer, er blevet undersøgt med hensyn til TLR4 /MyD88 udtryk [20], [23], [27], [28]. Formålet med denne undersøgelse var at foretage omfattende karakterisere fordelingen og kliniske betydning af TLR4 og MyD88 ekspression i en kohorte af æggestokkene neoplasmer, som omfatter alle almindelige histologiske subtyper og repræsenterer den største sådanne serier er undersøgt indtil [20], [23], [ ,,,0],24], [27], [28]. Ekspressionen af ​​to microRNAer vides at regulere TLR4 /MyD88 pathway blev også evalueret i en undergruppe af maligne tumorprøver at udforske deres rolle som epigenetiske modulatorer af denne vej. Knockdown af TLR4 /MyD88 blev vurderet til at dissekere den funktionelle rolle af disse gener. Sideløbende med ovennævnte eksperimenter blev TLR4 /MyD88 udtryk vurderet i udifferentierede og differentierede embryonal carcinoma celler til at give yderligere bevis på kræft stamceller hypotese kræft i æggestokkene.

Resultater

TLR4 og MyD88 udtryk i test-serien

den primære test serie af maligne tumorer i æggestokkene omfattede 20 patienter med serøse adenokarcinomer, der blev matchet til bedømmelse (high-grade) og fase (FIGO III), og som havde fået platinbaseret hjælpestof kemoterapi. TLR4 udtryk var universelt til stede og scorede som positivt (immunoscore 4) i alle tumorer (20/20). I modsætning hertil var positiv immunfarvning for MyD88 observeret i kun 12/20 tilfælde, og resten (8/20) blev klassificeret som MyD88 negativ. Klinisk opfølgning data var tilgængelige for alle patienter, hvoraf 12 var døde på tidspunktet for denne undersøgelse, og retrospektiv analyse blev udført for at bestemme, om MyD88 udtryk var forbundet med patientens overlevelse. Progressionsfri overlevelse (PFS) og samlet overlevelse (OS) blev vurderet. Figur 1 viser, at MyD88 ekspression blev forbundet med en markant forkortede PFS og OS (p 0,05). Den mediane tid til tilbagefald (fra tidspunktet for kirurgi) for patienter med MyD88 positive tumorer var 16 måneder, mens MyD88 negative tumorer gentog ved en median tid på 42 måneder (p = 0,018). MyD88 positive tumorer blev også forbundet med en markant kortere OS. Den gennemsnitlige OS tid for patienter med MyD88 positive tumorer var 43 måneder, sammenlignet med 108 måneder for MyD88 negative tumorer (p = 0,008).

MyD88 positive tumorer (n = 12) havde signifikant reduceret progressionsfri overlevelse ( A) og samlet overlevelse (B) (p = 0,018 og p = 0,008, henholdsvis).

TLR4 og MyD88 i Validering Series

Angivelse af TLR4 og MyD88 blev derefter vurderet i 178 patientprøver for at validerer serien resultater og undersøge udtryk i ikke-maligne ovarievæv og forskellige histologiske undertyper af EOC. Disse prøver indeholdt normale ovarier (n = 50), godartede cyster (n = 15), borderline tumorer (n = 28) og maligne tumorer (n = 85). Gennemsnitlige patientens alder på tidspunktet for kirurgi var 51 år for borderline tumorer (range, 20-81) og 59 år for alle ondartede svulster (range, 23-94). Hovedparten af ​​maligne tumorer var høj kvalitet, med 62% tildelt karakteren 3 (overvejende serøse carcinomer), og høj scene (51,3% FIGO stadie IIIC, 8,1% stadie IV). Alle tumorer, der blev iscenesat IIB og højere var serøse carcinomer. Den immunofænotype af hver vævstype er sammenfattet i tabel 1.

udtryk for både TLR4 og MyD88 var mest ensartede og stærkeste i serøse neoplasmer, især borderline og maligne serøse tumorer. Eksempler på TLR4 og MyD88 IHC ekspression er vist i figur 2 3. Normal ovarie overflade epitel (næse) viste variabel ekspression af TLR4 (7/50), men var ensartet negative for MyD88 (0/50). Cirka halvdelen af ​​de godartede cyster var TLR4 positive (7/15, blandet undertyper), men kun et mindretal var MyD88 positive (3/15, alle serøs). De fleste af borderline serøse tumorer var både TLR4 og MyD88 positive (12/15), med kraftig farvning observeret i 7/12. I modsætning alle borderline mucinous tumorer var MyD88 negative. Mens 73% (62/85) af maligne tumorer var TLR4 positive (blandede undertyper), blev co-ekspression af MyD88 observeret i kun 47% tilfælde, som alle var serøse carcinomer. Alle ikke-serøse carcinomer (mucinous, klar celle- og endometrioide) var MyD88 negative. Disse data genereret 40 MyD88 positive og 45 MyD88 negative cancere. MyD88 ekspression blev observeret i både poorly- og godt differentierede tumorceller, og var stærke nær områder med nekrose. Som vist i tabel 2 var der ingen sammenhæng mellem patientens alder eller den samlede kvalitet af differentiering og TLR4 eller MyD88 ekspression. Kollektivt blev TLR4 + /MyD88- fænotype forbundet med alle typer af væv, herunder ikke-dysplastiske epitel, mens TLR4 + /MyD88 + (co-ekspression) blev forbundet kun med æggestokkene neoplasmer

A:. Omdrejningspunkt svag farvning i normal ovarie overflade epitel (40x); B: diffus moderat farvning i en godartet serøs cystadenoma (20x); C: diffus stærk farvning i et grænsetilfælde serøs tumor (10x); D:. Diffus stærk farvning i en (grad 2) serøs carcinom (40x)

A, negativ godartet mucinous cystadenoma, med positiv stromale inflammatoriske celler (20x). B, positiv borderline serøs tumor (20x). C, positiv lav kvalitet serøst carcinom (40x). D, positiv high-grade serøst carcinom (40x). E, negativ endometrioide carcinom (20x). F, positiv serøs karcinom (lang pil) med komponent i negativ klar celle karcinom (kort pil) (40x).

Retrospektiv analyse blev udført for at bestemme, om TLR4 /MyD88 udtryk påvirket patient overlevelse i denne større serier. Klinisk opfølgning data var tilgængelige for 39 patienter med maligne tumorer, 33 hvoraf var døde på tidspunktet for denne undersøgelse. Sager udelukket fra opfølgning omfattede ikke-serøse carcinomer (alle MyD88 negative), dem med tilbagevendende sygdom (n = 2), patienter, der døde af postoperative komplikationer eller ubeslægtede årsager (n = 2) og patienter tabte til opfølgning (yderligere behandling og opfølgning på en anden institution). Udvalgte sager blev klassificeret i 2 grupper baseret på MyD88 proteinekspression: Gruppe 0 (MyD88 negativ); Gruppe 1 (MyD88 positiv). Alle tilfælde var grad og scene-matchede (grad 3, FIGO III /IV), blev optimalt debulked og patienter havde fået adjuverende platinbaseret kemoterapi med (n = 28) eller uden (n = 11) paclitaxel. Som illustreret i figur 4 5, TLR4 og MyD88 udtryk blev begge forbundet med betydeligt kortere progressionsfri overlevelse (PFS), og MyD88 udtryk var forbundet med reduceret samlet overlevelse (p 0,05). Den gennemsnitlige tid til tilbagefald for patienter med tumorer, der udtrykte TLR4 var 12 måneder (n = 20), mens TLR4 negative tumorer gentaget i en median tid på 27 måneder (n = 19); p = 0,016. Ligeledes mediane tid til tilbagefald for MyD88 positive tumorer var 13 måneder (n = 21) sammenlignet med 31 måneder, hvis MyD88 negative (n = 18); p = 0,02. Forskellen i OS mellem TLR4 positiv (n = 19) og TLR4 negative tumorer (n = 14) var ikke statistisk signifikant (p = 0,312). Den gennemsnitlige OS tid for patienter med MyD88 positiv EOC var 28 måneder (n = 21), mens patienter med MyD88 negative tumorer (n = 12) havde signifikant længere samlet overlevelse (47 måneder, p = 0,029). MyD88 positive maligniteter derfor var forbundet med reduceret patient overlevelse og sygdomsfrie intervaller

TLR4 (A) eller MyD88 (B) negative sager havde signifikant bedre PFS (15 18 måneder længere; p 0,05)..

Overlevelse var længere i MyD88 (B) negative sager (ved 19 måneder; p 0,05). Forskellen i overlevelse i forbindelse med TLR4 (A) er ikke signifikant (p 0,5).

MicroRNA Expression i Test-serien

EOC prøver fra den oprindelige test-serien blev inddelt i to grupper baseret på tidligere immunhistokemiske resultater (MyD88 positive, n = 11; MyD88 negativ, n = 9). Som vist i figur 6, blev den gennemsnitlige ekspression af MIR-21 og MIR-146a i MyD88 negative cancere forøget i forhold til gennemsnittet af MyD88 positive (p 0,001).

Scatter plots viser relativ microRNA ekspression med standardafvigelse (fold ændringer beregnet via 2

-ΔΔCt metode). 20 EOC tilfælde (serøse carcinomer) grupperet som MyD88 + eller MyD88- baseret på proteinekspression; data vist i forhold til hver gruppe. Gennemsnitlig udtryk for miR-21 miR-146a steg i MyD88 negativ EOC (p 0,05).

Gene og microRNA ekspression i Validering Series

Udvalgte ondartet patient tumor prøver blev opdelt i to grupper baseret på tidligere IHC resultater (MyD88 positivt, n = 10; MyD88 negativ, n = 12). Ekspression af miR-21 og miR-146a blev analyseret parallelt med TLR4 og MyD88 genekspression analyse. Figur 7 viser, at i lighed med testserien, ekspression af begge microRNAer var signifikant forøget i MyD88 negative cancere forhold til MyD88 positive gruppe (MIR-21, p = 0,0046; MIR-146a, p = 0,0191), med mere biologisk heterogenitet observeret med mIR-146a niveauer. De tilknyttede niveauer af TLR4 MyD88 mRNA var statistisk uforandret mellem MyD88 positive og negative cancere (p = 0.8777 og 0.1348, henholdsvis). Derfor MIR-21 og MIR-146a forekommer at være omvendt forbundet med MyD88 i ovariecancer. Fraværet af MyD88 mRNA ændring i MyD88 negative gruppe tyder på, at både miR-21 og miR-146a er rettet mod MyD88 på post-transkriptionel niveau.

Scatter plots viser relativ gen og microRNA udtryk med standardafvigelse (fold ændringer beregnet via 2

-ΔΔCt metode). 22 EOC tilfælde (serøse carcinomer) grupperet som MyD88 + eller MyD88- baseret på proteinekspression; data vist i forhold til hver gruppe. A B, TLR4 MyD88 mRNA statistisk uændret mellem MyD88 positive MyD88 negative grupper (p 0,05); C D, niveauer af både miR-21 miR-146a opreguleret i MyD88 negativ EOC (p 0,05).

TLR4 og MyD88 udtryk i en kohorte af respondere og non-respondere

MyD88 mRNA blev opreguleret 4,9 gange i en kohorte af ikke-respondenter sammenlignet med respondenter (p 0,05). Tilsvarende blev TLR4 mRNA opreguleret 3.4 fold i denne kohorte (p 0,05). Alle patienter analyseret her havde avanceret serøse papillære adenokarcinomer og modtaget carboplatin og paclitaxel som første linje kemoterapi efter optimal debulking kirurgi.

Gene og miRNA udtryk i cellelinjer

Der blev observeret Væsentlige ændringer i TLR4 mRNA-ekspression mellem chemosensitive og kemoresistent celler, selv om graden af ​​ændring var variabel (figur 8A). A2780cis celler viste en 24,1 ganges forøgelse i TLR4 forhold til A2780. I modsætning var der en 18,8 gange formindskelse i TLR4 i kemoresistent IGROV-1CDDP celler i forhold til IGROV-1. KB-8-5-11 celler viste den mindste ændring fra deres forælder linje med kun en 1,6 gange stigning i TLR4.

Data er udtrykt som gange ændring i ekspression i forhold til A2780 cancerceller (med standardafvigelse) .

Øget MyD88 mRNA ekspression blev observeret i alle kemoterapi kræft cellelinjer; disse ændringer var lille, men statistisk signifikant (figur 8B). Der var en 2,6 gange stigning i MyD88 i A2780cis celler sammenlignet med MyD88-negative A2780 celler. IGROV-1CDDP celler viste en 1,6 gange stigning i MyD88 forhold til chemosensitive IGROV-1-celler. Svarende til TLR4 data, at ændringen i MyD88 ekspression i KB-8-5-11 cellerne fra chemosensitive KB-3-1 forældrelinje var den mindste med kun en 1,4 gange stigning i MyD88. Salg

variable ændringer i niveauerne af mIR-21 blev observeret mellem chemosensitive og kemoterapi celler (figur 9a). A2780cis celler viste en 1,5 gange formindskelse i MIR-21 sammenlignet med A2780, men denne ændring ikke var statistisk signifikant (p = 0,5958). En 2 gange stigning i MIR-21 blev påvist i kemoresistent IGROV-1CDDP celler i forhold til IGROV-1. KB-8-5-11 celler viste en 2,9 gange formindskelse i MIR-21 sammenlignet med deres forælder (chemosensitive) linje.

Data er udtrykt som gange ændring i ekspression i forhold til A2780 cancerceller (med standardafvigelse ).

Svarende til miR-21, ændringer i miR-146a niveauer mellem chemosensitive og kemoterapi kræftceller var variabel (Figur 9B). Der var en 6,5 gange stigning i MIR-146a i A2780cis celler sammenlignet med MyD88-negative A2780 celler. IGROV-1CDDP celler viste en 1,2 gange stigning i MyD88 forhold til chemosensitive IGROV-1-celler, men denne ændring ikke var statistisk signifikant (p = 0,4557). En 2,5 gange reduktion i miR-146a blev fundet i KB-8-5-11 celler i forhold til deres chemosensitive (KB-3-1) forælder linje.

Reduceret TLR4 ekspression resulterer i øget kemosensitivitet af ovariecancerceller

for at funktionelt evaluere rolle TLR4 /MyD88 vej på kemosensitivitet af ovariecancerceller den kemoterapi kræft i æggestokkene cellelinje SKOV-3 blev transficeret med siRNA specifikt rettet MyD88 eller TLR4. Efter 72 timer MyD88 var signifikant nedsat ved både mRNA (figur 10A) og protein (figur 10B) niveau i cellerne transficeret med siMyD88. Men tabet af MyD88 ekspression havde ingen virkning på den kemosensitivitet af cellerne (Figur 10c). Signifikante reduktioner i ekspressionen af ​​TLR4 på mRNA (figur 10A) og protein (figur 10B) niveau blev også observeret i celler 72 timer efter transfektion. Men det lavere TLR4 udtryk væsentligt påvirket svaret fra SKOV-3 mod paclitaxel (figur 10C). Der var et fald 27,1% i cellelevedygtighed i siTLR4 transficerede paclitaxel-behandlede celler sammenlignet med utransficerede paclitaxel-behandlede celler og en 19,6% nedgang i forhold til siNeg transficerede celler. Således lyddæmpning af TLR4 genereret en mere chemosensitive fænotype i SKOV-3 æggestokkene cancerceller.

SKOV-3 celler blev efterladt utransficerede (Unt), transficeret med negativ kontrol siRNA (siNeg), MyD88 målrettet siRNA ( siMyD88) eller TLR4 målretning siRNA (siTLR4). De transficerede celler blev inkuberet i 72 timer før enten høst for mRNA-analyse (A), til proteinanalyse (B) eller behandling med paclitaxel (C). (A) MyD88 og TLR4 mRNA ekspressionsniveauer blev evalueret ved TaqMan RT-PCR. MyD88 og TLR4 mRNA-ekspression blev normaliseret med den for en endogen kontrol, B2M, og kalibreret til den for ubehandlede celler for at etablere den relative procentdel af mRNA-ekspression (n = 3, betyder + SD). (B) MyD88 og TLR4 mRNA ekspressionsniveauer blev evalueret ved Western blot analyse. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (C) transficerede celler blev enten efterladt ubehandlede, behandlet med DMSO (vehikelkontrol) eller 3,5 nM paclitaxel (IC25). 48 timer efter behandlingen, cellelevedygtigheden blev vurderet ved hjælp af CCK-8 assay. % Cellelevedygtighed blev beregnet ved at sammenligne absorbansværdier for vehikelkontrollen til de tilsvarende paclitaxel-behandlede prøver. Resultater er udtrykt som middelværdi + SD, n = 3; * P 0,05, ** p 0,01 (u-parret t-test)

Embryonale carcinomceller viser reduceret MyD88 udtryk efter differentiering

Data fra en storstilet. microarray eksperiment (M Gallagher, upublicerede data), der involverer embryonale carcinoma cancer stamceller (NTera2 og 2102Ep) blev afhørt for differentiel TLR4-signalering genekspression, som viste, at MyD88 udtryk var høj i udifferentierede NTera2 celler og faldt hurtigt på differentiering i retinsyre ( RA). For at validere microarray data, udifferentieret og differentieret NTera2 og 2102Ep prøver blev vurderet for MyD88 genet og proteinekspression. Som TLR4 blev antaget at regulere MyD88 i disse celler, blev ekspressionen af ​​TLR4 også vurderet trods konstitutiv ekspression i array studier. Nedregulering af MyD88 ved differentiering af pluripotente NTera2 celler blev bekræftet på tværs af flere tidsforløb (Figur 11A). TLR4 blev konstitutivt udtrykt, validering array-data. I modsætning hertil ekspressionen af ​​TLR4 og MyD88 var uændret i nullipotent 2102Ep celler behandlet med RA (figur 11A). Disse ændringer blev afspejlet på proteinniveau (figur 11B, C). MyD88 proteinekspression blev væsentligt reduceret efter differentiering af NTera2 celler (MyD88-), mens der ikke blev observeret nogen signifikant ændring i TLR4 farvning (figur 11B). I kontrast 2102Ep celler, både udifferentierede og behandlet med retinsyre, var TLR4 +, MyD88 + (Figur 11C). Med hensyn til tilknyttede microRNA ændringer, har vores gruppe tidligere vist, at mens miR-21 er uændret i begge cellelinje som respons på RA, miR-146a er opreguleret under differentiering af NTera2 celler, men uændret 2102Ep celler [29]. Dette tyder på, at, svarende til EOC, er miR-146a omvendt knyttet til MyD88 i differentierede embryonale carcinom cancer stamceller

A, qPCR data:. MyD88 udtryk nedreguleret på NTera2 differentiering, med minimale ændringer i TLR4 ; i modsætning 2102Ep celler undgå differentiering og opretholder både TLR4 MyD88 udtryk (fold ændringer vist er proportionale med den interne kontrol gen GAPDH og beregnet via 2

-ΔΔCt metode). B, TLR4 og MyD88 proteinekspression i NTera2 celler: TLR4 farvning var uændret efter differentiering (venstre panel); MyD88 farvning i udifferentierede NTera2 celler viste signifikant reduceret farvning efter differentiering (højre panel) (alle 40x). C, TLR4 og MyD88 udtryk i 2102Ep celler: minimale ændringer i TLR4 (venstre panel) eller MyD88 (højre panel) blev observeret efter RA-behandling (alle på 40x)

Diskussion

karakteriseringen her for TLR4 og MyD88 ekspression i epitelial ovariecancer neoplasi har vist, at mens TLR4 ekspression af en vis grad er allestedsnærværende på alle typer ovarieepitelet, herunder ikke-dysplastiske epitel, er MyD88 kun udtrykkes i neoplastisk væv. En sådan begrænsning af MyD88 til neoplastisk ovarievæv bestyrker lignende resultater for nylig rapporteret i litteraturen [24]. Men i denne undersøgelse, viste TLR4 /MyD88 co-ekspression en forkærlighed for serøse neoplasmer generelt, særligt grænsetilfælde og maligne serøse tumorer, og blev udtrykt i både høj- og lav kvalitet serøse carcinomer. I modsætning TLR4 i fravær af MyD88 var forbundet med ikke-malignt væv, ikke-serøse godartede og borderline tumorer, en undergruppe af serøse carcinomer og ikke-serøse carcinomer (MyD88 negativ EOC). Som TLR4 ekspression var til stede i alle typer af ovarieepitelet, fremgår det, at TLR4 signalering er knyttet til enten maligne serøse tumorer eller ikke-serøse tumorer proportionale til at være MyD88-afhængige eller -uafhængige.

Chen et al. [21] oprindeligt postuleret, at forholdet mellem MyD88 positive og negative EOC celler kan bestemme tumor karakteristika med hensyn til progression, kemoresistens og fornyet. Dette er helt i tråd med vores resultater illustrerer fordelingen af ​​MyD88 udtryk i æggestokkene neoplasi og foreninger med patienten survivial. MyD88 positive kræftformer analyseret i denne undersøgelse gentog sig 18 måneder tidligere end MyD88 negative kræftformer, med en tilsvarende reduktion i den samlede overlevelse på 19 måneder (p 0,05). Resultaterne af denne analyse er i nøjagtig konkordans med nylige rapporter angiver reduktioner i sygdomsfrie intervaller og patientoverlevelse med MyD88 positive kræftformer, der spænder fra 11-35 måneders reduktioner i progressionsfri overlevelse [20], [24], [27] , [28], og 26-36 reduktioner måned i samlet overlevelse [24], [27]. Den meget store forskel i overlevelse, der blev observeret i testen serien i forhold til MyD88 udtryk er sandsynligvis på grund af den lille prøvestørrelse i denne kohorte, som det er markant uharmonisk med alle tidligere undersøgelser og validering serien undersøgt her.

endvidere observeret i MyD88 ekspression i embryonal carcinom (EC) cancerstamceller ændringer, en af ​​de bedst karakteriserede CSC modeller i brug i dag [30] – [32], også tyder på, at MyD88 positive cancerceller er mere biologisk aggressive end MyD88 negativ celler. Udifferentierede stamcellelignende populationer fra maligniteter er ofte tilstrækkeligt til effektivt regenerere tumorer. NTera2 EC celler differentierer

in vivo

at danne teratocarcinomer, tre kim lag tumorer, der kan opstå i æggestokkene [33]. NTera2 celler er højt tumorigen i udifferentierede tilstand, en ejendom, der er stærkt reduceret eller elimineret ved differentiering [32], [33]. I modsætning hertil kan 2102Ep EC celler undgå differentiering

in vivo

at generere meget aggressive rene embryonale carcinomer [31]. Vi har vist, at mens TLR4 udtrykkes konstitutivt i EC-celler, er tab af MyD88 ekspression forbundet med en differentiering switch «: overgang NTera2 EC-celler fra deres yderst tumorogene (udifferentierede) til ugunstigt tumorogene (differentierede) tilstande. Denne ændring i udtryk ved differentiering er subtil, men meget reproducerbar, og viser, at

ex vivo

manipulation af æggestokkene CSC differentiering kan mindske MyD88 udtryk. Vi mener, at det understøtter den hypotese, at EOC MyD88 positive celler kan være stilk-lignende på grund af deres MyD88 udtryk mønster [12], [21] og også demonstrerer en praktisk og let manipuleres kræft stamceller model med relevans for kræft i æggestokkene.

det er for nylig blevet rapporteret, at miR-21 regulerer TLR4 ved at målrette tumor suppressor protein PDCD4 [19], mens miR-146a er NF-KB-afhængige [34] og mål og reducerer ekspressionen af ​​IRAK-1, IRAK -2 og TRAF-6, som er centrale MyD88 pathway komponenter [18], [35]. I sidste ende miR-21 og miR-146a deltage gensidigt i reguleringen af ​​TLR4 /MyD88 udtryk, der tjener som negative regulatorer af MyD88-afhængige TLR4 signalering. Romanen analyse af miR-21 og miR-146a udtryk i denne undersøgelse, baseret på kategoriseringen af ​​EOC i MyD88 positiv og MyD88 negativ, viser, at ekspression af begge MyD88 og disse microRNA’er er knyttet til kræft i æggestokkene. Subtile men væsentlige ændringer i MyD88 mRNA-ekspression blev observeret mellem chemosensitive og kemoterapi æggestokkene og livmoderhalskræft celler.