PLoS ONE: Kemisk inducerede Kræft ikke stammer fra knoglemarv-Afledt Cells

Abstrakt

Baggrund

identifikation og karakterisering af cancer stamceller (CSCS) er bydende nødvendigt at forstå mekanismen af kræft patogenese. Voksende tyder på, at CSCS spiller kritiske roller i udviklingen og progressionen af ​​cancer. Men eksisterer uenighed om, hvorvidt CSCS opstår fra knoglemarv-afledte celler (BMDCs).

Metode og vigtigste resultater

I den foreliggende undersøgelse, n-nitrosodiethylamin (DEN) blev anvendt til at fremkalde tumor dannelse i hunmus, der modtog knoglemarv fra hanmus. Tumordannelse blev induceret i 20/26 mus, herunder 12 levertumorer, 6 lungetumorer, 1 blære tumor og 1 nasopharyngeal tumor. Gennem sammenligning af fluorescens

in situ

hybridisering (FISH) resulterer i tilsvarende områder fra serielle tumor snit farvet med H Accepteret: 16. december 2011; Udgivet: januar 24, 2012 |

Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (Y2100464) og National Key Sci-Tech Special Project Infektionsmedicinsk (2012ZX10002-013). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

en voksende mængde litteratur tyder på, at tumorer stammer fra en lille del af celler, kaldet kræft stamceller (CSCS) eller tumor initiering celler (tics), fordi disse celler bære stamcelle-lignende funktioner såsom self -renewal og differentiering [1]. Til dato har CSCS blevet påvist at eksistere i cancere i det hæmatopoietiske system [2], bryst [3], hjerne [4], prostata [5], gastrisk [6], lunge [7], colon [8], og liver [9]. Men lidt er kendt om oprindelsen af ​​CSCS. En mulig oprindelse CSCS er knoglemarven, som knoglemarvsceller afledte celler (BMDCs) ofte findes i tumorvæv og BMDCs har evnen til at differentiere til mange forskellige typer af celler, herunder mesenkyme celler, muskelceller og epitelceller, herunder leverceller . For nylig har vores viden om forholdet mellem BMDCs og cancer progression dramatisk forbedret. Et interessant aspekt er, at kræftceller aktivt rekrutterer BMDCs til deres egen mikromiljø. BMDCs i tumorer er ikke kun ansvarlige for inflammation, men også for tumorangiogenese [10]. CD45-positive BMDCs ofte findes i tumorvæv, hvor de udtrykker vaskulær endotelcellevækst factor receptor-1 (VEGFR-1) [11], en vigtig receptor af VEGF. Udover betændelse, disse CD45 + /VEGFR1 + -celler også bidrage til tumorangiogenese. Således viser tegn på, at BMDCs tilvejebringe en passende mikromiljø at lette cancermetastase [12].

Det er dog uklart, om kræftceller stammer fra BMDCs, og denne hypotese er ofte diskuteret. En nylig rapport fandt, at efter kronisk

Helicobacter

infektion, BMDCs akkumuleret i maveslimhinden og til sidst gav anledning til mavekræft [6]. Desuden supplerende undersøgelser antydet, at onkogene mutationer af væv stamceller eller yderligere differentierede celler kan skabe en pulje af selvfornyende celler, hvor disse mutationer akkumuleret og endelig resulteret i kræft [4], [5]. Ved knoglemarvstransplantation modeller blev det påvist, at BMDCs var usandsynligt at være oprindelsen af ​​leverkræft [13] og hudkræft [14]. For at teste om cancer stammer fra BMDCs, blev det kemiske karcinogen n-nitrosodiethylamin (DEN) anvendes til at inducere tumorudvikling i mus efter knoglemarvstransplantation. Knoglemarven af ​​kvindelige recipientmus blev udryddet ved bestråling og derefter rekonstitueres med knoglemarv fra normale hanmus. Y-kromosomet, blev anvendt som markør til karakterisering af oprindelsen af ​​de inducerede tumorceller. Tyve tumorer, herunder 12 levertumorer, 6 lunge tumorer, en blære tumor og en nasopharyngeal tumor, lykkedes induceret. Blandt disse tumorer blev klonal ekspansion af Y-positive (Y +) celler ikke observeret. Antallet af Y + -celler i tumorerne tæt korreleret med antallet af infiltrerende lymfocytter. Vi fandt også, at de fleste Y + celler udtrykte både CD45 og VEGFR-1. Vore data antydede, at i det mindste i vores dyremodel, BMDCs ikke oprindelsen af ​​cancer stamceller, selv om de er relateret til tumor inflammation og kan bidrage til dannelsen af ​​tumor neo-fartøjer.

Resultater

Påvisning af muse X- og Y-kromosomer ved FISH

i den knoglemarvstransplantation (BMT), knoglemarvsceller indsamlet fra 6 donor hanmus blev transplanteret ind i 60 modtagende hunmus. Som vist i figur 1, FISH-prober hybridiseret til begge metafase og interfase kromosomer og gav stærke og specifikke signaler. FISH signaler af Y-kromosomet blev kun fundet i celler fra donor hanmus knoglemarv (figur 1B).

(A) A metafase lymfocyt fra perifert blod fra en kvindelig modtager mus. (B) En metafase lymfocyt fra perifert blod fra en mandlig donor mus. (C) perifere blodlymfocytter fra en kvindelig modtager mus efter BMT. En kvindelig lymfocyt er angivet med en pil. (D) Bone marv celler fra en kvindelig modtager mus efter BMT. En kvindelig knoglemarv celle er angivet med en pil. Forstørrelse, × 100 (A og B) eller × 40 (C og D). Scale barer, 20 um.

knoglemarvstransplantation

Alle modtagende mus overlevede BMT. Det samlede niveau for indpodning var 82,5-94,5% som vurderet ved at beregne procentdelen af ​​Y-positive celler blandt både perifere lymfocytter (figur 1C) og knoglemarvsceller (Figur 1D). I alt 500 celler blev analyseret i hver prøve. Dette resultat indikerer, at BMT procedurer var en succes.

DEN-induceret Carcinogenese

I løbet af de 30 uger af kemisk induceret carcinogenese, 34 BMT mus døde. Komplette obduktioner blev udført på hver af disse mus, med det primære dødsårsag er omfattende lungebetændelse og leversvigt. Tumorer blev induceret i 20 af de 26 overlevende mus; disse tumorer omfattede 12 levertumorer, 6 lunge tumorer, en blære tumor og en nasopharyngeal tumor. Repræsentative billeder af lunge- og levertumorer er vist i figur 2A og 2B. Disse tumorer blev reseceret, indlejret i paraffin, snittet og histologisk karakteriseret ved anvendelse H B). Scale barer, 20 pm

(A) H . E farvning billede præsenterer de histopatologiske funktioner i lungekræft og det omgivende normale væv. Forstørrelse, × 20. (B) H NT, ikke-tumorvæv. Forstørrelse, × 40. Scale barer, 20 pm

(A) H . E farvning billede præsenterer de histopatologiske funktioner i NPC og det omkringliggende væv. Forstørrelse, × 20. (B NT, ikke-tumorvæv. Forstørrelse, × 40.

For at vurdere, om BMDCs kan fusionere med tumorceller, vi analyserede antallet af X og Y-signaler i BMDCs i tumorer og deres omgivende væv. Ingen fusion-afledt karyotype (XXY, XXXY) celler blev fundet i vores undersøgelse. Dette resultat er i overensstemmelse med mange andre fund [6], [11], [15], [16], og foreslår, at cellefusion er ikke det vigtigste bidrag BMDCs til malign patogenese.

Diskussion

Selv om kræft stamceller hypotese stadig debatteret, mange forskere mener, at kræft indeholder et lille antal cancer stamceller (CSCS). Disse CSCS er i stand til selv at forny, differentiere, og modstå kemoterapi og dermed fastholde kræft vækst. Til dato, oprindelsen af ​​CSCS stadig et mysterium. er blevet foreslået Mindst tre mulige oprindelse af CSCS, herunder 1) vævsspecifikke stamceller [17]; 2) BMDCs [6], [15]; og 3) fusion celler afledt af BMDCs og vævsspecifikke stamfader eller stamceller [18] – [20]. I denne undersøgelse anvendte vi en knoglemarvstransplantation dyremodel til at undersøge oprindelsen af ​​CSCS i kemisk inducerede (DEN) tumorer. DEN er kræftfremkaldende, der kan inducere tumorer i forskellige organer, herunder lever og hud og i mave, respiratoriske og hæmatopoietiske systemer i mus. Når metaboliseres, DEN i omdannet til en elektrofil ethyldiazonium ion, der kan reagere med DNA-baser og danne addukter og dermed kan forårsage DNA-mutationer og strengbrud der i sidste ende bidrager til patogenese [21]. I vores model anvendte vi en høj dosis af DEN (60 ppm) i drikkevandet i 12 uger til at øge frekvensen og afkorter tumordannelse. Under anvendelse af denne strategi blev tumorer med held induceret i leveren, lunge, blære og næsesvælget.

BMDCs har evnen til at differentiere til epitelceller under vævsheling i mange organer, herunder lever [22], [23] , lunger, hud, øjne, mave-tarmkanalen og nyrerne [24]. Men om og hvordan BMDCs udgør vævsreparation debatteres stadig. Selv om antallet af BMDCs var variabel, de fleste publikationer viser, at BMDCs blev rekrutteret til skader væv sites [25] – [28], mens anden publikation rapport, BMDCs ikke blev påvist i de anvendte modeller [29], [30]. I murine leveren og pancreas-tumormodeller, de mere avancerede tumorer havde en højere tendens til at rekruttere BMDCs [31]. I vores model, fandt vi, at de procentsatser af BMDCs i både tumor og normale væv var meget lave ( 1%); blev imidlertid BMDCs fundet i væv, der omgiver tumoren. Dette område er infilitrated med inflammatoriske celler, hvilket antyder, at disse BMDCs blev associeret med inflammation. Dette resultat tyder på, at BMDCs var mindre tilbøjelige til at blive omdannet til maligne celler som ingen af ​​tumorer i vores model indeholdt grupperet Y + celler.

Nye fund viste, at BMDCs kan inkorporere i lever og tarme gennem cellefusion [18] – [20], hvilket øgede den mulighed, at BMDCs kan spille en rolle i regenerering og tumorigenese ved sammensmeltning med progenitor eller stamceller fra målorganet. Men mange rapporter hævder, at der ikke er nogen klar dokumentation for, at cellefusion forekommer mellem BMDCs og målorgan celler i deres modeller [6], [11], [15], [16]. I den foreliggende undersøgelse, bekræftede vi de manglende dokumentation for cellefusion både i tumorer og i omgivende normale væv ved FISH. Især selv om der blev fundet BMDCs inkorporeret i den intestinale adenom i APC-muterede multipel intestinal neoplasi mus, ingen af ​​adenomer ubikvitært bestod af BMDCs [20], hvilket tyder på, at den mekanisme, hvormed BMDCs bidrager til patogenese ikke var sandsynligvis cellefusion. Sammenfattende viste vores data, at selv BMDCs kan bidrage til tumor progression, den mulighed, at BMDCs er oprindelsen af ​​selve svulsten er ekstremt lav.

Materialer og metoder

knoglemarvstransplantation (BMT )

Seks til otte uger gamle mandlige og kvindelige C57BL /6J mus blev indkøbt fra Model Animal Research center i Nanjing Universitet (Nanjing, Kina). Forsøgene dyr blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer, og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Zhejiang University (Godkendelse ID: SYXK2004-0050). På BMT blev totalt knoglemarv isoleret fra lårben og skinneben af ​​donor hanmus, vasket, findelt ved anvendelse af en 20-gauge nål og gennem en 40-um nylonnet cellefilter (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ) for at fremstille en enkelt-cellesuspension i PBS ved en tæthed på 1,5 x 10

7 celler /ml. Modtageren female C57BL /6J-mus blev bestrålet med 900 rad fra en

60Co strålerøret, rekonstitueret med 3 × 10

6 donor marvceller via halevene injektion eller retroorbital prøvetagning af bedøvede mus 36 timer senere og anvendt til eksperimenter 4-5 uger efter indsamling. For at bekræfte succesfuld transplantation af donor knoglemarvsceller, modtager perifert blod og knoglemarv celler blev opnået 4 uger efter BMT og undersøgt for tilstedeværelsen af ​​Y-kromosomet med fluorescens

in situ

hybridisering (FISH).

kemisk induceret Carcinogenese med n-nitrosodiethylamin (DEN)

Ca. 4-5 uger efter BMT blev 60 recipientmus fodret DEN (60 ppm i drikkevand, Sigma, St. Louis, MO) i 12 uger for to sessioner med en 2-ugers adskillelse interval at indlede processen af ​​carcinogenese. De mus, der overlevede blev aflivet efter 30 uger.

Histologisk og Patologisk Study

Den-inducerede tumorer blev fjernet og fikseret i 4% formalin natten over. Efter dehydrering blev tumorvævet indlejret i paraffin. Tumorvævet i paraffin blev serielt i snit (5 um i tykkelse), og vælg objektglas blev rutinemæssigt farvet med hæmatoxylin-eosin (H . E farvning af det samme område i en successiv tumor sektion

Tak

Forfatterne vil gerne takke Dr. Mei Jin og Dr. Jing-Yao Xu for deres ekspertise i at gennemgå tumor sektioner.